全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2004 , 31 (5) : 670～672
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 01 - 12 ; 修回日期 : 2004 - 04 - 01
基金项目 : 高等学校博士点科研基金项目 (20030307021) ; 国家“863”计划项目 (2003AA207120)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail : hxl @njau1edu1cn)
白菜β2103 - 葡聚糖酶基因 cDNA的克隆及序列分析
王彦华1 ,2 　侯喜林1 3 　史公军1
(1 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 , 南京 210095 ; 2 河北农业大学园艺学院 , 保定 071001)
摘 　要 : 以白菜抗霜霉病品种‘雪克青’cDNA 为模板 , 采用 RT2PCR 技术 , 获得了 1032 bp 的β- 103
- 葡聚糖酶基因的 cDNA 序列。序列分析表明 , 克隆的β- 103 - 葡聚糖酶基因 cDNA 序列编码 343 个氨基
酸 , 与芜菁 bg1 基因具有 98 %的同源性 , 与拟南芥 bg2 基因具有 84 %的同源性。在 GenBank 中登录号为
A Y395720。
关键词 : 白菜 ; 霜霉病 ; PR 蛋白 ; β- 103 - 葡聚糖酶基因
中图分类号 : S 63413 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2004) 0520670203
Cloning and Sequence Analysis of Beta21032glucanase Gene cD NA in Brassica
campest ris ssp. chinensis
Wang Yanhua1 ,2 , Hou Xilin1 3 , and Shi Gongjun1
(1 N ational Key L aboratory of Crop Genetics and Germ plasm Enhancement , N anjing A gricultural U niversity , N anjing
210095 , China ; 2 College of Horticulture , Hebei A gricultural U niversity , B aoding 071001 , China)
Abstract : The beta21032glucanase gene cDNA sequence were cloned using RT2PCR with cDNA isolat2
ed from B rassica cam pest ris ssp . chi nensis‘Xuekeqing’, which displayed resistances to downy mildew.
Sequencing result indicated that cloned fragment of beta21032glucanase gene encode a peptide containing 343
amino acids. The further comparison to turnip beta21032glucanase ( bg1) gene and A rabi dopsis thaliana
beta21032glucanase ( bg2) gene showed that identity was 98 % and 84 % , respectively. As a result , the se2
quence was accepted and released by GenBank (accession number A Y395720) .
Key words : B rassica cam pest ris ssp . chi nensis Makino ; Downy mildew ; Pathogenesis2related pro2
teins ; Beta21032glucanase gene
1 　目的、材料与方法
植物在受到病原菌侵染后会积累一些新的蛋白质 , 被称为病程相关蛋白 (pathogenesis2related
proteins) , 简称 PR 蛋白。烟草中已报道了 5 大类至少 14 种 PR 蛋白 , 部分 PR 蛋白性质已经比较清
楚。PR22 蛋白中已经鉴定出 4 种血清学相关的 PR 蛋白 , 具有β- 103 - 葡聚糖酶活性。β- 103 - 葡
聚糖酶一方面和几丁质酶协同作用抑制真菌生长 , 另一方面可以从寄主或病原物细胞壁释放出葡萄糖
片段作为信号分子 , 激发寄主的防卫反应〔1〕。现已从烟草、番茄、拟南芥、水稻、大麦、小麦、玉
米、马铃薯等植物中克隆了几十个β- 103 - 葡聚糖酶基因〔2〕, 成为植物抗性改良基因工程中非常重
要的基因资源。
白菜 ( B rassica cam pestris ssp. chinensis Makino) 霜霉病是由专性寄生菌 ( Peronospora parasitica
Pers. Fr) 引起的破坏性极强的病害 , 选用抗病品种是解决这一病害的最有效途径。本研究参照已发表
的芜菁β- 103 - 葡聚糖酶基因序列设计特异引物进行 RT2PCR扩增 , 获得了白菜β- 103 - 葡聚糖酶基因的
cDNA 序列 , 并对其进行序列分析 , 为进一步探讨白菜抗霜霉病分子机制奠定基础。
供试材料为白菜抗病品系‘雪克青’, 由南京农业大学白菜课题组提供。将种子播种于装有灭菌
基质的穴盘中 , 在人工气候箱中培养 (光照 12 h , 黑暗 12 h , 20～25 ℃) 。待幼苗长至两片真叶时接
种霜霉病菌 , 于接种后 48 h 提取叶片 RNA。
采用 TRIZOL (MD Bio) 法提取总 RNA。通过 1 %琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性。
特异引物设计参照已发表的芜菁 bg1 基因序列 (Accession number , X77990) , 上游引物位于 +
30～ + 49 : 5pi2A TGTTA GCA TCA TCACCAA T23pi, 下游引物为 + 1039 ～ + 1058 的反向序列 : 5pi2
TTA GTTAAACTTAACACCA T2 3pi, 预期片段为 1029 bp 的 bg1 的编码序列 (CDS) 。RT 反应参照大
连 Ta KaRa 生物公司的 Ta KaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 211 试剂盒说明书进行。以单链 cDNA 为
模板进行 PCR 扩增 , PCR 反应体积为 20μL , 其中含有 1 ×PCR Buffer , 50 ng 模板 cDNA , 200μmol
·L - 1dN TPs , 210 mmol·L - 1 MgCl2 , 015μmol·L - 1特异引物 , 1 U Taq 酶 , 反应在 PTC2100 PCR 仪
上进行。扩增程序为 : 94 ℃3 min , 1 个循环 ; 94 ℃30 s , 55 ℃1 min , 72 ℃1 min 30 s , 30 个循环 ;
72 ℃10 min ; 4 ℃保存。扩增产物在 115 %琼脂糖凝胶中进行电泳 , UVP 凝胶成像分析系统进行拍照
及分析。
扩增的特异片段按照 Vitagene DNA 凝胶回收试剂盒 (genebase 公司) 的使用说明进行回收。回
收的目的 DNA 片段连接到 pMD 182T 载体 ( Ta KaRa) 上。连接产物转化感受态大肠杆菌 J M109 , 涂
布于含 Amp (100μg·L - 1) 、IPTG、X2gal 的 LB 平板上。37 ℃培养 12～14 h 后进行蓝白斑筛选。挑
取白斑接种于 3 mL LB (含 100μg·L - 1氨苄青霉素) 液体培养基中。37 ℃200 r·min - 1振荡培养过
夜。参照文献 〔3〕的方法提取质粒。取纯化质粒 1μL (50 ng) 作为模板 , 用上述特异引物在相同条
件下进行 PCR 扩增 , 琼脂糖凝胶电泳检测插入片段的大小。
序列测定由上海申能博彩生物科技公司在 AB I 377 测序仪上进行 , 相似性比较在 NCB I 站点上用
BLAST 完成。开放阅读框 (ORF) 在 NCB I 站点上用 ORF finder 进行分析。
2 　结果与分析
211 　总 RNA的提取
采用 1 %琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性。
从图 1 可以清晰地看到 28 S 和 18 S rRNA 两条主
带 , 跑在最前面的 5 S rRNA 也隐约可见。以上
结果说明利用 TRIZOL 试剂提取的总 RNA 纯度
较高 , 无明显降解 , 其完整性符合试验要求。
正常情况下 ,β- 103 - 葡聚糖酶在植物体内
只有低水平的组成型表达 , 植物在病原真菌入侵
后β- 103 - 葡聚糖酶在细胞内积累增加〔2〕。有报
道青花菜在接种霜霉病菌后 3 d , 其体内的β2103 - 图 1 　总 RNA的琼脂糖电泳Fig. 1 　Electrophoresis of total RNA
葡聚糖酶活性达到最高〔4〕, 但编码蛋白的 mRNA 的高峰应早于酶活性高峰 , 故接种霜霉病菌后 48 h
提取叶片总 RNA。
212 　白菜β- 103 - 葡聚糖酶基因 cD NA的 RT2PCR扩增
以‘雪克青’白菜接种霜霉病菌后 48 h 的 cDNA 为模板 , 利用一对特异引物进行 PCR 扩增 , 同
时以未转录的 mRNA 为模板设置对照。从图 2 中可见 , 接种后 48 h 的材料中扩增出了一条约 1 kb 的
条带 , 而对照则无扩增产物。
213 　重组质粒的 PCR鉴定
PCR 产物纯化后与 pMD 182T 载体连接 , 连接产物转化感受态大肠杆菌 J M109 , 蓝白斑筛选后 ,
176　5 期 王彦华等 : 白菜β2103 - 葡聚糖酶基因 cDNA 的克隆及序列分析 　
以纯化的阳性重组质粒为模板 , 以相同的引物在同样的条件下进行 PCR 扩增。从图 3 中可以看出 ,
重组质粒 PCR 产物与目的片段大小完全相同 , 表明目的片段已克隆成功。
图 2 　RT2PCR产物的电泳结果
M : λDNA/ EcoR Ⅰ+ Hind Ⅲ; 1. 对照 ;
2. 接种霜霉病菌后 48 h 总 RNA 的 RT2PCR 产物。
Fig. 2 　Electrophoresis analysis of RT2PCR product
M : λDNA/ EcoR Ⅰ+ Hind Ⅲ; 1. Control ; 2. RT2PCR product of
total RNA isolated at 48 h after inoculation with P. parasitica .
图 3 　重组质粒的 PCR分析
M : λDNA/ EcoR Ⅰ+ Hind Ⅲ; 1 , 2. 重组子的 PCR 产物。
Fig. 3 　PCR analysis of the recombinant plasmids
M : λDNA/ EcoR Ⅰ+ Hind Ⅲ;
1 , 2. PCR products of recombinant plasmids.
214 　白菜β- 103 - 葡聚糖酶基因 cD NA序列的分析
阳性克隆经过双向测序 , 得到了一个由 1032 个核苷酸组成的β- 103 - 葡聚糖酶基因 cDNA 序
列。利用 NCB I 站点的 ORF finder 进行 6 种可能的框架分析发现 , 该 cDNA 片段包含一个完整的编码
序列 (1～1029) , 编码 343 个氨基酸。BLAST 分析结果 , 该序列与芜菁β - 103 - 葡聚糖酶基因
( bg1) cDNA序列的同源性为 98 % , 氨基酸序列的同源性为 96 % ; 与拟南芥β- 103 - 葡聚糖酶基因
(Accession number M 90509、M58462) cDNA 序列的同源性为 84 % , 氨基酸序列的同源性为 61 %。
与甜橙β- 103 - 葡聚糖酶基因氨基酸序列的同源性为 56 % , 与李、大豆、葡萄、烟草的同源性在
50 %～55 % , 而与马铃薯、番茄、水稻的同源性为 48 %。将该 cDNA 序列提交 GenBank , 登记号为
A Y395720。
参考文献 :
1 　王金生. 分子植物病理学. 北京 : 中国农业出版社 , 1999. 217～219
2 　邢全华 , 王　斌. 植物葡聚糖酶基因抗病作用的研究进展. 遗传 , 2002 , 24 (6) : 715～720
3 　Gaspero G D , Cipriani G. Resistance gene analogs are candidate markers for disease2resistance genes in grape ( V itis spp . ) . Theor. Appl.
Genet . , 2002 , 106 : 163～172
4 　Ziadi S , Barbedette S , Godard J F , et al. Production of pathogenesis2related proteins in the cauliflower ( B rassica oleracea var. bot rytis) 2
downy mildew ( Peronospora parasitica) pathosystem treated with acibenzolar2S2methyl. Plant Pathology , 2001 , 50 : 579～586
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