全 文 ：第 19 卷
第 5 期

Vol. 19
No. 5
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2011 年
9 月

Sep.

2011
ISSR标记的早熟禾遗传多样性分析
赵桂琴* , 刘
欢, 刘
美
(甘肃农业大学草业学院, 兰州
730070)
摘要 :利用 ISSR分子标记技术对早熟禾属(P oa L . ) 6 种共 31 份种质材料进行遗传多样性分析 ,以期了解不同早
熟禾种质材料之间的遗传差异,为早熟禾资源的保护、品种选育和分子鉴定提供理论依据。结果表明: 早熟禾属种
质间存在丰富的遗传多样性, 6 个 ISSR 引物共扩增出 111 条清晰谱带, 平均多态性比率( PPB )为 97. 79% , Nei
s
基因多样性指数(H )为 0. 4239, Shannon 信息指数( I )为 0. 6137; 31 份材料间的遗传相似系数 (GS )为 0. 4146~
0
9512; 通过 UPGMA 分子系统聚类法, 将 31 份种质材料分为 6个大类群, 其中高山早熟禾( Poa alp igena L. )与
其他材料间的遗传分化最大,单独聚为一类, 7 个美国的草地早熟禾(P oa p ratensis L . )品种聚为一类, 聚类结果呈
现出一定的地域性分布规律。本研究探讨了早熟禾属种质间亲缘关系及遗传多样性, 为其进一步研究与利用提供
了分子水平的依据。
关键词:早熟禾; 种质资源; ISSR; 遗传多样性
中图分类号: Q346



文献标识码: A




文章编号: 1007-0435( 2011) 05-0781-06
ISSR-based Genetic Diversity Analysis of Poa L.
ZHAO Gu-i qin
*
, LIU Huan, LIU M ei
( College of Grassland Science, Gansu Agricultural University, Lanzh ou , Gan su Provin ce 730070, C hina)
Abstract: T he genet ic diversity of 31 Poa L. accessions ( 6 species) w as analyzed using ISSR marker s, in
order to understand genet ic differ ences among Poa L. germplasm and pr ovide reference for germplasm re-
source pro tection, breeding and mo lecular ident ificat ion . Results indicated that there w as abundant g enet-
ic diversity in Poa germplasm. T otal 111 bands w er e detected by 6 pr imer s, and the percentag e o f poly-
morphic bands ( PPB) w as 97. 79%. Nei
s g ene diversity index ( H ) w as 0. 4239; the Shannon diversity
index ( I ) w as 0. 6137. The genet ic similarity ( GS) among 31 accessions w as 0. 4146~ 0. 9512. T he 31 ac-
cessions w ere classif ied into 6 major groups based on UPGMA cluster analysis. Poa alp igena L. had the
highest genet ic dif ferent iation and clustered a unique g roup. Seven Amer ican accessions of Poa p r atensi s
L. w ere classif ied into one g roup. The accessions fr om same orig in w ere classif ied into the same group in-
dicat ing the geogr aphical dist ribut ion of g enetic div er sity. The genet ic relat ionships and div ersities among
Poa germplasm w ere also discussed for future research and applicat ion of Poa germplasm at the mo lecular
lev el.
Key words: Poa L. ; Germplasm; ISSR; Genet ic diversity


早熟禾属 ( Poa L. )是禾本科早熟禾族中较大
的一个属,全世界约有 500种,多分布于温带与寒带
地区。属内植物多具有繁殖能力强、再生性好、生长
年限长、耐旱、耐寒、返青早、绿色期长等特点 [ 1] , 不
少种是天然草原的群落组分和优良的牧草, 也有不
少是各类草坪和绿地的重要成员。我国蕴藏着十分
丰富的早熟禾资源, 大约有 100种,主要分布于我国
华北、西北、东北地区及长江中下游冷湿地[ 2, 3]。目
前世界范围内研究较多的有草地早熟禾( Poa p r at-
ensis L. )、一年生早熟禾( Poa annua L. )及硬质早
熟禾 ( Poa sphondy lod es T rin. )、加拿大早熟禾
( Poa comp r essa L)、冷地早熟禾( Poa crymophi la
Keng . )等及其他种的早熟禾 [ 4, 5]。国内对早熟禾的
研究主要针对品种引种的适应性、建植管理和抗性
收稿日期: 2011-03-17;修回日期: 2011- 07-15
基金项目:农业行业科研专项( 201003023) ;农业部牧草种质资源保护项目( 090401)资助
作者简介:赵桂琴( 1970- ) ,女,甘肃天水人,博士,教授,主要从事牧草种质资源及育种方面的研究, E-mail: z haog07@ yah oo. com; * 通信
作者 Author for correspondence
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生理等阶段[ 6~ 8] ,明显落后于国外。由于我国现有
的草地早熟禾栽培种均为引进种, 对其生物学特性、
遗传学背景缺乏确切了解,因此,从分子生物学角度
对其开展研究十分必要。
早熟禾不同材料在形态特征上差异很小, 受环
境影响较大,单纯通过表型来研究其遗传关系及对
育种材料的筛选不仅费时费力而且可靠性也较低,
而分子标记方法不仅可以了解到植物遗传背景信
息,还可以深入了解其遗传多样性, 而且耗时少, 可
靠性更高。ISSR ( Inter-simple sequence repeat )标
记结合了 SSR和 RAPD的优点, 具有多态性高、模
板需要量少、无需试剂盒、试验成本低、操作简单、试
验稳定性较高等优点 [ 9] , 在很多物种种下及种间水
平遗传多样性的检测、种间或属间遗传关系的讨论、
以及遗传图谱的构建等方面发挥了重要的作用。国
内早熟禾种质资源遗传标记水平研究主要以同功酶
和 RA PD为主,而无其他分子标记的报道[ 10, 11]。本
研究利用 ISSR分子标记, 对搜集的 31份早熟禾材
料进行遗传多样性分析,了解早熟禾种质资源的遗
传背景及遗传多样性水平, 研究不同材料之间的遗
传差异, 为早熟禾资源的的保护、引种驯化、繁育栽
培和分子鉴定提供理论依据。
1
材料与方法
1. 1
试验材料
试验材料选用来自美国的 18 份草地早熟禾品
种及甘肃、青海、宁夏等地的早熟禾种质材料共计
31份,具体来源见表 1。材料种植均采用穴盘育苗
的方法, 幼苗期剪取叶片,用改良 CTAB( Cetyl Tr-i
ethyl Ammonium Bromide)法提取植物总 DNA [ 12]。
表 1
供试材料
Table 1
Experimental materials
序号
No.
种名
Sp ecif ic name
拉丁名
Lat in nam e
品种名
Variet ies
来源


S ou rce


1 华灰早熟禾 Poa sing olauca Ohwi 宁夏 Ningxia
2 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. 甘肃 Gansu
3 硬质早熟禾 Poa sp hond ylod es L. 宁夏 Ningxia
4 硬质早熟禾 Poa sp hond ylod es L. 宁夏 Ningxia
5 高山早熟禾 Poa alp igena L. 宁夏 Ningxia
6 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. Bluechip 美国 America
7 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. Danni 美国 America
8 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. Nuglade 美国 America
9 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. Rugb y2 美国 America
10 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. Storpy 美国 America
11 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. M engma 美国 America
12 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. 四季青 美国 America
13 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. Sida 美国 America
14 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. M idnight 美国 America
15 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. Barzan 美国 America
16 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. 甘肃 Gansu
17 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. mingyue 美国 America
18 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. 美国 America
19 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. 甘肃 Gansu
20 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. Youmei 美国 America
21 冷地早熟禾 Poa cry mop i la K eng. 甘肃 Gansu
22 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. Priz e 美国 America
23 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. 甘肃 Gansu
24 中亚早熟禾 Poa li tw inow iana Ovez. 甘肃 Gansu
25 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. M erit 美国 America
26 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. 美国 America
27 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. Bar on 美国 America
28 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. 甘肃 Gansu
29 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. 甘肃 Gansu
30 草地早熟禾 Poa pr atensi s L. Park 美国 America
31 冷地早熟禾 Poa cry mop i la K eng. lkone 青海 Qinghai
782
第 5期 赵桂琴等: ISSR标记的早熟禾遗传多样性分析
1. 2
早熟禾 ISSR 反应体系的优化建立及引物
筛选
基于 ISSR 标记在鸭茅 ( D acty li s g lomer ata
L. ) [ 13]、黑麦草( L olium p er enne L. ) [ 14] 等禾本科植
物的研究报道。本研究根据加拿大哥伦比亚大学公
布的 100个引物序列中选出 48个引物进一步筛选
用于早熟禾 ISSR-PCR反应。利用正交设计, 对影
响 ISSR 反应体系的主要因素( M g2+ , dNT P, Taq
酶)从 4 个水平上进行筛选和优化, 建立了重复性
好、反应稳定的早熟禾 ISSR 反应体系: 25
L 反应
体系中 1. 25 U T aq酶, 1. 5 mmol
L- 1 Mg 2+ , 10

PCR Buffer 2. 5
L, 0. 4 mmo l
L- 1 dNTP, 1
L
引物, 1
L DNA 模板。扩增程序为: 94
预变性
3 m in; 94
变性 30 s, 56. 4
退火 30 s, 72
延伸
1 m in,循环 35 次; 72
延伸 7 min, 4
保存。
1. 3
PCR扩增及电泳检测
PCR扩增在 Thermo Hybaid PCR 仪上进行, 扩
增产物 1. 5%琼脂糖凝胶电泳, 然后用含 0. 1% EB
(溴化乙锭)染色,最后用紫外成像系统照相并分析。
1. 4
数据统计及分析
ISSR电泳图谱记录后进行人工读带, 以100 bp
DNA 作为相对分子量标准,选择清晰可辨的电泳条
带,在相同片段位置上的条带有则记为
1
, 无则记
为
0
,生成 0/ 1 原始数据矩阵。用 POPGEN E 32
计算多态位点百分率( P)、等位基因数( A )、有效等
位基因数 ( N e )、基因多样性指数( H )、Shannon 信
息指数 ( I ) ;利用 NT SYS-PC ( Version 2. 10e)分析
软件进行聚类分析, 对原始数据矩阵用 Sim ilar ity
程序-Q ualitat ive data, 进行遗传相似系数计算, 应
用 Clustering 中 SNA N 程序的非加权配对算术平
均法( U PGMA )进行聚类分析; 最后在 Graphic 中
的 T ree plo t程序下生成树状聚类图。
2
结果与分析
2. 1
多态性分析
本研究按照最优反应体系及程序最终筛选出 6
个稳定性和重复性好、多态性较高且条带清晰的引
物, 用于 31份早熟禾材料的扩增。由表 2可知, 6
个引物中( AC) n 有 4 条, ( AG) n 和( CA) n 各 1 条,
说明早熟禾基因组中存在大量的( AC)二核苷酸重
复序列。6个引物共扩增出 111条清晰谱带, 大小
在 200~ 3500 bp 之间。其中 UBC 835 条带最多,
为 23条, UBC857扩增条带最少。平均每个引物扩
增出 18. 5条带, 平均多态性比率( PPB)为 97. 79%;
引物 U BC834 和 UBC857 的扩增产物多态性最丰
富, 图谱也最清晰(图 1)。31份早熟禾材料的多态
性高,遗传变异大, ISSR 标记能够揭示早熟禾基因
组较多的信息量。
表 2
ISSR分析所用引物序列和扩增结果
Table 2
Pr imer sequences and amplif ied r esults of ISSR analy sis
引物
Primer
序列
Sequ ence
扩增条带总数
T otal band number
多态性条带数
Polymorphic band number
多态性比率
Percentag e of polymorphic b and/ %
UBC 835 ( AC) 8CG 23 22 95. 65
UBC 856 ( AC) 8YA 20 20 100
UBC 857 ( AC) 8YG 12 11 91. 07
UBC 834 ( AG) 8YT 16 16 100
UBC 889 DBD( AC) 18 18 100
UBC 818 ( CA) 8G 22 22 100
2. 2
遗传相似系数分析
相似系数是用来比较群体或个体间相似程度的
度量参数,平均相似系数越高,则说明材料间相似程
度越大,遗传背景一致性越强。用 NT SYS-PC 软件
计算早熟禾种质间的 Jaccard 遗传相似系数, 共获
得 527个两两不同种质间的遗传相似系数。31 份
早熟禾两两之间遗传相似系数最高为 0. 9512(四季
青草地早熟禾与 Mengma 草地早熟禾之间) , 最低
为 0. 4146(中亚早熟禾与美国草地早熟禾 Danni之
间)。早熟禾的遗传距离变化范围为 0. 1301 ~
0
5080, 物种水平平均有效等位基因数 ( A e ) 为
1
7507, 平均期望杂合度 ( H pop )为 0. 4239, Shan-
non
s指数( I )为 0. 6137。表明各位点上遗传多样
性程度存在着较大的差别, 各位点的有效等位基因
数值大于 Shannon
s 信息指数, Shannon
s 信息指
数均大于基因多样度值。
783
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图 1
A和 B分别为引物 857 和 834 对 31份材料 DNA的 ISSR 扩增图谱
F ig. 1
A and B are ISSR fingerprints o f 31 DNA samples amplified by primers 857 and 834
注: M , 分子量标记;材料编号同表 1
Note: M : marker; Material No. is the same as show ed in table 1


对不同材料的种内与种间相似系数( GS ) 进行
比较分析,发现 31 份材料间遗传相似系数变幅较
大,主要是由于草地早熟禾、硬质早熟禾、华灰早熟
禾( Poa singolauca Ohw i)、高山早熟禾( Poa alp i-
gena L. )等均为不同的种, 种间遗传差异较大。在
不同种之间,华灰早熟禾与草地早熟禾、中亚早熟禾
( Poa l i tw inow iana Ovcz)与草地早熟禾的遗传相
似系数较高, GS 平均值分别为 0. 6760 和 0. 6643;
说明它们与草地早熟禾的遗传距离相对较近; 其次
为硬质早熟禾和冷地早熟禾。高山早熟禾与其他早
熟禾的遗传相似系数均相对较低, GS 平均值为
0
5946。就同一个种内的不同材料而言, 供试的 2
个硬质早熟禾种内遗传相似度为 0. 8537, 2 个冷地
早熟禾种内遗传相似度为 0. 8069。草地早熟禾种
内遗传变异较大, GS 为 0. 4878~ 0. 9512,最高值和
最低值相差 0. 46; 其中 18个美国草地早熟禾品种
间遗传相似度为 0. 5610~ 0. 9512, 甘肃 6个草地早
熟禾种内遗传相似度为 0. 5122~ 0. 8293。早熟禾
属植物不同种质材料在长期进化过程中因相互杂
交、基因漂流现象的存在, 形成了一定的遗传相似
性。但从相似系数来看, 一些种质材料不论是种间
还是种内均存在较大遗传距离, 相似系数较低, 31
份种源间遗传相似系数最低值为 0. 4146 , 说明这些
种质材料具有较高的遗传多样性。
2. 3
聚类分析
对 31个早熟禾材料的 ISSR数据进行聚类分析,
构建了早熟禾的 UPGMA 系统树(图 2)。从树状图
可以看出,所有供试材料若以遗传相似系数 0. 684为
分类界限,可以聚为 6大类。第
类由 6个材料组成,
分别为宁夏华灰早熟禾、甘肃野生草地早熟禾、宁夏
2个硬质早熟禾和美国 2个草地早熟禾品种;第
类
由 2个材料组成,分别为来自甘肃和青海的冷地早熟
禾,甘肃和青海地理位置很接近,生境比较相似,因此
同种早熟禾遗传距离也较近; 第
类全部为来自美国
的草地早熟禾,包括 Danni, Storpy, Mengma,四季青,
Sida, Midnight和 Barzan 共 7 个品种。第
类最多,
有 11个种质材料,这些材料在 0. 7185处可分为 3个
亚类,其中甘肃碌曲野生草地早熟禾自成一个亚类,
甘肃玛曲草地早熟禾与甘肃野生早熟禾为一个亚类,
其余草地早熟禾育成品种为一个亚类。第
类由 4
个材料组成,分别为中亚早熟禾、甘肃天祝草地早熟
禾、甘肃野生早熟禾与美国草地早熟禾 Rugby2。第

类仅高山早熟禾一个种。
784
第 5期 赵桂琴等: ISSR标记的早熟禾遗传多样性分析
图 2
31 份早熟禾基于 ISSR的遗传相似性 UPGMA聚类图
Fig . 2
UPGMA cluster analy sis based on ISSR genetic identities among 31 P oa L . mater ials


通过进一步分析可知, 第
大类包括华灰早熟
禾、草地早熟禾、硬质早熟禾,出现 3个种间交叉聚
类现象。第
类中草地早熟禾与中亚早熟禾交叉相
聚。2个冷地早熟禾及 2个硬质早熟禾在聚类图中
分别单独聚成亚类, 说明 ISSR 标记对划分种间或
亚种间的界线十分明显。第
类全部为来自美国的
草地早熟禾品种,表现出地域性规律,来自同一地区
的物种或来源相同的材料大部分聚到一起, 即种质
的聚类与地理位置的远近相关。高山早熟禾与其他
材料间的遗传分化最大, 单独聚为一类,从分子水平
说明了高原早熟禾的遗传特异性。
3
讨论与结论
利用 ISSR标记技术可以获得清晰且多态性高
的早熟禾电泳图谱, 筛选出的 6个引物可以将 31份
材料完全区分开,多数材料特征带明显,并且全部检
测工作可在8 h 内完成; 6条引物共扩增出 111条谱
带,平均每个引物扩增出 18. 5条带,扩增片断大小
为 200~ 3500 bp,多态性比例占 97. 79%。
国内有人用同工酶标记对早熟禾属植物进行了
物种鉴定及种间遗传距离分析[ 11] ,但效率远不及分
子标记。Renganayaki等 [ 15, 16]的研究中, 28 个早熟
禾材料共产生了 3756 个 AFLP 标记条带及 441 个
RAPD标记, 平均多态性检测率分别为 64. 11% 及
73. 71%; 宁婷婷 [ 17]用 25个 RAPD引物扩增出 218
条带,平均每个引物扩增出的条带为 8. 7条,多态性
条带比例为 89. 91% ,扩增片段 200~ 2000 bp,相似
性集中在 0. 6076~ 0. 9852。相比之下, ISSR 扩增
产物更能够检测到早熟禾具有较高的多态性条带比
率, 扩增片段大小范围较大,每个引物所得到的扩增
产物和多态性产物都比较多, 说明 ISSR 标记作为
一种快速有效的 DNA 指纹技术用于早熟禾遗传多
样性研究及不同材料的 DNA 水平识别是可靠的。
同时反映出早熟禾材料间遗传变异大、多态性较高,
这可能与早熟禾的繁殖授粉方式有关。早熟禾既可
进行有性生殖,也可进行无融合生殖, 自交率也比较
高, 因而材料间的遗传关系也变得错综复杂,这一点
在 Huff等 [ 18, 19]利用 RAPD标记确定草地早熟禾源
于兼性无融合生殖变异株的遗传起源研究中也有所
表明。
应用 Ne-i Li 相似系数法估算出 31份材料的遗
传系数为 0. 4146 ~ 0. 9512, 平均遗传相似系数为
0
7052, 18个美国草地早熟禾品种间的遗传相似系
数均在 0. 5610~ 0. 9512 之间, 遗传距离在 0. 3548
~ 0. 4986之间,表明早熟禾属不同材料间存在着丰
富的多态性。我国甘肃、宁夏、青海 3省的早熟禾遗
传基础广阔, 甘肃野生草地早熟禾间的遗传距离为
0
3312~ 0. 4369, 再一次验证了我国早熟禾种类具
有丰富的基因型及高度的异质性。


基于 ISSR 标记, 所有供试材料以遗传相似系
数 0. 684为分类界限, 可以聚为 6大类。聚类分析
785
草
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报 第 19卷
结果中种的分类与依据
中国饲用植物志
检索表按
形态学性状进行物种组、系、种划分的结果较为一
致[ 20]。基因型决定表现型,早熟禾的形态学特征和
分子标记的一致性在柴琦等 [ 21] 关于同工酶的研究
中也得到了印证。本研究结果还表明所有供试材料
中高山早熟禾与其他早熟禾差异明显, 据此认为高
山早熟禾是早熟禾属中独立的一个种, ISSR标记可
为早熟禾属植物的系统学研究提供更多的信息。其
次,研究中聚类组群的划分与早熟禾的生态地域性
有一定相关性; 相邻或相近地区的材料遗传差异较
小,亲缘关系较近。另外,在本研究中还出现来源于
同一地区的不同种聚在一起的现象,如来自宁夏华
灰早熟禾和硬质早熟禾聚为一类;还有来源于不同
地区的同一个种的材料聚在一起,如甘肃和青海的
冷地早熟禾。这是由于早熟禾属植物分布范围广,
生境条件复杂, 物种在长期适应环境的过程中会出
现某些趋同现象,造成不同种间的交叉。另外,引种
或当地的气候因子相近等原因也会使得遗传距离与
地理分布密切相关, 因而对属种及种下等级的划分,
要综合考虑形态学、细胞学和分子生物学等方面的
资料,才能更加有效地解释它们真实的系统关系, 这
与肖海峻等 [ 22] 对鹅观草( Roegner ia kamoj i Ohw i)
种质资源遗传多样性的研究结果一致。关于生物组
群的划分与生态地域的相关性,不同的标记方法得
到的结论并不完全一致。例如范彦[ 23] 对扁穗牛鞭
草( H emarthr ia al ti ssima Stapf )种质的 ISSR 聚类
分析呈现出一定的地域性分布规律; 孙群 [ 24] 利用
ISSR标记划分乌拉尔甘草( Gly cy r r hi z a ur alensis
Fisch)的组群与地域性没有明显关系。
总之,早熟禾种质资源由于其复杂的生殖方式,
经过长期自然选择,保持了较为丰富的遗传多样性和
适应性[ 25] ,为拓展早熟禾遗传资源, 早熟禾种质资源
研究、利用和发掘新种质提供了丰富的物质基础。
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李美娟)
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