全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2002 , 29 (3) : 255～257
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2001 - 11 - 26 ; 修回日期 : 2002 - 03 - 18
基金项目 : 荷兰 Wageningen 大学育种实验室项目3 本文为作者 1998 年 1 月～1999 年 10 月在荷兰 Wageningen 大学育种实验室作访问学者期间的部分工作 , 期间得到 Kuipers A GJ 、
De Jeu M J 和 Visser R G F 博士的悉心指导和实验室其他同仁的热情帮助 , 在此一并致谢。
荧光原位杂交检测野生六出花 ( Alstroemeria au2
rea) 染色体命运 3
周树军
(山东农业大学林学院 , 泰安 271018)
摘 　要 : 利用从野生六出花 ( Alstroemeria aurea) 中分离的一个种特异性串联重复序列 (A0012I) 作荧光
原位杂交的探针 , 检测野生六出花染色体在其一系列杂交后代中的命运。试验结果表明 , 除最长的一对染
色体外 , 该方法能够检测到在其一系列杂种后代中其余 7 对染色体是否存在。
关键词 : 六出花 ; 特异性重复序列 ; 荧光原位杂交
中图分类号 : S 68 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2002) 0320255203
将有价值的外源基因或染色体导入栽培植物 , 对改良作物栽培品种起到了很大的作用 , 如燕麦染
色体的片段导入小麦中大大提高了小麦的抗病性〔1〕。尽管利用现在基因工程的方法已克隆了一定数量
的基因并获得了转基因植物 , 但它不能取代传统的杂交育种方法 , 因为能够克隆的基因必须是单拷贝
的且基因产物是明确的 , 而很多农艺性状往往由多基因控制 , 且基因产物不清楚。传统育种方法需要
连续几代的回交 , 费力费时 , 存在着盲目性 , 因为在连续回交过程中会发生所需染色体丢失的现象。
近年来分子细胞遗传学利用分子探针能够检测外源染色体渗入栽培植物的过程 , 克服传统育种的盲目
性 , 提高育种的效率 , 加速育种的进程。
六出花 ( Alstroemeria) , 又名百合水仙 , 在荷兰是重要的切花。其野生种 (如 A . aurea 和 A .
psittacina ) 存在许多栽培品种中不具备的园艺学性状 (如抗病毒 , 瓶插寿命长 , 耐寒等特点) 。De
Jeu 等从野生六出花A . aurea 中分离了一组重复序列 , 其中 A0012I 含有 217 bp , 且为该种的特异性高
度重复序列〔2〕, Kamstra 等用荧光原位杂交鉴别了其每一对染色体〔3〕; Kuipers 等研究了A . psittacina 高
度重复序列的特征和物理定位〔4〕。De Jeu 等用 Southern 杂交表明四倍体栽培品种 Jubilae 不含A . aurea
的 A0012I 这一重复序列〔2〕。本研究利用 De Jeu 等从A . aurea 分离的 A0012I作为荧光原位杂交的探针 ,
旨在检测A . aurea 的染色体在其一系列杂交后代中的命运 , 希望为六出花的育种选材提供理论依据。
1 　材料与方法
1. 1 　材料
本研究所需原始植物材料的来源和编号列于表 1 , 其一系列杂种的关系和编号见图 1 , 这些杂种
是 Wageningen 农业大学育种实验室采用 De Jeu 等〔5〕描述的胚培养技术获得的 , 并由 De Jeu 提供 , 所
有植物材料均保存于该实验室。
1. 2 　荧光原位杂交 ( FISH)
染色体制片基本根据周树军等的方法〔6〕。待试管苗根长约 2 cm , 小心取出 , 用凉水洗掉凝胶 ,
放入 200μL/ L cyclohexamide 中 , 在室温条件下处理 8 h , 然后切下根尖放入 4 ℃的乙醇和乙酸 (3∶1)
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固定液中 , 12 h 后用常规压片法进行染色体制片。
探针标记用 Boehrings Mannbeim 公司生产的生物素 ( biotin2162dUTP) , 采用 PCR 法进行标记。
50μL 的反应混合物中含有插入的 A0012I 的 pUC19 质粒 200 ng、M13 上游和下游引物各 50 pmol、
Perkin Elmer 生产的 Taq 酶 1u、dNTP 各 200μmol·L - 1、biotin2162dUTP 10μmol·L - 1、1 倍的 Perkin Elmer
PCR 缓冲液。PCR 的反应程序为 : 第 1 个循环 95 ℃7 min、50 ℃1 min、72 ℃2 min , 接着进行 29 个
95 ℃1 min、50 ℃1 min、72 ℃1 min 重复循环 , 然后 72 ℃延长 10 min , 最后 4 ℃保存。
用 RNase A (100μg·mL - 1) 和 Pepsin (5μg·mL - 1) 对染色体分别预处理 60 min 和 10 min , 用 4 %
paraformaldehyde 固定 10 min , 用 70 %、90 %、100 %的乙醇各脱水 3 min 后在空气中干燥。杂交液中含
有 50 % deionized formamide、10 %dextran sulphate、2 ×SSC (即 0. 30 mol·L - 1 NaCl 和 0. 030 mol·L - 1 sodi2
um cirtate , pH 7. 0 ) 、0. 25 % SDS、1. 25 ～2. 5 ng·μL - 1 A00I、0. 06 ～0. 25μg·μL - 1 sonicated herrring
sperm DNA。杂交液在 70 ℃的条件下变性 10 min 后迅速埋入冰中至少 5 min , 将每张经预处理的染色
体片滴加 40μL 变性杂交液 , 然后将其在 80 ℃的条件下变性 5 min , 杂交反应在一个保湿盒中于 37 ℃
的恒温箱中进行 12 h。杂交松紧度约 80 % , 即 : 反应后的载玻片用 2 ×SSC 洗 15 min , 用 42 ℃的 0. 1
×SSC洗 30 min , 再用 2 ×SSC洗 15 min , 然后在 buffer 1 (0. 1 mol·L - 1 Tris2HCl 和 0. 15 mol·L - 1 NaCl ,
pH 7. 5 ) 中洗 5 min。
Biotin2162dUTP 分别用 4μg·mL - 1 streptavidin2Cy3 (Jackson Immuno Research Laboratories) 、10μg·mL - 1
biotinylated2antistreptavidin (Vector Laboratories) 、再用 4μg·mL - 1 strptavidin2Cy3 进行 3 次检测。每次每张
载玻片先用 200μL blocking buffer (buffer 1 中含有
1 % Boehringer Mannheim 生产的封阻剂 ) 保温
5 min , 再用 100μL 含以上相应抗体的 blocking
buffer 在 37 ℃的条件下保温 1 h , 最后用在 37 ℃的
水浴锅中用 buffer 1 洗 3 次 , 每次 5 min。用 1μg·
mL - 1 DAPI ( 4 , 62diamidino222phenylindole ) 复染 ,
用 5μL Vector Laboratories 生产的 Vectashied 封片 ,
用 Zeiss Axiophot 荧光显微镜镜检测 , 用 400 ASA
彩卷照相 , 将负片扫入计算机 , 用 CorelDraw 软件
获得最佳对比度的照片。
2 　结果与分析
结果见插页 4 图版和图 1。野生种A . aurea 和
栽培品种 Jubilee 杂交产生的杂种 92JA010 为三倍
体 , 且 7 条染色体有较强的簇状A0012I的 FISH信
号 (见插页 4 图版 , A) 。这一结果同前人报道的
结果一致 , 表明了 8 对染色体中有 7 对存在 A0012
I的 FISH信号 , 同时也表明四倍体的六出花品种
Jubilee 不含 A0012I 重复序列〔2 ,4〕。A . psittacina 与
92JA010 的杂交种 BCJA1 为四倍体 (2n = 4x = 32)
(见插页 4 图版 , B) 。结果表明 92JA010 产生了不
减数的雄配子 (n = 3x = 24) , 因此 BCJA1 的基因
组中亦含有 7 条显示 A0012I 信号的染色体 (见插
页 4 图版 ,B 和 C ;B 中的红色箭头与 C 中的红色
信号相对应) 。
表 1 　本研究所用的两个六出花野生种和一个栽培品种
Table 1 　Two species and a cultivar of Alstroemeria
used in the present study
种和品种
Species and
Cultivar
来源
Origin
染色体数目
Chromosome
numbers
编号
Code
A . aurea 智利　Chile 2n = 2x = 16 A001
A . psittacina 巴西　Brazil 2n = 2x = 16 93Z390. 4
Jubilae 栽培种　Cultivar 2n = 4x = 32 CV118
图 1 　与野生六出花相关的杂种来源示意图
带星号的斜体数字表明有 A0012I 荧光原位杂交信号的
A . aurea 染色体数.
Fig. 1 　A series of hybrids related with A. aurea
3x or 4x in the brackets show the results of the polyploidy of the
hybrids and the italic numbers marked with asterisks represent the
umber of A . aurea chomosome (s) which had FISH sigal (s) of A0012I.
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　　 A . psittacina 和 BCJA1 的回交后代为三倍体 (2n = 3x = 24) , 其基因组中只有一条染色体A0012I的
信号 (见插页 4 图版 , D) ; BCJA1 和A . psittacina 的杂交后代虽然亦为三倍体 , 但有四条染色体上具
有 A0012I的信号。一般情况下 , 三倍体极少产生可育的配子 , 如果产生可育配子 , 它们一般为二倍
体。试验结果表明三倍体的 BCJA1 无论是作父本还是母本产生的可育的配子都是二倍体 , 但它们的
染色体组成是不同的 , 雄配子中只有 1 条染色体 A0012I 的信号 , 雌配子有 4 条染色体上具有 A0012I
的信号 , 它们都清楚地反映在其后代的个体中 (图 1 和插页 4 图版 D、E和 F) 。因此 A0012I能够作为
A . aurea 的一个分子标记用于检测其染色体在一系列杂交后代中的命运。当然仅用 A0012I 作分子标记
存在一定的局限性 , 因为 A . aurea 的一号染色体上没有 A0012I 的信号〔4〕。我们试图用基因组原位杂
交 ( GISH) 的方法来检测A . aurea 一号染色体在其一系列杂种中的命运 , 但 GISH 的结果与 FISH 的结
果几乎相同 , 因此难以将A . aurea 一号染色体与最长的 Jubilae 和A . psittacina 的染色体区分开来。
Kuipers 等利用 GISH区分了A . aurea 和 A . inodora 的基因组〔7〕, 本试验仍未得到理想 GISH 结果的原因
有待进一步探讨。
根据试验结果和以上分析 , 我们认为 A0012I可以作为A . aurea 的分子标记用于六出花的杂交育种
中检测 A . aurea 染色体的命运。这既有助于克服该杂交育种工作的盲目性 , 又将会有助于判断一些性
状和其相关的基因连锁群。当然由于只用 A0012I 作分子标记不能一一区分A . aurea 的每一条染色体 ,
因此如同其他探针结合使用会得到更好的结果。
参考文献 :
1 　Jiang J , Friebe B , Gill B S. Recent advances in alien gene transfer in wheat . Euphytica , 1994 , 73 : 199～212
2 　De Jeu M J , Lasschuit J , Kuipers A GJ , et al . Characterisation and localisation of repetitive DNA sequences in the ornamental Alstroemeria aurea
Graham. Theor. Appl . Genet . , 1997 , 94 : 982～990
3 　Kuipers A GJ , Kamstra S A , De Jeu MJ , et al . Molecular characterisation and physical localisation of highly repetitive DNA sequences from Brazilian
Alstroemeria species. 1999 , Submitted.
4 　Kamstra S A , Kuipers A GJ , De Jeu M J , et al . Physical localisation of repetitive DNA sequences in Alstroemeria : karyotyping of two species with
species2specific and ribosomal DNA. Genome , 1997 , 40 : 652～658
5 　De Jeu M J , Jacobsen E. Early postfertilization ovule culture in Alstroemeria L. and barriers to inerspecific hybridization. Euphytica , 1995 , 86 : 15～23
6 　周树军 , 汪劲武. 10 种菊属植物的细胞学研究. 武汉植物学研究 , 1997 , 15 (4) : 289～292
7 　Kuipers GJ , van Os D P M , de Jong J H , et al . Molecular cytogenetics of Alstroemeria : identification of parental genomes in interspecific hybrids and
characterization of repetitive DNA families in constitutive heterochromatin. Chromosome Res. , 1997 , 5 : 31～39
Detection of Alstroemeria aurea Chromosomes in a Series of Its Hybrids
Zhou Shujun
( College of Forestry , Shandong Agricultural University , Tai’an 271018 , China)
Abstract : A0012I , a species2specific repetitive sequences isolated from Alstroemeria aurea , was used in fluo2
rescence in situ hybridization to detect the fate of A . aurea chromosomes in a series of its hybrids in this study. We
could clearly detect the change of the number of A . aurea chromosomes in its related hybrids except for Chromosome
1 , the longest chromosome of A . aurea . This could be helpful to select materials in further Alstroemeria breeding.
Key words : Alstroemeria aurea ; Species2specific sequence ; Fluorescence in situ hybridization
7523 期 　　　　　　　周树军等 : 荧光原位杂交检测野生六出花 ( Alstroemeria aurea) 染色体命运 　　　　　　　　　
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