全 文 ：园 艺 学 报 2001, 28 ( 6) : 497~ 503
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2001- 04- 03; 修回日期: 2001- 05- 25
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (39870517)
* 试验在日本筑波大学农林学系果树研究室完成。
梨果实发育中 Ca2+ 在果肉细胞的定位及变化
研究*
彭抒昂1 岩堀修一2
( 1华中农业大学园艺系 , 武汉430070; 2 筑波大学农林学系, 日本筑波305)
摘 要: 用焦锑酸钾沉淀的细胞化学方法, 研究了 幸水 梨果实发育中果肉细胞的焦
锑酸 Ca2+ 定位变化及其与细胞超微结构的关系。结果表明: ( 1) 在未受精之前, 果肉细胞内
未检测到 Ca2+ 沉淀颗粒, 细胞核内的染色质少且染色淡, 细胞质的细胞器数量也少; ( 2) 受
精后果肉细胞呈现大量的 Ca2+ 沉淀颗粒, 主要分布在细胞核、细胞质、质体以及叶绿体外膜
上, 含 Ca2+ 沉淀颗粒的质体非常膨大, 导管和初期发育的石细胞内也密集分布 Ca2+ 沉淀颗
粒; ( 3) 受精 1周后果肉细胞的 Ca2+ 移向细胞之间的连接处; ( 4) 生理落果的细胞和导管中
Ca2+ 没有或极少, 但有的细胞内沿液泡膜有 Ca2+ 分布; ( 5) 受精 3~ 4 周后, 果肉细胞中很难
检测到 Ca2+ 沉淀颗粒, 此状态一直持续到果实采收, 但果实腐烂前 Ca2+ 沉淀颗粒沿果肉细胞
壁两侧出现。就 Ca2+ 在果实发育中的作用及与细胞超微结构的关系等进行了讨论。
关键词: 梨; 果实发育; Ca2+ 定位
中图分类号: S 661. 2 ; Q 945 文献标识码: A 文章编号: 0513353X ( 2001) 06049707
现已清楚, 果实中钙的含量不仅关系到果实质地, 影响果实的软化和腐烂, 而且还与
一些严重的生理病害有直接关系, 足够的钙含量可使细胞壁和膜系统稳定, 延迟果实的衰
老!1, 2∀。近年来虽有许多关于果实钙的吸收规律及人工补钙效果的报道!3~ 5∀, 但极少有对
果实发育中 Ca2+ 的细胞学动态, 特别是果实发育不同时期 Ca2+ 在细胞中的定位分布及其
与细胞超微结构的关系的研究。有许多研究采用焦锑酸钾沉淀法来定位植物细胞中的
Ca2+ , 并通过 Ca2+ 所分布的细胞超微结构的功能来了解其作用!6~ 9∀, 但甚少应用于果实
发育的研究。因此, 本研究中用电子显微镜的细胞化学方法, 对梨果实发育过程中果肉细
胞的 Ca2+ 定位动态进行了观察, 以期进一步阐明 Ca2+ 在果实中的代谢规律和生理作用。
1 材料与方法
1. 1 材料及采样处理
试验于1999年进行, 试材为日本筑波大学附属农林技术中心果园栽植的成年 幸水
梨 ( Pyrus pyrif olia Nakai cv. Kosui) , 从 4月 20日盛花期开始采样, 幼果期 5~ 7 d采样 1
次, 6月以后约 10 d采样 1次, 直至 8月 23日采收。采收的果实于室温下存放, 10 d取
样1次, 直至腐烂。将采样后的果实分为果皮侧和果心侧的果肉部分。
1. 2 Ca2+的细胞化学制样
参照文献!8, 10∀的方法, 将果肉细切成 2~ 3 mm3的小块, 用加有 2%焦锑酸钾的2. 5 %
戊二醛+ 2%多聚甲醛固定液 (用0. 2 mol/ L 的K2HPO4 缓冲液溶解, pH 7. 6 ) 进行 6 h 的
前固定, 开始固定时抽真空使果肉组织中的气泡排出。然后用加有 2%焦锑酸钾的同样缓
冲液洗3次, 每次 15min以除去固定液, 接着用含 2%焦锑酸钾、同时用 K2HPO4缓冲液溶
解的 1%锇酸固定液进行 3~ 4 h的后固定, 同时再用上述的缓冲液洗涤 3次后, 进行丙酮
系列脱水, 然后用Spurr 低粘性树脂包埋, 用超薄切片机切成40~ 60 nm的切片, 经2%醋
酸铀和柠檬酸铅二重染色后, 置于透射 电子显微镜下观察并照像。为证明以上用加有焦
锑酸钾固定液制样的试料在电镜下所呈现的黑色颗粒是否为 Ca2+ , 将一部分载有切片的
铜网置于 60 # 、0. 2 mol/L 的 EGTA ( pH 7. 9 ) 液中处理 1 h, 染色后再置于电镜下观察。
2 结果与分析
2. 1 受精前
尚未受精的果肉细胞排列紧密, 大多液泡较小。细胞核内染色质少且染色淡, 细胞质
内虽然有些细胞的叶绿体已充分发育, 但其周围的细胞器很少。此时无论是细胞的什么部
位都未检测到 Ca2+ 沉淀颗粒的存在 (图版 1, A、B)。果肉的导管内也未检测到 Ca2+ 沉淀
颗粒 (图版1, C)。
2. 2 受精后
受精的幼果在最初几天, 果肉细胞内可检测出大量的 Ca2+ 沉淀颗粒, 而且细胞器的
数目明显增加。细胞核内的 Ca2+ 沉淀颗粒主要密集分布在核液部分, 核仁部分没有或极
少 (图版 1, D、G、H) , 细胞质的质液部分也很多 (图版 1, E、H、I) , 叶绿体内极少而
沿外膜却有密集分布, 线粒体内有少量 (图版 1, E) ; 质体在这期间体积变化很大, 有些
细胞的质体异常肥大, 里面布满了 Ca2+ 沉淀颗粒 (图版 1, G) , 而此时细胞核内的 Ca2+
沉淀颗粒密度较小 (图版 1, G) ; 当其体积恢复正常时, 常围绕在细胞核周围分布, 细胞
核内 Ca2+ 沉淀颗粒的密度较大 (图版 1, D、H) ; 果肉细胞的内质网和高尔基体很少。
石细胞在受精后的幼果时期开始发育, 到形成坚硬的石细胞群需要约 2个月, 但石细
胞只是在开始发育时能检测到细胞内布满了 Ca2+ 沉淀颗粒 (图版 1, I) , 此后虽然一直存
在细胞质 (活细胞) , 但却没有 Ca2+ 沉淀颗粒出现。导管在幼果受精后较长一段时期内
(约 4周) 都能检测到 Ca2+ 沉淀颗粒 (图版 1, F) , 但以开始的 1~ 2周内最多, 此后迅速
减少或难以检测到。
幼果受精 5~ 7 d后, 除维管束周边的少数细胞外, 大多果肉细胞中的细胞核和细胞
质已难以检测到 Ca2+ 沉淀颗粒的存在, 果肉细胞内的细胞器数目也逐渐减少。而在细胞
间隙和连接处发现了密集或堆积分布的 Ca2+ 沉淀颗粒 (图版 2, A~ C) , 放大后观察, 可
见Ca2+ 颗粒着生在连接细胞间的丝状物体上 (图版 2, B)。经 Ca2+ 的鳌合剂 EGTA处理,
可见应该分布这些颗粒的细胞间隙和连接处极少分布 (图版 2, D)。受精约 3~ 4 周后,
果肉细胞难以检测到 Ca2+ 沉淀颗粒。
2. 3 生理落果
生理落果指已膨大的幼果转黄脱落。在幼果转黄时, 果肉细胞的连接处已较少有
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Ca2+ 沉淀颗粒的分布, 特别是果肉导管内没有沉淀颗粒存在 (图版 2, E)。幼果黄化严重
时, 有的果肉细胞内可检测到 Ca2+ 沉淀颗粒, 沿液泡膜分布 (图版 2, F)。
2. 4 果实发育和衰老
幼果自受精膨大时起, 果肉细胞的液泡部分逐渐加大, 细胞质被挤向细胞壁边缘, 且
细胞器数量很少。幼果发育 4周后, 无论是果肉细胞还是导管组织, 都难以检测到 Ca2+
沉淀颗粒的存在。而石细胞逐渐发育, 细胞壁增厚且聚集成团, 使得幼果发育在较长的时
期内果实体积增加较慢。果实发育 2个月, 即 6月中下旬开始在细胞内积累淀粉, 至 7月
中旬达到高峰 (图版 2, G)。7月下旬淀粉粒开始逐渐变小, 至 8月份消失。整个过程都
难以在果肉细胞和导管组织检测到 Ca2+ 沉淀颗粒。8月 23日采收果实并置室温下贮藏,
10 d后有的果实开始由果心部变坏。取样观察可知, 最初的征兆是这一部分的有些细胞沿
细胞壁两侧有多量的 Ca2+ 沉淀颗粒分布 (图版 2, H) , 而经 EGTA处理, 类似的这些颗粒
几乎全部消失 (图版 2, I) ; 进一步发展, 细胞壁两侧不再是 Ca2+ 沉淀颗粒, 而是细胞分
解形成的大块黑斑。
3 讨论
3. 1 Ca2+定位分布与功能
从本研究结果可看出, 梨果实发育, 特别是幼果发育的不同时期, Ca2+ 在果肉细胞结
构中的定位分布是不同的, 这样就可以通过这些细胞结构的功能来考察 Ca2+ 所起的作用。
在受精初期, Ca2+ 通过导管进入果实, 主要分布在细胞核、细胞质液、质体、线粒体
等部位中。从这些细胞结构本身的功能来看, 质体是贮藏淀粉等营养物质的库源场
所!8, 11∀, 而在幼果受精初期它的体积变化很大, 体积大时可检测出里面布满了 Ca2+ 沉淀
颗粒 (图版1, G) , 体积小时则里面少有沉淀颗粒分布 (图版 1, D、H) , 从而说明质体
在幼果发育初期可能也是 Ca2+ 的库源场所, 大量储存 Ca2+ 等营养时体积变大, 供应出去
时体积变小。这一现象在梨花芽分化过程中也同样存在!9∀。细胞核的功能主要是遗传信息
的复制、转录和传递, 核液中还存在着大量的与糖酵解、三羧酸循环和磷酸化有关的酶
类, 也是糖代谢的场所!12∀。一些同样用焦锑酸钾标记 Ca2+ 的研究显示: 当植物产生一些
生理变化之前或开始, Ca2+ 往往出现在细胞核的核液中!6~ 9∀, 本研究的结果同样是核液中
存在大量的Ca2+ , 而核仁中极少。Ca2+ 在这里大量分布应与促进此时果肉细胞的分裂和
初期膨大时的旺盛代谢有关。此外, 从此时细胞核内 Ca2+ 较多, 且有大量已变小的质体
围绕着细胞核分布 (图版 1, D、H) 来看, 细胞核应是主要的 Ca2+ 的消耗场所。
受精约1周后, Ca2+ 在果肉细胞的分布部位发生了变化, 由果肉的细胞内部转向了细
胞之间的连接处 (图版 2, A~ C) , 直至受精3~ 4周后难以检测到Ca2+ 为止。细胞之间的
连接是通过果胶和果胶酸钙实现的, Ca2+ 大量在这一部位出现, 很容易认为是通过形成果
胶酸钙来参与强化细胞间的连接的。同样可以认为这一部位 Ca2+ 越多, 结合得越牢固。
根据以上对Ca2+ 定位研究的结果, 可以将幼果吸收的 Ca2+ 分为两类, 受精 1周内吸收的
Ca
2+ 主要与促进果肉细胞分裂和初期膨大时旺盛的生理代谢活动有关, 而此后所吸收的
Ca2+ 则与细胞间的连接有关。Ca2+ 通过导管向果实各部运输 (图版 1, D、H) , 导管内
Ca2+ 的有无和多少同样可以用来衡量果实发育的好坏。幼果开始转黄和即将生理落果的果
4996 期 彭抒昂等: 梨果实发育中 Ca2+ 在果肉细胞的定位及变化研究
实, 其导管中难以检测到 Ca2+ 沉淀颗粒就是极好的证明 (图版 2, E)。另一方面, 这些生
理落果和采收后即将腐烂的果实都能在果肉细胞的质膜上检测到多数的 Ca2+ 沉淀颗粒,
这可能是参与形态构成的 Ca2+ 重新溶出所致。
3. 2 果实吸收 Ca2+ 的时期
受精作用对幼果的坐果和初期膨大的重要性是众所周知的, 一般将此归结为受精后早
期幼胚的发育分泌了大量激素, 刺激了果实生长与膨大。但受精作用对果实发育所需
Ca
2+ 的吸收却报道甚少。本研究结果显示, 受精前果肉细胞和导管内检测不到 Ca2+ 沉淀
颗粒, 而受精后却被大量检测出来, 这说明受精作用对果实钙的吸收同样有着至关重要的
作用。另一方面, 许多研究都证明, 果实发育所需 Ca2+ 的绝大部分都是在幼果期吸收
的!13, 14∀, 但一般认为在 4~ 6周内。而本研究结果显示, 在幼果发育期用于细胞分裂和初
期膨大时旺盛代谢作用的 Ca2+ , 离受精作用越近, 检测到的 Ca2+ 沉淀颗粒就越多; 而用
于细胞间起连接作用的 Ca2+ 则持续的时间稍长, 为 2~ 3周。整体上, 幼果期越早, 越有
利于 Ca2+ 吸收。缺 Ca2+ 会导致果实发育后期和贮藏期的质地变差, 或直接导致许多贮藏
期的生理病害发生, 在采前采后用各种补充钙制剂的方法都可以取得一些效果!4, 5∀。但近
年来对果实发育早期进行补钙的重要性已引起重视, 许多报道认为在幼果期补钙的效果要
明显优于果实发育中后期和贮藏期!15, 16∀, 而本研究定位观察 Ca2+ 的结果也支持早期补钙
的观点。本研究结果显示 Ca2+ 是通过导管向果肉组织输送的, 而且越是在幼果发育的早
期吸收的 Ca2+ 越多。这意味着幼果发育时期越早, 吸收 Ca2+ 的动力越大。从增加果实钙
的含量来说, 补钙措施应在这一时期进行。
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500 园 艺 学 报 28卷
Studies on Localization and Change of Ca
2+
in Fruit Flesh Cells during
Fruit Development of Pear
Peng Shu ang 1and Iwahori Shuichi2
( 1 Department of Horticulture, Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070; 2 Institute of Agriculture and Forestry ,
University of T sukuba, T sukuba Japan 305 )
Abstract: Relat ionship between Ca2+ localization and change in the fruit flesh cells and cell ul
trastructure during fruit development of pear ( Pyrus pyrifolia Nakai) cv. kosui were studied using the
cytochemical method of antimonite precip itation technique. The results showed that before the fertiliza
tion no Ca2+ sediment particles could be detected in the flesh cells and there existed little chromat in
and light staining was observed in the nucleous. After fertilization many Ca
2+
sediment particles could
be detected in the flesh cells, mainly distributed in nucleus, cytoplasm, plastids and exterior mem
brane of chloroplast . The plastids containing Ca2+ expanded great ly. In addition, Ca2+ sediment part i
cles could be observed in vessels and primarily developed stone cells. It was found that Ca2+ moved to
the linking space in between the fruit flesh cells one week after fertilizat ion. There was little or no
Ca2+ in the cells and vessels of physiologically dropped fruits, whereas Ca2+ was distributed along the
vacuolar membrane of some cells. Three to fourweeks after the fertilization it was difficult to detect the
Ca
2+
sediment part icles in the flesh cells, which continued unt il the fruits were harvested. However,
Ca2+ sediment particles appeared in both sides of flesh cell wall before the fruits rotted. Relationship
between function of Ca2+ in fruit development and ultrastructure is discussed herein.
Key words: Pear; Fruit development; Localization of Ca2+
图版说明 chl: 叶绿体; cw: 细胞壁; m: 线粒体; n: 细胞核; no: 核仁; p: 质体; v: 液泡
图版 1 受精前后果肉组织细胞 Ca2+ 定位分布及变化 A: 受精前不活跃的果肉细胞; B: 受精前果肉细胞中的叶绿体
及周边细胞质; C: 受精前果肉组织中的导管; D: 受精后果肉细胞的细胞核, 里面充满了Ca2+ 沉淀颗粒; E: 受精后
果肉细胞的叶绿体及周边细胞质; F: 受精后果肉组织中的导管, 里面布满了 Ca2+ 沉淀颗粒; G : 受精后果肉细胞中的
细胞核和特别膨大的质体, 里面充满了Ca2+沉淀颗粒; H: 受精后果肉细胞中的细胞核和众多体积已变小了的质体,
Ca2+充满了细胞核, 但质体内已没有Ca2+ ; I: 受精后初始发育的石细胞, 厚厚的细胞壁与布满 Ca2+ 沉淀颗粒的细胞
质。
图版 2 受精 1周后整个果实发育过程中果肉组织细胞Ca2+ 定位分布及变化 A: 受精 1周后 Ca2+ 沉淀颗粒堆积在果肉
细胞之间的连接处; B. C: 同 A, 放大的果肉细胞之间的间隙与连接处; D: 同 A, 经 EGTA处理, 相近部位果肉细胞
之间的间隙与连接处的 Ca2+ 沉淀颗粒消失; E: 生理落果果实变黄初期的导管 (盛花后 3周) ; F: 同 E, 生理落果果
实变黄后的某一果肉细胞, Ca2+ 沉淀颗粒沿液泡膜分布; G: 6月下旬, 果肉细胞内开始大量积累淀粉粒; H: 果实采
收贮藏 10 d后, Ca2+ 沉淀颗粒重新出现并沿果肉细胞壁两侧分布; I: 同H , 经 EGTA 处理, 相近部位果肉细胞壁两侧
Ca2+沉淀颗粒消失。
5016 期 彭抒昂等: 梨果实发育中 Ca2+ 在果肉细胞的定位及变化研究
图版 1 Plate 1
Explanation of plates chl: chloroplanst ; cw: cell wall; m: mitochondrion; n: nucleus; no: nucleolus; p: plast id; v: vacuole
Plate 1 Photomicrographs show ing local izat ion and change of Ca2+ in flesh cells before and after fertilization A: Inact ive f lesh cells be
fore fert ilizat ion; B: Chloroplast and cytoplasm nearby in the flesh cells before fertilization; C: Vessels in flesh cells before fertilization;
D: Nucleus filledwith Ca2+ sediment part icles in the flesh cells after fert ilizat ion; E: Chloroplast and cytoplasm nearby in the flesh cells
after fertilization; F: Vessels filled with Ca2+ sediment particles in flesh cells after fertil izat ion; G: Nucleus and expanded plastids filled
with Ca2+ sediment part icles in flesh cells after fertilization; H: Nucleus filled with Ca2+ sediment particles and many shrinked plast ids
with no distribution of Ca2+ sediment particles in flesh cells after fert ilizat ion; I: Primarily developed stone cells with thick cell wall and
cytoplasm full of Ca2+ sediment part icles.
502 园 艺 学 报 28卷
图版 2 Plate 2
Plate 2 Photomicrographs illust rating the localization and change of Ca2+ in f lesh cells during f ruit development one week after fertiliza
tion A: The Ca2+ sediment part icles accumulated in the linking spot in between the flesh cells one week after fertilization; B and C:
The enlarged gap and linking spot in between the flesh cells; D: The Ca2+ sediment particle disappeared in the gap and linking spot in
between the flesh cells when treated with EGTA; E: The vessels in the physiologically dropped fruits, when they became yellow 3weeks
after full bloom; F: The flesh cell after the physiologically dropped fruits became yellow and Ca2+ sediment particles were distributed a
long the vacuole; G: Starch grains began to accumulate in the flesh cells in late June; H: The Ca2+ sediment part icles appeared again
and distributed along both sides of flesh cell wall 10 days after storage; I: The Ca2+ sediment particle disappeared along both sides of the
f lesh cell wall when treated with EGTA.
5036 期 彭抒昂等: 梨果实发育中 Ca2+ 在果肉细胞的定位及变化研究