全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园　艺　学　报　2001 , 28 (1) : 80～82
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2000 - 06 - 23 ; 修回日期 : 2000 - 10 - 08
基金项目 : 甘肃‘九七’重点农业科技攻关资助项目 (GK97122222A21)3 通讯联系人。
超声波辅助发根农杆菌对黄瓜遗传转化的影响
姚春娜　王亚馥 3
(兰州大学干旱农业生态国家重点实验室 , 兰州 730000)
摘　要 : 由于超声波处理可增加农杆菌与外植体之间的接触面积 , 提高农杆菌对外植体的转
化频率。本试验用野生型发根农杆菌A4菌株感染黄瓜无菌苗的子叶和下胚轴 , 建立了黄瓜的发根
遗传体系。并对超声波处理时间、外植体放置方向、预培养时间、外植体类型、乙酰丁香酮等影响
因素进行了优化。
关键词 : 农杆菌 ; 黄瓜 ; 超声波 ; 转化 ; 发根
中图分类号 : S 603.4 ; S 642. 2 　文献标识码 : A 　文章编号 : 05132353X (2001) 0120080203
1 　目的、材料与方法
超声波被用来辅助提高农杆菌对植物的转化率 , 在一些植物上取得成功〔1〕, 并在大豆上证
明超生波辅助发根农杆菌 (Sonication2assisted Agrobacterium2mediated transformation , SAAT) 处理
是由于在目标材料的表层和深层 , 超声波的空化效应连续造成瞬间高压 , 不断冲击材料表面 ,
造成微损伤 , 扩大了农杆菌的感染部位 , 从而提高了转化频率。
作者研究 SAAT 对黄瓜的遗传转化的有关影响因素 , 并优化转化条件 , 从而为建立黄瓜的
遗传转化体系奠定基础。
将黄瓜 ( Cucumis sativas L. ) ‘新泰密刺’种子常规消毒后接种在无激素的 1/ 2MS 培养基
上 , 置于 2 000 lx , 16 h 光照、8 h 黑暗、25 ℃条件下发芽并长成无菌苗 , 两片子叶完全展开时
取材。发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogens) A4 挑单菌落接种至液体 YMB 培养基中 , 于 28 ℃、
120 r/ min 振荡培养 30 h , 至 OD600值为 0. 6 , 菌悬液稀释 4 倍。子叶和下胚轴切段分别放在
50 mL 三角瓶中 , 取稀释后的菌悬液 20 mL 加入三角瓶 , 感染 15 min。同时将三角瓶浸于超声
波洗器 (功率 500 W , 工作频率 50 KHz) 中央 , 秒表计时。SAAT 处理后 , 取出材料并吸干 ,
放入共培养基中 , 3 d 后将外植体用无菌水冲洗数次 , 转移至附加头孢霉素 (Cef) 400 mg/ L 的
MS无激素培养基上。15 d 后将发根切下 , 进行增殖与选择性培养 , 每隔3 周继代1 次 , 头孢霉
素浓度逐渐降低 , 直至取消。
为了提高转化频率 , 分别从以下几个方面优化条件 : (1) 超声波处理时间 : 将未预培养的
黄瓜外植体进行 SAAT 处理 , 超声波处理时间分别为 0、2、5、10 s ; (2) 预培养时间 : SAAT 处
理之前将材料接种在NAA 0. 5 mg/ L + 62BA 2 mg/ L 的培养基上 , 预培养 3、4、5 d , 超声波处理
时间为 2 s ; (3) 乙酰丁香酮 (acetosyriugone AS) 作用 : 预培养与共培养期间对预培养 4 d , 超
声波 2 s 和 5 s 的材料进行添加或不添加AS处理 ; (4) 外植体放置方向 : 将预培养 4 d , 超声
波处理 2 s 的子叶上表皮分别做向下和向上放置处理。
将毛状根捣碎离心 , 取上清液按 Ellis 等〔2〕的方法检测农杆碱。
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2 　结果与分析
2. 1 　黄瓜发根农杆菌转化体系的建立　发根农杆菌A4 菌株感染黄瓜外植体切段后 , 在外植体
的切口处和其他部位产生颗粒状白色突起 , 并陆续生根。10 d 时 , 从愈伤组织上长出许多毛状
根 , 生根点最多达 7 个。毛状根丛生 , 部分向上生长。而对照的外植体中 , 子叶几乎无生根 ,
只有极少数下胚轴生根 , 且生根缓慢 , 根纤细 , 只向下生长。将诱导的发根切下进行继代培
养 , 转化根持续生长 , 表现出具有激素自主性生长能力 , 并且形成很多分枝侧根 (图 1) , 生长
发育十分旺盛 , 而正常未转化根不能在无激素的MS 培养基上生长 , 继代两次后逐渐死亡。对
已继代 4 次生长旺盛的发根进行农杆碱检测表明 , T2DNA 编码的农杆碱合成酶基因已在黄瓜基
因组中表达 (图 2) 。
图 1 　在 MS培养基上发根
Fig. 1 　Hairy root cultures on MS medium
图 2 　黄瓜毛状根的检测
Fig. 2 　Detection of agropine in hairy roots
of Cucumis sativus
Lane 1. agropine ; lane 2～3. Hairy roots ; lane 4. control
2.2 　SAAT 处理对发根诱导频率的影响　超声波处理对发根诱导频率有明显的促进作用 (图
3) , 未处理的对照子叶和下胚轴发根生成率分别为 21. 1 %和 2. 7 % , 而处理 2 s 的分别为 54.
1 %和 33. 4 % (P < 0. 01) 。SAAT 处理造成微损伤而扩大了农杆菌接触面积。从发根着生部位也
图 3 　超声波处理、预培养时间、AS和外植体方向对发根诱导频率的影响
Fig. 3 　Effect of sonication , preculture time , acetosyringone and explant orientation on frequency of hairy root formation
181期　　　　　　　　姚春娜等 : 超声波辅助发根农杆菌对黄瓜遗传转化的影响　　　　　　　　
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可看出 , 未经 SAAT 处理的材料只在切口处生出发根 , 而经 SAAT 处理的材料则在其它多个部
位均可发根。当超声波处理超过 10 s 时 , 转化频率又下降 , 并有 25 %的子叶在几天之后白化死
亡 , 这可能是由于处理时间过长 , 造成DNA 损伤所致。
2. 3 　预培养时间对发根的影响　将黄瓜外植体进行不同时间的预培养 , 结果表明 , 预培养 4 d
效果最好 (0. 05 > P > 0. 01 , 图 3) 。由于 T2DNA 整合进入寄主细胞需要 DNA 的合成〔3〕, 在适当
的植物激素的作用下 , 黄瓜组织块启动细胞分裂 , 而处于 DNA 合成和细胞分裂高峰期的外植
体较易进行外源DNA 的导入和整合 , 从而促进发根的诱导。
2. 4 　AS对发根的影响　SAAT 处理后 , 在含有和不含有AS的共培养基上进行共培养 , 结果表
明两者差异不显著 (P > 0. 05 , 图 3) 。Sarmento〔2〕同样发现 , AS对通过农杆菌进行的黄瓜转化没
有明显影响。
2. 5 　外植体方向对发根诱导频率的影响　在发根切下之前 , 子叶上表皮向下的诱导频率明显
高于向上的频率 , 发根诱导频率高达 94. 2 % , 两者差异显著 (P > 0. 01 , 图 3) 。
此外 , 本实验结果还表明 , 子叶的诱导频率要高于下胚轴的诱导频率 (图 3) 。
本文报道了一种改进的提高农杆菌转化频率的方法 , 黄瓜未成熟子叶和下胚轴经 SAAT 处
理 , 均有较高的转化频率 , 这为进行黄瓜转基因研究提供了新的途径。
参考文献 :
1 　Santarem H K, Trick J S , Finer J J . Sonication2assisted Agrobacerium2mediated transformation of soybean immature cotyledons : optimiza2
tion of transient expression. Plant Cell Reports , 1998 , 17 : 752 - 759
2 　Ellis D , Roberts D , Sutton B , et al . Transformation of white spruce and other conifer species by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell
Rep. , 1989 , 8 : 16 - 20
3　Sarmento G G, Alpert K, Tang F A , et al . Facters influencing Agrobacterium tumefaciems mediated transformation and expression of
kanamyoin resistance in pickling cucumber. Plant Cell , Tissue and Organ Culture , 1992 , 31 : 185 - 193
Sonication2assisted Agrobacterium2mediated Transformation of Cucumber
Yao Chunna and Wand Yafu
( The State key Laboratory of Arid Agroecology , Lanzhou University , Lanzhou 730000)
Abstract : Sonication2assisted Agrobacterium2mediated transformation (SAAT) tremendously improves the efficiency of
Agrobacterium infection by introducing large numbers of microwounds into the target plant tissue. Cotyledon and hypocotyl seg2
ments of cucumber were transformed by Agrobacterium rhizogenes A4. We evaluated the effects of the duration of sonication
treatment , length of explant preculture , addition of acetosyringone (AS) and the orientation of the explants during the co2
cultivation on cucumber transformation.
Key words : Agrobacterium rhizogenes ; Cucumis sativas L. ; SAAT ; Transformation hairy root
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