全 文 ：园 艺 学 报 2004，31(3)：315—320
Acta Horticulturae Sinica
黄瓜 “花打顶 "茎尖-．／e- { ■■⋯ 的组织和细胞学特征
李志英 李兴国 徐 立 郑成超
(‘中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，儋州571737； 山东农业大学生命科学学院，泰安271018； 山东
农业大学园艺学院，泰安271018)
摘 要：通过解剖学和细胞学的研究发现，黄瓜 “花打顶”茎尖部位的节数、节间长度和茎粗均减
小，顶端幼茎细胞的伸长和伸展受到抑制，维管束数目增加，导管壁和厚角组织细胞壁明显增厚，顶端分
生组织分化的原基数量相对减少，并簇生，顶端分生组织的体积减小，细胞液泡化，核膜、液泡膜及质体
膜等部分降解，细胞呈现衰老趋势；进一步利用mRNA差异显示技术获得了黄瓜生长正常和花打顶的差异
表达eDNA片段，No．hem分析表明其中精氨酸脱羧酶(ADC)的同源基因和叶绿体 ATP~e亚基II的同源基
因分别属黄瓜花打顶的正调控和负调控基因。
关键词：黄瓜；花打顶；解剖学；细胞学；mRNA差异显示
中图分类号：S 642．2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X(2004)03-0315-06
Studies on the Anatomical and Cytological Characteristics of Blunted、 th
Blossom Cucumber
Li Zhiying 一，Li Xingguo ，Xu Li ，and Zheng Chengchao
(。Insthute ofTropical Crop Germplasm Resources，Chinese Academy ofTropical Agricultural Sciences，Hainan Pr~inee。Danzhou
571737，China； College ofLife Science，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China； College ofHorticulture，
Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China )
Abstract：In order to reveal the characteristics of the“blunt with blossom”cucumbem (BBCs)．we
investigated the anatomical and cytological characteristics of the young stems and shoot tips of the BBCs by
light microscopy(LM)，transmission electron microscopy(TEM)and scanning electron microscopy(SEM)
procedures．In BBCs plants。the node number。internode length and the stem diameter in shoot tops all re．
duced，and the elongation and expansion of the stem cells were inhibited．In contrast，the wall thickness of
the collenchyma eell。the number of the vessel bundles．and the number of mature vessels in young stem in．
creased respectively．Meanwhile，the shoot apical meristem cels avacuoled。and the nuclear envelope，tono．
plast，plastid envelope and endoplasmic reticulum dissolved partially．In the studies on the role of BBCs。two
positive eDNA bands were obtained through mRNA differential display．Northern blot analysis showed that one
eDNA fragment homologous to the chloroplast ATPase subunit III Was down regulated and the other eDNA frag-
ment homologous to the arginine deearboxylase(ADC)was up regulated in BBCs．
Key words：Cucumber；Blunt with blossom；Anatomy；Cytology；mRNA diferential display
“花打顶”是黄瓜 (Cucumis sativus L．)生产中普遍存在的一种生理异常现象，苗期、采收期和
生长后期均有发生，采收期和生长后期更为严重，使产量和经济效益受到较大影响。前人已做了黄瓜
花打顶后的田间表现、发生原因和预防措施的部分研究，认为在不良的环境条件下，黄瓜顶端生长停
滞，生长点周围丛生许多大小不一的花蕾，形成一种 “花包头”的现象，称之为花打顶 ¨ 。这些不
良的环境条件主要包括低温、高温、干旱、弱光等，它们均能降低黄瓜植株的各项生理功能。引起植
收稿日期：2003一o9—08；修回日期：2003一ll一19
基金项目：国家自然科学基金项目 (Q30270145)；国家转基因植物研究与产业化专项资助项目 (J99一A-038)
通讯作者 Corresponding author．E-mail：cczheng@sdau．edu．cn
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株的衰老 ]，故有人认为黄瓜花打顶是一种衰老现象 。由于花打顶后顶端丛生花器官，故也有人
推测花打顶是顶端分生组织只分化花原基造成的，但至今尚未见有关其解剖及细胞特征研究的报道。
本研究的目的就是从解剖学和细胞学角度系统观察黄瓜花打顶幼茎和顶端分生组织与生长正常的差
异，进而分析其本质，并利用mRNA差异显示技术研究花打顶的分子机制，为深入研究其调控机理
和寻找可行有效的防治措施提供理论依据。
1 材料与方法
试材选用 ‘新泰密刺’黄瓜，2001年1O月～2002年7月在山东农业大学教学基地、园艺学院蔬
菜标本园和温室分别进行，株距0．3 m，行距分别为0．5 m和0．8 m，按照生产常规管理。待黄瓜部
分出现花打顶的性状后，进行取材和指标测定。
用游标卡尺和直尺测定生长正常和花打顶的茎尖 (图版I，A和B)部位节间的长度、茎粗，各
测定 15～25株，重复3次，计算平均值，进行差异显著性分析。
取正常和花打顶的茎尖各2O个，于直视条件下解剖观察茎尖部位的节数 (N1)后，进一步在解
剖镜下解剖观察茎尖不能直视部位的节数 (N2)，最后将所剩正常和花打顶黄瓜1～2 mm茎尖和已测
定形态指标的对应节位的茎段，迅速投入固定液中减压固定，制石蜡切片 、半薄切片和超薄切
片 J。对石蜡切片的每处理观察 15个，统计茎尖纵切片中所含叶原基数目 (N3)，计算茎尖部位的
总节数 (N1+N2+N3)，重复3次，计算平均值，方差分析差异显著性；半薄切片的每处理观测 15
～ 2O个视野，重复3次，计算平均值，并进行差异显著性分析。
分别剥取生长正常和花打顶的茎尖，立即用4％戊二醛固定，样品粘于载物台上，并在HCP-2型
CO 临界点干燥器中干燥，Polaro E-6100喷金，JSE— 00扫描电镜扫描并照相。分别切取正常和花打
顶的茎尖，迅速投入液氮中，并于一80％保存。利用 TRIZOL试剂盒 (Promega公司)提取总 RNA，
DNase I处理RNA中残留的DNA，进行反转录和PCR扩增 J。将得到的PCR产物进行聚丙烯酰胺凝
胶电泳，银染显带，回收目的带，以相应引物二次PCR扩增，克隆并测序后进行 Northern杂交分析。
2 结果与分析
2．1 黄瓜花打顶茎尖的形态变化
与生长正常的黄瓜植株相比，花打顶的茎尖部位的节数减少，节间缩短，茎变细 (表 1)，表明
花打顶后顶端分化可能受到影响，茎细胞的分化、伸长或体积增大等受到了抑制。
表1 黄瓜花打顶后茎尖形态指标和茎尖解剖结构的变化
Table 1 M orphological and stem anatomical structure chan ges of the “blunted with blossom” cuctrmber
注：节数指茎尖部位所含的节的数量，包括已分化的叶原基数；’P<0．05，差异显著；一P<0．01，差异极显著。
Note： Node No．means all the nod es of the top．including the leaf premium No．； ，一 Significant at P<0．05 an d P <0．01 respectively
2．2 黄瓜花打顶茎尖的解剖学特征
进一步分析了幼茎的解剖学特征，发现花打顶后的茎横切和纵切面结构都与正常的有较大差异。
花打顶幼茎中维管束的数量显著增加；维管束中具有次生增厚的导管的数目增加 (表 1，图版 I，C
和 D)，而韧皮薄壁细胞直径减小，与正常植株比较均达极显著水平 (表 1)；同时茎厚角组织细胞的
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3期 挛志茭等：黄瓜 花打顶”茎尖的组织和细啦学特征
细胞壁显著增厚 (图版 I，E和F)．纤维细胞长度减 、，也与正常的差异极显著 (表1，图版I．G
和 H)。
为了观察茎尖的整体形态，进行了扫描电镜观察． 与正常的茎尖相比，花打顶的茎尖周围分化豹
叶原基和花原基的数量减少，顶端分生组织的体积相对减小 (图版Ⅱ，A和B)，表明顶端分生组织
的分化能力和分生组织细胞的生长发育受到抑制 尽管花打顶的茎尖仍有原基分化，但细胞的伸长程
度降低，使分化的原基成簇，不伸展 在染色反垃程度方面．与周围原基比较．顶端分生组织染色较
浅，表明花打顶后赝端分生组织细胞的活’肚可能降低 (图版Ⅱ，c～E)。
2．3 黄瓜花打顶茎尖的细胞学特征
电镜图片显示．正常的顶端分生组织细胞内有许多微，】、的液泡．花打顶的顶端分生组织细胞高度
液泡化．细胞内容物减少 (图版Ⅲ，A和B)=正常的顶端分生组织细胞内的膜和内质网清晰．而花
打顶后．质体、核和液泡的膜部分降解．观察不到清晰的内质网，细胞核内异染色质的密度降低
(图版Ⅲ，c和D)，表明黄瓜花打顶后顶端分生组织细胞衰老。
2．4 黄瓜花打顶后差异基因的表达
苄u用mI A差异显示技术获得的阳性差异带中．有两个在GenBm~k中有同源穿列．片段A的长
度为34-4-bp，其氨基酸序列与GenBank中的叶绿体ATPa~亚基l『I高度同派，片段B的长度为686
bp，其氨基酸序列与GenBank中的精氨酸脱援酶 (ADC)基因高度同源 (图1)。
片段A FragmenlA
拟南芥Arabidops~
片殷B FragmentB
确豆 珊
片嚣B Fragment B
豌豆 P括Ⅳ州
片段丑 FragmentB
l畹 P “拊
GSLS
VDSc趣GDAEQWT
GEYYCSGDDFSA
片殷B FragmentB YCYA墨QSLLR RP A工PNZLU{FFSSRSVH GP YFHZFPFS工F( KKKKKKKKK
荫豆 尸缸 删 DTV~qATSVAGEDENWSY
圈1 片嚣A和B的氰基酸序列与拟南芥ATPase亚基珊 和豌豆ADC的同舔比较
Fig 1 ．Alignment 0f amino acid驿qu凹ce of f~ ment A and B with thoe~e of Arabidopsls chloroplast ATPase sulmnit
HI and Pisum 蛳t“qm ADC respectively
No．hem杂交分析表明．黄瓜花
打顶后，A基因的表达减弱甚至不表
达，而B基因的表达增加 【图2)，
表明ADC的同源基因和ATPase亚摹
lIl的同源基因可能分别为黄瓜花打
顶的正调控和负调控基因：
3 讨论
黄瓜花打顶幼茎的节问长度、直
径、茎纤维细胞的长度和韧皮细胞的
-．,ul--A 一 ·__—圉 m -—‘一
图2 黄瓜正常生长和花打顶中片段^和B的Northern杂交结果
1 正常；2 花 顶，
Fig．2 Northern blnt analysis po~tive fragments A and B in normal
and“bloted with blo~om”cuctmher
1 Norma[：2 Blunted with -In ⋯
直径均显著减小，但由于节间长度／细胞长度 (正常 ，花打顶 121)和茎粗／细胞直径 (正常2O，
花打顶J8)未明显减少，因此，花打顶黄瓜顶端幼茎节间细胞分化所受的影响可能不大，主要是节
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间细胞的伸展和伸长受到了抑制而导致节间缩短，茎变细。另外，花打顶幼茎中的维管束的数量和维
管束中具有次生增厚的导管的数目显著增加，茎厚角组织中细胞的细胞壁也显著增厚 (图版 I)，说
明这些组织细胞的发育进程明显加快，即细胞早熟或早衰。细胞壁的增厚，一方面增加了茎的机械强
度，使茎变硬，另一方面也降低了细胞壁的延展性，进而限制了茎细胞的伸展和伸长 ⋯¨。
由于芽顶端分生组织是植株新生细胞和茎、叶、花等各种器官形成的源点 ，花打顶后节数的
减少必然与顶端分化能力有关。扫描电镜观察后发现，花打顶植株的顶端分生组织体积减小 (图版
I)，可能会缩短植株的营养生长期 引¨。对细胞结构的分析表明花打顶后，顶端分生组织细胞内出现
了大的液泡，质体、核和液泡的膜部分降解，观察不到清晰的内质网 (图版II)，证实顶端分生组织
细胞的分化能力降低，因而花打顶后原基的分化数量相对减少，与周围原基相比，顶端分生组织的染
色较浅 (图版II)。同时，近顶端分生组织的茎细胞的分化和伸长也可能受到抑制，而导致花打顶顶
端的各种原基簇生。因此，黄瓜花打顶的调控因素一方面抑制了细胞的分化，另一方面阻碍了已分化
细胞的生长和发育，从而黄瓜植株失去了顶端生长优势，即黄瓜由无限生长转化为有限生长。但花打
顶后植株因何突出花器官的发育是有待深入研究的关键所在。
利用mRNA差异显示技术得到了正常和花打顶之间的阳性差异基因片段，其中两个片段分别与
叶绿体ATPase(F．ATPase)亚基II和精氨酸脱羧酶 (ADC)基因高度同源。Northern杂交分析表明
这两个基因片段分别属黄瓜花打顶中的正、负调控基因，即黄瓜花打顶后，F．ATPase亚基II的同源
基因的表达明显减弱，而 ADC的同源基因的表达增强。但F．ATPase亚基 II和ADC的表达是否有相
应的变化，从而导致A1P的合成与转换 ¨以及多胺的合成 ¨ 受¨到影响而在黄瓜花打顶的形成中
起作用，则需要进一步研究。
综上所述，黄瓜花打顶主要是由于顶端分生组织的分化能力降低而直接导致的，利用 mRNA差
异显示技术能够获得黄瓜花打顶中的正、负调控基因片段。但是黄瓜花打顶是一种涉及多种诱导因素
的复杂的生理异常现象，为从根本上解决生产中存在的这一问题，可能有多个基因参与的基因调控网
络尚需大量深入细致的研究工作。
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园 艺 学 报 31卷
圉版Ⅲ说8月：正常和鞋打顶黄瓜顶端丹生组烈的电链l刳片 A c Il：霄顶端分牛组织细胞． ．D 花打厦的顶端抒生组织细胞
CW：细咆壁：M；线拉体：ER：内质婀：P：前质体：、K：转塍；cH：昂 色匝：Va：液泡 中箭失斩示睦降解部位
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《中国主要蔬菜抗病育种进展》
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奉{j是一部集全国蔬菜遗传育种和髓物病理专家在开J砖 蔬菜新品种选育研究”国家重点 题中． 结全国IO余
年的研究成果，缩写的中国占部有关主要蔬菜抗犄育种理沦 技术的著作 内容包括臼菜、番茄 黄瓜、辣 (甜)椒
廿蓝的病毒、真菌和细葡病害20种．涉及毒源、菌源受其株系和生理小种的牲定方法和鉴定结果．人[接种抗病性鉴
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