全 文 ：园 艺 学 报 2004，31(2)：189～192
Acta Horticuhurae Sinica
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与黄瓜抗白粉病相关基因连锁的AFLP标记的获得
张桂华 杜胜利 王 鸣 马德华
( 天津科润黄瓜研究所，天津 300192；!西北农林科技大学园艺学院，杨凌712100； 天津市农业生物技术研究中
心，天津 300192)
摘 要：以黄瓜抗白粉病母本Q9和感白粉病父本Q10及组合 (津春3号)的F 分离群体为试材，采
用BSA法建立了对白粉病的抗病组和感病组，AFLP引物组合P18M47在两组间表现多态，且呈共显性。经
F，单株分析，在高抗个体和高感个体中分别仅扩增出约238 bp和236 bp的特异片段，而在中间类型个体
中同时扩增出了该两个特异片段 (238 bp／236 bp)，经连锁值测定，表明该特异带与白粉病抗病相关基因
紧密连锁，连锁距离为5．56 cM。测序结果显示，目标片段的大小分别为238 bp和236 bp，且两个片段的
差异仅为两个 “T”碱基的插入或缺失。BLAST查询表明该两个片段为新发现的黄瓜 DNA序列。
关键词：黄瓜；白粉病；抗性相关基 ；分子标记；AFLP
中图分类号：S 642．2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2004)02-0189-04
AFLP Markers of Cucumber Powdery Mildew Resistance．related Gene
Zhang Guihua ，Du Shengli ，Wang Ming：
，
and Ma Dehua
( Tianjin Kernel Cucumber Research Institute，Tianjin 300 1 92，China；!Department of Horticulture，Northwest Science and Tech—
nology University ofAgriculture and Forestry，Yangling 712100．China； Tianjin Agricultural Biotechnology Research Center，
Tianjin 300192，China)
Abstract：With a F2 population between a highly resistant parent and a highly susceptible parent(Q9×
QlO)as materials，polymorphism between resistant and susceptible bulk of cucunlber powdery mildew were
studied using BSA method and AFIJP technology．A CO—dominant AFLP marker，P1 8 M47—238 bp／236 bp，
was screened． The resistant and susceptible F!plants possessed the 238 bp and the 236 bp fragment，respec—
tively，and the mid—plants owned the two fragments． Linkage analysis indicated that the AFLP marker was
tightly linked to the cucunlber powdery mildew resistance related gene，and the genetic distance was 5．56
cM． Sequencing of the fragments of the CO·dominant AFLP marker indicated that their lengths were 238 bp
and 236 bp respectively．The diference of the two fragments lied in the insert—deletion(inde1)of two“T”
base． BLAST analysis revealed that the two fragments were new in the GeneBank．
Key words：Cucumber；Powdery mildew；Resistance—related gene；Molecular marker；AFLP
黄瓜白粉病 (Powdery mildew，Sphaerotheca． figinea)是一种广泛发生的世界性病害。常规抗病
品种的选育主要依靠对病害的田间鉴定，受环境影响较大，同时又不可避免存在人为误差，因此鉴定
结果不够准确。加之黄瓜白粉病的病原为单丝壳白粉菌 (属子囊菌亚门真菌)，属于专性寄生菌，只
能在活体寄主上存活，无法进行人工培养，因此黄瓜白粉病的发生受季节限制，在非发病季节对该病
的田间鉴定工作则难以进行。RFIJP、RAPD和AFLP等分子标记技术，为分子育种提供了一条新途
径 ¨ ，但 目前尚未见与黄瓜抗白粉病相关基因连锁的分子标记研究的报道。
本研究以黄瓜抗白粉病和感白粉病亲本组合的F 分离群体为试材，通过苗期人工接种和田间抗
病性鉴定，采用 BSA法和AFIJP技术，筛选与黄瓜抗白粉病相关基因连锁的AFIJP标记，为分子标记
收稿日期：2003—06—10；修回日期：2003—08～26
基金项目：天津市重大攻关项目 (003122011—1)；国家863重大专项资助项目 (2002AA244011—3)
致谢：中国农科院品种资源研究所贾继增研究员，中国农科院蔬菜花卉所王晓武副研究员对本研究予以热情指导与帮助
， 特此致谢
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园 岂 学 报
辅助黄瓜抗白粉病育种和抗白粉病相关基因的克隆奠定基础。
l 材料与方法
供试材料为黄瓜品种 ‘津春3号’的抗白粉病母本Q9和感白粉病父本QlO及其F 自交群体。
AFLP引物在上海生工生物工程公司合成，所用 TaqDNA聚合酶、dNTP等试剂均购 自该公司 试
验于2001年8月～2002年12月在天津科润黄瓜研究所完成，部分工作在中国农科院蔬菜花卉研
究所国家重点开放实验室完成。
F’分离群体的构建及抗白粉病性鉴定：将亲本及其 F：播种于塑料温室中，正常管理。待长至3
片真叶时采用喷雾法进行白粉病苗期接种鉴定。分别于接种后 10 d、20 d、30 d调查发病情况。1级
(抗病)：无病症或有少数抗病型病斑；2级 (中间类型)：感病型病斑占叶面积的 1／3～2／3；3级
(感病)：感病型病斑面积超过叶面积的2／3，叶片黄化严重或干枯。
DNA的提取和AFLP分析：选取高抗、高感单株各5株，组成抗病组和感病组。每组内单株提取
DNA，单株进行AFLP扩增。DNA提取采用CTAB法 。AFLP分析参照Vos 的方法。黄瓜基因组
DNA的酶切采用 MseI和PstI两种内切酶；预扩增引物采用不含选择性碱基的 MOO和 PO0。选择性扩
增结束后，扩增产物在6％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，银染法进行染色。
分子标记筛选及特异片段的验证：对抗病组和感病组单株进行AFLP扩增，在两组间产生差异条
带的引物组合即初步认为与黄瓜抗白粉病性相关基因连锁；然后利用该引物组合对 F 单株进行扩增，
进一步确认所筛选到的标记。
特异片段的回收纯化参照文献 [4]，回收片段由大连宝生物公司进行测序。
2 结果与分析
2．1 黄瓜白粉病的田间鉴定
分别在接种后 10 d、20 d和30 d进行了白粉病发病情况调查，108个F单株中高抗的26株，中
间类型的 (田间抗病性表现偏向于感病亲本)55株，高感的27株，经适合性测验基本符合1：2：1的
分离比例 (表1)，说明黄瓜对白粉病的抗性由单隐性基因控制，感病相对抗病为不完全显性。这与
已有报道 ]1962年日本的藤枝国光的研究结果一
致。
2．2 抗白粉病相关基因分子标记的筛选
共采用在双亲间产生多态性的引物组合 73组
对两个亲本及抗病组和感病组单株进行了PCR扩 5f)bP
增，获得了一个共显性标记 P18M47—238 bp／236
bp(图1)。抗病亲本和抗病组单株只有238 bp
的特异片段，感病亲本和感病组单株都具有236 bp ⋯
的特异片段。所用选择性扩增引物P18M47的碱基
序歹0女口下：p18：5 一GACTGCGTACATGCAGCT一
3 ；M47：5 一GATGAGTCCTGAGTAACAA一 3 。
表1 黄瓜白粉病田间鉴定结果
Table 1 Fidd identification of cucumber powdery mildew
材料 株数 高抗 中间类型 高感
Materials No．of plants High resistance Medium High susceptible
图1 获得的共显性标记 PI8M47—238 bp／236 bp
M．DNA ladder；1．抗病亲本 Q9；2．感病亲本QlO；
3～7．抗病池单株；8～l2．感病池单株：
Fig．1 Co·dominant marker PI8M47—238 bp／230 bp
M．DNA ladder；1．Resisitant parent Q9；2．Susceptible parent
QlO；3—7．Resistant plants：8～1 2．Susceptible plants．
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2期 张桂华等： 黄瓜‘j粉病抗性相天基因连锁的AFLP标记的获得 191
2．3 特异片段的F 单株验证
用所得到的共显性标记 P18M47对组外其它F：单株进行了验证。结果显示，仅在82个表现感病
的单株中有6株发生了交换，产生了与抗病单株相同的带型。由此计算，所筛选到的标记与抗白粉病性
相关基因紧密连锁，遗传距离为5．56 cM 图2为引物组合P18M47在部分F 单株中的验证。
238 bp
M 1 2 3 ‘=I 5 6 7 8 9 ⋯ l1 12 13 H 15 16 17 18 19 20 21 22 9_40,25262728293031 32
图2 引物组合P18M47在部分 F2单株中的验证
M．DNA ladder；1．抗病亲本 Q9；2．感病亲夺 QlO；3～12．抗病单株；13～22．中间类型单株；23～32．感病池单株
Fig．2 Verifcation of primer P18M47 in F2 plants
M．DNA ladder；1．Resisitant parent Q9；2．Susceptible parent Q10；3—12．Resistant plants：l3—22．Medium plants；
23—32． Susceptible plants．
2．4 目标条带的回收和测序
图3为目标条带回收、再扩增后在 l％琼脂糖凝胶上的电泳分离结果。可以观察到，回收的片段
为单一条带，且带型清晰，分子量大小在200—300 bp之间。回收片段测序结果显示，两个片段的大
小分别为238 bp和236 bp，其差异仅为2个 “T”碱基的插入或缺失。采用Blast软件对GeneBank中
的非冗余数据库 (GeneBank+EMBL+DDBJ)进行查询，未发现与该两个标记片段同源性高于30％
300
图3 回收、扩增后目标片段的琼脂电泳分离
M：DNA标准；1—5：238 bp片段；6～10：236 bp片段。
Fig．3 Amplifcation of target fragment derived from silver-stained gel
M：DNA ladder；1～5：Fragment of 238 bp；6—10：Fragment of 236 bp．
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园 艺 学 报 31卷
的序列，说明该两个片段为新发现的黄瓜 DNA序列。与所测序列有关的内容已申报国家发明专利
(专利申请号为：03129978．4)。
3 讨论
遗传育种学家早就对黄瓜抗白粉病性的遗传进行了研究。前人研究结果 为：黄瓜对白粉病的
抗性受隐性多基因控制，但也有研究认为抗性受隐性单基因控制。笔者认为，得到以上不同研究结果
可能与他们所采用材料的遗传背景有关。本试验也表明黄瓜对白粉病的抗性由单隐性基因控制。另
外，本研究也发现，在田间表现为中间类型的单株，其抗病性表现均偏向于感病亲本，说明黄瓜对白
粉病的感病性相对抗病性为不完全显性。
分离群体混合分析或分群分析法 (BSA)是Michelmore等1991年建立起来的一种连锁标记分析
方法 。对于单基因控制的质量性状，若为不完全显性，不易鉴别杂合子，在F 后代性状划分时很
可能发生划分错误[8 J。由于黄瓜对白粉病的抗性是由隐性单基因控制的，且感病为部分显性，所以
在组建感病池时，很容易将中间类型的个体错误地划分为感病个体，从而使感病池目标性状混杂，在
进行BSA分析时就很难找到在两池间表现多态的标记。因此本研究构建抗病组 (5个抗病 F 单株单
独扩增)和感病组 (5个感病 F 单株单独扩增)进行标记筛选，只要组中有4个单株带型一致，即
可初步认为该标记与抗病性有关。目前已根据所测序列信息设计了‘SCAR引物，并成功地转化为了更
为稳定的SCAR标记。
参考文献：
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8 Schsn C，SaJlchez M，Blake T，et a1．Segregation of Mendelian markers in doubled haploid and F2 progeny of a barley cross． Hereditas。
l990．113：69～72
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