全 文 ：园 艺 学 报 2005, 32 (5) : 869～871
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 11 - 03; 修回日期 : 2005 - 01 - 10
苹果自花结实性品种花柱 S -核酸酶基因的克隆
李天忠 1 加藤直 2 奥野智旦 2
(1 中国农业大学园艺植物研究所 , 北京 100094; 2 日本弘前大学农学生命科学部 , 弘前 03628561)
摘 要 : 从苹果二倍体品种 ‘Ontario’和 ‘迎秋 ’花柱中分别克隆到了两个 S - 核酸酶基因。同源性
比较结果 , ‘Ontario’和 ‘迎秋 ’都有一个与 ‘富士 ’Sf -核酸酶基因完全相同的序列。‘Ontario’另一个
S等位基因编码一个新的 S -核酸酶 , 被命名为 S8 -核酸酶 ; ‘迎秋 ’另一个 S等位基因与苹果 ‘红茜 ’的
Sd -核酸酶基因序列相同。
关键词 : 苹果 ; 自花结实性 ; 花柱 ; S -核酸酶 ; 基因 ; 克隆
中图分类号 : S 66111 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2005) 0520869203
S2RNa se cD NA C lon ing in Style of Self2fru itful Apple Cultivars
L i Tianzhong1 , Katoh Naoki2 , and Toshikatsu Okuno2
(1 Institu te for Horticultural P lan ts, Ch ina A gricu ltural U niversity, B eijing 100094, China; 2 Facu lty of A griculture and L ife Sci2
ence, H irosak i U niversity, H irosaki 03628561, Japan)
Abstract: There were two S2RNases have been exp ressed from cDNA cloning of S2RNase of‘Ontario’
and ‘Ying Q iu’ styles, respectively. The sequences of the S2RNases of‘Ying Q iu’were identical to that of
Sd2RNase in‘Akane’ and Sf2RNase in ‘Fuji’, self2incompatible cultivars. And, one new S allele gene
could be identified from ‘Ontario’ to that of S8 2RNase.
Key words: App le; Self2fruitfulness; Style; S2RNase; Gene; Cloning
1 目的、材料与方法
苹果属于受单一位点控制的具有 S复等位基因特征的配子体型自交不亲和树种〔1〕, 自花结实能
力极低。作者从 1997～2002年通过大量的田间自花授粉试验 , 筛选出了 ‘惠 ’ (自花结实率 5914% )
和 ‘弘大 1号 ’ (4318% ) 两个自花结实性较高的品种〔2～3〕, 但从花柱 S - 核酸酶基因克隆与同源性
比较、核酸酶活性染色及花粉杂交授粉试验结果看 , 这两个品种不具有花柱和花粉突然变异导致自花
结实的特征 , 自花结实的分子机理尚不清楚。本研究以小森等〔4〕通过授粉试验确认的两个自花结实
性品种 ‘Ontario’ (7414% ) 和 ‘迎秋 ’ (20% ) 花柱为材料 , 克隆其花柱 S - 核酸酶基因 , 比较分
析核苷酸序列 , 进一步对苹果自花结实机制进行探索。
材料采自日本农业技术研究机构果树研究所苹果部 , 春季从田间采 ‘Ontario’和 ‘迎秋 ’品种
的蕾期的花 , 花柱液氮处理后贮藏在 - 80℃的冰柜待用 , 花粉自然凉干后冷冻备用。
采用异硫氰酸胍 —氯化铯超速离心法提取总 RNA〔5〕, O ligotex2dT 30 < Super > ( TaKaRa) 分离纯
化 Poly (A) mRNA。然后将 Poly (A) mRNA 1μg、O ligo ( dT) 引物 20μmol·L - 1、核糖核酸酶抑
制剂 20 U·μL - 1、dNTPs 10 mmol·L - 1和反转录酶 50 U·μL - 1 ( Perkin Elmer, N80820018) 混匀 ,
置于 42℃ 1 h, 94℃ 5 m in, 反转录合成 cDNA。RT2PCR所用正义引物为 5pi2GCGAAGCTTT (A /T) (C /
T) GATTATT (A /T) (C /T) CAATTTACG23pi (引物 A ) 和 5pi2GGGAAGCTTATGTACATAACCCAGAAA2
CAA23pi (引物 B ) , 反义引物为 5pi2CCCGTCGAC (A /G) CAAA ( G/T) A (C /G) ( C /T) (A /G) AC2
CTCAAC 23pi (引物 C )、 5pi2GCCGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT23pi (引物 D ) 和 5pi2AAAAAAAT2
园 艺 学 报 32卷
TCACATATTCAT23pi (引物 E)。反应体系为上述反转录反应液 20μL、50 mmol·L - 1的正反义引物各 2
μL, 加入 25 mmol·L - 1 MgCl2、215 mmol·L - 1 dNTP和 5 U·μL - 1 Taq酶 ( Promega Inc. , Madisom)。
PCR反应条件为 94℃ 5 m in变性 , 94℃ 2 m in、45℃ 1 m in、72℃ 3 m in, 30个循环。利用载体连接试
剂盒 ( TaKaRa) 将 PCR产物插入到 pB luescrip t Ⅱ KS ( + ) ( Stratagene Ine. , La Jolla) 载体中 , 对回
收的特异性片段进行克隆 , 碱变性法抽提质粒 DNA, 4000L (L I2COR) DNA测序仪测序。
2 结果与分析
植物自交不亲和性分子机理研究的一个重要手段就是利用突变体 , 即自交不亲和性的品种与其自
花结实性变异之间的比较 , 从中获取差异性结论。但苹果迄今尚未发现自花结实性突变体 , 因此 , 我
们用自花结实性品种的 S -核酸酶基因序列与具有相同 S等位基因自交不亲和性品种比较 , 试图找出
基因突变位点。
由图 1可知 , 从自花结实性苹果品种 ‘Ontario’和 ‘迎秋 ’的花柱内 , 利用正义引物 A、B和反
义引物 C、D、E, 分别克隆到了两个基因序列片段。
图 1 苹果 ‘On tar io’ ( O T: S8 Sf) 和 ‘迎秋’( Y Q: SdSf) 品种的 S8 , Sd和 Sf2cD NA s的核苷酸序列
加框部分为终止密码子 ; 下划线部分为引物。
F ig. 1 Nucleotide sequences of the S8 , Sd and Sf2cD NA s of apple cultivar‘On tar io’( O T: S8 Sf) and‘Y ing Q iu’( Y Q: SdSf)
Open box indicate stop code; Primers are underlined.
在 ‘Ontario’花柱中获得了一个 812 bp和 1个 762 bp的基因克隆 , 其产物分别编码 200和 201
个氨基酸 , 氨基酸序列分别含有 5个保守区、2个多变区、8个保守的半胱氨酸和 4个糖链 (图 2) ,
这些特征证明所获得的克隆基因编码一类 S - 核酸酶。将克隆到的 S - 核酸酶基因序列在 Genbank中
B last检索 , 结果显示其中一个 ( 812 bp ) 基因序列与苹果 ‘富士 ’品种的 Sf - 核酸酶完全相同
(D50837)。另一个片段在 GenBank中未见登录 , 与苹果 Sz -核酸酶的同源性达到 91% , 编码一个新
的 S -核酸酶 , 著者将该基因命名为苹果 S8 -核酸酶 , 在 GenBank的登录号为 AY744080。
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5期 李天忠等 : 苹果自花结实性品种花柱 S -核酸酶基因的克隆
图 2 苹果品种 ‘On tar io’和 ‘迎秋’的 S - 核酸酶氨基酸序列
在氨基酸序列中 , 可见 5个保守区 (C1～C5) 和 2个可变区 (HVa, HVb) , 3 表示保守的氨基酸 , 下划线表示可能的糖链部位 ,
下划线 N2S部分为可能的糖链结合部位 , ν 表示在氨基酸序列中有 8个半胱氨酸存在 。
F ig. 2 Am ino ac id sequence a lignm en t of apple cultivar‘On tar io’and‘Y ing Q iu’S2RNa ses
The five consered regions (C1 - C5) and the two hypervariable regions (HVa, HVb) are shown under sequences.
The conserved residues in all S2RNase is indicated with asterisks. Potential N2glycosylation sites are underlined. Putative N2glycosylation
sites are underlined. ν residues conserved in S2RNase is shown with open circles.
在 ‘迎秋 ’花柱中获得了 1个 812 bp和 1个 683 bp的基因克隆 (图 1) , 其产物分别编码 200和
201个氨基酸 (图 2) , 也具有 S - 核酸酶的特征。Genbank中 B last检索结果 , 其中一个基因序列与
‘Ontario’相同 , 编码一个 Sf - 核酸酶 (序列省略 ) , 另一个基因序列与 ‘红茜 ’ Sd - 核酸酶
(AB032246) 相同。从以前对 ‘惠 ’、‘弘大 1号 ’及本研究对 ‘Ontario’和 ‘迎秋 ’等自花结实性
品种花柱 S -核酸酶基因克隆结果看 , 除 ‘Ontario’的 S8 -核酸酶尚不能比较外 , 其它与具有相同 S
等位基因的自交不亲和性品种比较 , 结果未发现有核苷酸序列变化。因此 , 一种可能是苹果与由于花
柱或花粉突变导致自花结实性的日本梨 ‘奥嘎二十世纪 ’、欧洲杏 ‘凯特 ’及甜樱桃 ‘Stella’等品
种在自花结实性机制方面不同 , 存在一套未知的系统因素导致自交亲和性的发生〔5～7〕; 另一种可能是
在 S -核酸酶基因 5’端上游区域存在突变位点。
参考文献 :
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Q i J. Cloning and exp ression analysis of genes relative to self2incompatibility in ap ricot ( P runus arm eniaca) : 〔Ph. D. D issertation〕. Shan2
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