全 文 ：园 艺 学 报 2002, 29 ( 1) : 69~ 71
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2001- 09- 15; 修回日期: 2001- 11- 21
基金项目: 国家林业局重点课题资助项目 (2000- 31)
香榧主要栽培品种的 RAPD分析
谭晓风 胡芳名 张党权 周煦惠 杨 伟
(中南林学院经济林育种与栽培国家林业局重点实验室, 株洲 412006)
摘 要: 以香榧 8个主要栽培品种无性系的种子胚乳 DNA 为研究材料, 利用 23 种多态型明显的引物
进行了 RAPD分析。结果表明: 8个品种之间在 DNA水平上表现出较大的异质性; 根据 RPAD特异分离谱
带确定了各品种的标记基因型, 以此可实现对香榧无性系品种 DNA水平上的鉴别; 以标记基因型为依据对
香榧 8个品种进行系统聚类分析, 结果与传统形态学分类中的两大类基本吻合。
关键词: 香榧; 品种; RAPD标记; 分子鉴别; 分子分类
中图分类号: S 664. 5 文献标识码: A 文章编号: 0513353X ( 2002) 0100693
1 目的、材料与方法
香榧 ( Torreya grandis ) 属裸子植物红豆杉科香榧属, 是第三纪孑遗植物, 为我国特有的珍贵多用
途经济干果树种。本课题的主要目的是研究香榧主要栽培品种的标记基因型或 DNA指纹图谱, 建立
香榧主要栽培品种的分子鉴别系统, 为今后香榧永久性的遗传作图群体构建选择杂合度高的单株提供
依据。另外, 以香榧各品种标记基因型为依据, 在 DNA水平上对香榧主要栽培品种进行系统聚类分
析, 探索各品种之间的亲缘关系及各品种在种内分类上的地位, 为香榧品种类群的划分和品种的生产
应用提供理论和分子水平的依据1 。
本试验所取材料为香榧的成熟种子, 由浙江诸暨市林科所提供, 共 8 个品种 (见表 1)。每个品
种取 20 粒种子为样品, 采用改良的 CTAB 法2 对其胚乳 DNA 进行抽提; 利用核酸蛋白分析仪
(BECKMAN, Du640) 对其 DNA浓度和纯度进行测定。RAPD分析3 引物均购自美国 OPERON 公司;
DNA聚合酶和 dNTPs购自华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室。RAPD反应体系为: 10 ! PCR
buffer 1. 5 L, 25 mmol/ L MgCl21. 5 L, 2. 0 mmol/ L dNTPs 1. 8 L, 10 mol/ L primer 1. 3 L, 5 U/ L Taq
0. 2 L, 10 ng/L DNA template 2. 0 L, HPLC water 6. 7 L, 总反应体积 15 L。
PCR反应循环条件为: 95 ∀ 变性 3 min; 94 ∀ 变性 30 s, 36 ∀ 退火 30 s, 72 ∀ 延伸 60 s, 35个循
环; 72 ∀ 延伸 5 min。
每个品种取 5个样品进行 RAPD分析, PCR ( PE9600) 扩增后, 经 1. 4 %琼脂糖凝胶电泳分离及
EB染色, 置自动凝胶成像系统 ( BIORAD, doc2000) 上进行谱带分离观测、拍照, 并确定记录各个
品种的标记基因型。由于香榧种子胚乳为单倍体, 因此每个品种同一单株上的种子的基因型将发生分
离。观测各个品种在各分离位点上的谱带分离状况, 在5份样品均出现该 DNA条带的记为 # 11∃ 型,
均不出现的记为 # 00∃ 型, 部分出现部分不出现的记为 # 10∃ 型。利用模糊数据分析软件, 以标记基
因型为基础, 对香榧各主要栽培品种进行分子聚类分析, 并建立相应的分子聚类图。
2 结果与分析
2. 1 主要栽培品种的RAPD扩增结果和标记基因型
利用从 520种随机引物中筛选出来的 23种引物对香榧 8个主要栽培品种的无性系进行 RAPD分
析, 结果得到了分离明显的标记位点 80个, 如图 1所示。结果表明: 不同的品种具有其特定的谱带
类型, 品种之间在 DNA水平上存在较大的差异。由于香榧是裸子植物, 其胚乳是只与母本有关的单
倍体组织, 且按孟德尔遗传方式遗传, 可以区分各品种在各RAPD标记位点上是显性纯合体、杂合体
还是隐性纯合体, 这几种标记基因型在图中都可以看到。整理上述结果, 可得到各品种的 RAPD标记
基因型, 据此可利用种子胚乳实现对上述品种的分子鉴别。
由于得到的标记基因型为单倍体标记基因型, 因而可以将其转换成二倍体标记基因型, 即将单倍
体的 # 11∃ 型和 # 10∃ 转变成二倍体的 # 1∃ 型, # 00∃ 型为 # 0∃ 型, 此时得到的 # 1∃、 # 0∃ 型数据
即为二倍体的标记基因型, 依据此标记基因型即可利用二倍体组织 (如叶片) 对其进行分子鉴别。
图 1 引物为 OpAP07的香榧 8个品种无性系的 RAPD谱带图
1~ 5: 冲杠榧, 6~ 10: 芝麻榧, 11~ 15: 米榧, 16~ 20: 细榧,
21~ 25: 小圆榧, 26~ 30大圆榧, 31~ 35: 旋纹榧, 35~ 40: 茄榧
Fig. 1 Torreya grandis RAPD pattern map by primer OpAP07
1- 5: Chonggangfei, 6- 10: Zhimafei, 11- 15: Mifei, 16- 20: Xifei,
21- 25: Xiaoyuanfei, 26- 30: Dayuanfei, 31- 35: Xuanwenfei , 36- 40: Qiefei
2. 2 主要栽培品种的分类
根据 RAPD分析所确定的各主要栽培品种的标记基因型, 利用模糊数学分析软件进行系统聚类分
析, 得到了各品种之间的相似系数和系统聚类图, 结果如表1和图 2所示。
表 1 香榧主要栽培品种之间的相似系数
Table 1 Correlationship between main cultivars of Torreya grandis
品种
Cult ivars
茄榧
Qiefei
旋纹榧
Xuanw enfei
大圆榧
Dayuanfei
小圆榧
Xiaoyuanfei
细榧
Xifei
米榧
Mifei
芝麻榧
Zhimafei
冲杠榧
Chonggangfei
茄榧 Qiefei 1. 0000
旋纹榧 Xuanwenfei 0. 7888* * 1. 0000
大圆榧 Dayuanfei 0. 7672* * 0. 8567* * 1. 0000
小圆榧 Xiaoyuanfei 0. 7563* * 0. 8149* * 0. 8072* * 1. 0000
细榧 Xifei 0. 6648* 0. 6805* 0. 6025 0. 6522* 1. 0000
米榧 Mifei 0. 6329 0. 6542* 0. 6541* 0. 6000 0. 7821* * 1. 0000
芝麻榧 Zhimafei 0. 6257 0. 6781* 0. 6001 0. 6643* 0. 7950* * 0. 8130* * 1. 0000
冲杠榧 Chonggangfei 0. 6389 0. 6534* 0. 6410* 0. 6251 0. 6682* 0. 6676* 0. 6697* 1. 0000
* 为显著(= 0. 05) , * * 为极显著(= 0. 01)
* Suggests signf icance (= 0. 05) , * * Suggest s ext remely significance (= 0. 01)
70 园 艺 学 报 29卷
从表 1中可以看出, 各品种间的相似系数值
在 0. 6000 ~ 0. 8567之间, 说明香榧各主要栽培品
种之间存在较高的相似程度, 这与香榧的分布范
围比较狭窄有很大的关系。
从图 2可以看出, 若取相似系数为 0. 67时,
可以将香榧8 个主要栽培品种聚为 2大类, 即茄
榧、旋纹榧、大圆榧、小圆榧为一类, 其余 4个
品种为一类。这一聚类结果与形态学上的分类
(圆榧类和长榧类) 基本吻合, 仅对茄榧的分类稍
有差异 (原来形态学上属于长榧类)。 图 2 香榧主要栽培品种的分子聚类树状图
Fig. 2 Molecular dendrogram of main cultivars of Torreya grandis
参考文献:
1 谭晓风, 胡芳名, 张启发. 银杏主要栽培品种的分子鉴别. 中南林学院学报. 1998, 18 ( 3) : 1~ 8
2 胡芳名, 谭晓风, 李 红. 香榧种子胚乳 DNA抽提. 经济林研究. 1999, 17 ( 4) : 5~ 8
3 Binell i G, Bacci G. A genetic linkage map of Picea abies Karst. , based on RAPD markers, as a tool in populat ion genetics. Theor. Appl. Genet . ,
1994, 88: 283~ 288
Molecular Identification of Main Cultivars of Torreya grandis by RAPD
Markers
Tan Xiaofeng, Hu Fangming, Zhang Dangquan, Zhou Xuhui, and Yang Wei
( The Key laboratory of Nonwood Forest Tree Breeding and Cultivation of Forestry Ministry , Zhuzhou 412006)
Abstract: The endosperm DNA samples of the seeds of a same individual plant of eight main cultivars
(clones) of Torreya grandis are analyzed with RAPD technology by using 23 primers that have distinct polymor
phism。The result indicated that there was a relatively large difference between the eight varieties at the level of
DNA molecule; the marker genotype of varieties was established according to particularly isolated bands in the ex
periments; the clone varieties of Torreya grandis can be identified at the level of DNA molecule according to the
marker genotype; the eight varieties of Torreya grandis were analyzed systematically with a assembling analysis tech
nology, and the analyt ic result tallied with the two classes of tradit ional morphological classif icat ion on the whole.
Key words: Torreya grandis; Cultivars; RAPD marker; Molecular identificat ion; Molecular classification
711 期 谭晓风等: 香榧主要栽培品种的 RAPD分析