全 文 ：第 17 卷 第 2 期
Vol. 17 No . 2
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2009 年 3 月
Mar . 2009
白羊草真叶愈伤组织诱导和植株再生
董宽虎, 于 娜, 程钰宏
(山西农业大学动物科技学院, 山西太谷 030801)
摘要:以 7 日龄白羊草( Bothr iochloa ischaemum ( L . ) Keng )真叶作为外植体, 进行愈伤组织诱导和植株再生研究,
筛选较合适的激素组合,以建立白羊草再生体系。结果表明: 在愈伤诱导阶段 KT 的作用明显,其与 2, 4D的交互
作用优于 ABA 与 2, 4D,也高于单独使用 2, 4D, 在 2, 4D1. 0 mg/ L+ KT 0. 5 mg / L 时诱导率最大, 达到 93. 45% ;
分化阶段 6BA0. 1 mg/ L 与 NAA 0. 04~ 0. 06 mg/ L 的激素组合中分化率差异不明显。
关键词:白羊草; 真叶; 愈伤诱导; 植株再生
中图分类号: Q943. 1 文献标识码: A 文章编号: 10070435( 2009) 02014104
Callus Induction and Plant Regeneration from
Euphyllas of Bothriochloa ischaemum
DONG Kuanhu, YU Na, CH ENG Yuhong
( College of Anim al Science and technology, Shanxi Agricul tu ral U niversi ty, T aigu, Shanxi Province 030801, China)
Abstract:The feasible hormone combinat ions w ere selected for callus induct ion and plantlet regener at ion of
Bothriochloa ischaemum ( L. ) Keng. using the 7day old euphyllas of as explants, in order to build plamt let
regenerat ion sy stem . The results show that the ef fect of KT w as in evidence on callous induct ion, the in
teract ion o f KT and 2, 4D was superior than that of ABA and 2, 4D or 2, 4D only. T he max imal callus in
duct ion rate reached 93. 45% when the callus induct ion medium supplemented w ith 1. 0 mg L
- 1
2, 4D and
0. 5 mg L
- 1
KT. When the callus w ere t ransferr ed to the medium containing 0. 1 mg L
- 1
6BA and 0. 04
0. 06 mg L - 1 NAA, the different iat ion f requency o f shoot w as not signif icant ly differ ent .
Key words: Bothriochloa i schaemum ( L. ) Keng; Euphy lla; Callus induct ion; Plant regener at ion
白羊草( Bothr iochloa i schaemum ( L. ) Keng )
是禾本科孔颖草属( Bothr iochloa kuntz e )多年生草
本植物 [ 1] ,是优良的牧草和水土保持植物,具有固土
保水、生活力强、高产耐牧、耐践踏、适口性强等优
点,是饲用价值较高的放牧型禾草之一,广泛分布于
我国暖温带落叶阔叶林地带, 是控制水土流失和维
持丘陵山地的原生态平衡的重要草种[ 2, 3]。
目前关于白羊草组培再生体系的研究较少, 20
世纪 90年代肖辅珍、时永杰等分别以白羊草成熟胚
和幼穗为外植体进行了研究 [ 1~ 4]。本试验以白羊草
真叶为材料,对不同诱导培养基对真叶切段愈伤组
织形成和再生苗的分化进行研究,以筛选出适宜的
激素组合,建立白羊草组培再生体系。
1 材料与方法
1. 1 材料
供试的材料为白羊草, 其种子于 2006 年 10月
采自山西省太谷县海拔1100 m 的凤山, 植被为喜暖
灌草丛类草地,建群种为白羊草,千粒重 0. 6975 g[ 5]。
1. 2 方法
1. 2. 1 白羊草真叶的预处理 取成熟、结构完整的
白羊草种子,拨去外稃,先用无菌水浸泡 10 min,去
除杂质并使其沉淀,然后用 75 %酒精浸泡 30 s ,用
无菌水冲洗 3次,再用0. 1 %升汞溶液消毒15 min,
无菌水冲洗3次,用滤纸吸干水渍。灭过菌的成熟种
收稿日期: 20080922;修回日期: 20081120
基金项目:国家科技支撑计划项目( 2007BAD56B01)和农业部公益性行业(农业)科研专项( nyhyz x07022)资助
作者简介:董宽虎( 1956 ) ,男,山西偏关人,博士,教授,博士生导师,研究方向为草地资源与草地管理, Em ail: dongkuanhu@ 126. com
草 地 学 报 第 17卷
子接种于仅含琼脂不含任何生长调节剂的培养基
上,培养温度 25 2 ,光照强度 2000~ 3000 Lx ,光
周期为 16 h/ d, 7 d后用消毒后的刀镊截取真叶(长
度 1. 0~ 1. 5 cm) , 接种于诱导愈伤培养基上, 30 d
后比较不同诱导培养基上的外植体的出愈数,
1. 2. 2 愈伤组织的诱导 将切取的真叶接种到添
加不同浓度 2, 4D、KT、ABA 激素组合 Y 1Y10愈伤
诱导培养基上, 每瓶 25 个真叶, 重复 3 次, 置于 25
2 ,完全黑暗条件下诱导产生愈伤组织, 30 d 后
统计出愈率。将诱导出的愈伤组织在 MSB+ 1. 0
mg/ L2, 4D继代培养基上进行增殖和继代培养。
1. 2. 3 愈伤组织的分化 将继代培养后的愈伤组
织转移到添加不同浓度 6BA、NAA的 Y 11Y 14分化
培养基中,培养基含蔗糖 30 g/ L、琼脂5 g/ L、pH 值
调至 5. 8。在 121 条件下灭菌 20 min。培养温度
25 2 ,光照强度 2000~ 3000 Lx, 光周期为 16 h/
d的光照条件下进行愈伤组织的分化培养, 接种 30
d统计分化率, 待苗长到 7 cm 以上时, 转移到不含
任何其他添加成分的 MSB 培养基上诱导根的形
成。待根系长至 10 cm左右时,去掉培养基的盖, 内
加少许水,炼苗 3 d后完全洗去附在根上的培养基,
晾干水分后移栽至菜园土、腐殖质、沙土各 1/ 3的花
盆中,在温室条件下生长。
1. 2. 4 数据处理 出愈率 = 产生愈伤组织块数/
接种种子数 100%
胚性愈伤组织诱导率 = 产生胚性愈伤组织块
数/接种愈伤组织数 100%
分化率 = 出芽愈伤数/接种愈伤数 100%
2 结果与分析
2. 1 不同诱导培养基对愈伤组织诱导的影响
白羊草真叶接种到诱导愈伤的培养基 2 d后,
真叶出现明显的增长, 由接种时的 1. 0 cm 增长至
3. 0~ 5. 0 cm, 并且变粗, 切面变钝, 颜色变淡,在出
愈伤前真叶仅表现出增长, 15 d后从伤口处长出松
软、透明的愈伤组织, 30 d 后愈伤组织膨大,转为白
色、致密的非胚性愈伤, 少数在其上长出鲜黄、致密
颗粒状的胚性愈伤,随着愈伤组织的增殖,真叶变得
干枯,颜色有的变淡,有的加深为褐色。诱导出的初
生愈伤组织颜色透明, 质地松软, 含水量高,不易分
化,经过 30 d的诱导,愈伤颜色变为乳白色, 质地较
紧密,表面干燥, 团状包裹着伤口处, 少数白色愈伤
上生有颜色鲜黄、颗粒状、质地松散的愈伤组织(图
1A, B)。
试验采用单独添加 2, 4D, KT 和 2, 4D 与
ABA和 2, 4D的激素组合诱导愈伤组织, 结果显
示,单独使用 2, 4D诱导愈伤差异显著( P< 0. 05) ,
加入 KT 后的交互作用要大于单独使用 2, 4D(表
1、2)。KT 与 ABA 两者作用亦有差别, 含有 KT 的
培养基组合对愈伤的诱导效果要明显好于含 ABA
的激素组合(表 2、3)。
从表 1、2、3 可以看出, 在 KT 浓度保持 0. 5
mg/ L 不变, 2, 4D 由 1. 0 mg/ L 逐渐上升到6. 0
mg/ L 时, 愈伤诱导率差异不明显, 以 2, 4D1. 0
mg/ L+ KT 0. 5 mg/ L 时诱导率最大, 达 93. 45%,
可见 KT 是真叶为外植体诱导出愈伤组织作用中的
主要因素;不同浓度的 2, 4D愈伤诱导率差异性显
著( P< 0. 05) ,以 2, 4D2. 0 mg/ L 时诱导率最高;在
2, 4D和 ABA 的组合中, 2, 4D2. 0 mg / L 保持不
变, ABA 浓度在 0. 2~ 1. 5 mg/ L 范围内差异不显
著,诱导率最高只达到 40. 28% ,明显低于 KT 和 2,
4D的激素组合,以及单独使用 2, 4D的诱导培养
基,说明 ABA 对提高愈伤组织的诱导率可能不是
一个重要因子。
表 1 不同 2, 4D浓度愈伤诱导率的影响
Table 1 Effect of differ ent 2, 4D concentr ations on callus induction
培养基
Medium
2, 4D浓度 ( mg/ L)
Concent rat ion of 2, 4D
愈伤诱导率 (% )
Callus induct ion rate
愈伤组织生长状况
Cal lus grow th status
差异显著性*
Signif icance
Y 1 2. 0 84. 75 较快生长,浅黄色 a
Quick grow th, light yellow
Y 2 4. 0 81. 50 较快生长,浅黄色 a
Quick grow th, light yellow
Y3 6. 0 63. 94 缓慢生长,灰白色 b
Slow growth , grey or w hite
* 注:同列不同小写字母表示差异显著( P< 0. 05) ,下同
* Note: T he dif ferent let ters in the same column are signif icant dif f erence at 0. 05 level, the same as below
142
第 2期 董宽虎等:白羊草真叶愈伤组织诱导和植株再生
表 2 KT浓度对愈伤诱导率的影响
Table 2 Effect o f KT concentration on callus induction
培养基
Medium
2, 4D浓度 ( mg/ L)
Concent ration of 2, 4D
KT 浓度 ( mg/ L)
Concent rat ion of KT
愈伤诱导率 ( % )
Callu s induct ion rate
愈伤组织生长状况
Cal lus grow th status
差异显著性*
Signif icance
Y 4 1. 0 0. 5 93. 45 快速生长,浅黄色 a
Rapid growth, ligh t yellow
Y 5 2. 0 0. 5 85. 78 较快生长,浅黄色 a
Quick grow th, light yellow
Y 6 4. 0 0. 5 83. 11 较快生长,浅黄色 a
Quick grow th, light yellow
Y 7 6. 0 0. 5 76. 93 较快生长,浅黄色 a
Quick grow th, light yellow
表 3 ABA浓度对愈伤诱导率的影响
Table 3 Effect o f ABA concentration on callus induction
培养基
Medium
ABA 浓度( mg/ L)
C on cen trat ion of ABA
2, 4D 浓度 ( mg/ L)
C on cen trat ion of 2, 4D
愈伤诱导率( % )
Callu s induct ion rate
愈伤组织生长状况
Cal lus grow th status
差异显著性*
Signif icance
Y 8 0. 2 2. 0 40. 28 缓慢生长,灰白色 a
Slow growth, grey or w hite
Y 9 0. 5 2. 0 38. 73 缓慢生长,灰白色 a
Slow growth, grey or w hite
Y 10 1. 0 2. 0 34. 10 缓慢生长,灰白色 a
Slow growth, grey or w hite
Y 11 1. 5 2. 0 34. 66 缓慢生长,灰白色 a
Slow growth, grey or w hite
143
草 地 学 报 第 17卷
2. 2 白羊草愈伤组织的继代
诱导出来的愈伤组织在诱导培养基上培养30 d
后,愈伤已明显增大,由于出愈伤的部位一般在叶基
部,且连接较紧密(图 1C) , 需要先在超净工作台
上,用消毒过的刀镊剥离愈伤组织, 然后再继代到
2, 4D浓度为1. 0 mg/ L 的继代培养基上,实现非胚
性愈伤向胚性愈伤转化, 使致密或疏松的颗粒中胚
性愈伤组织发生率提高(图 1D)。
2. 3 白羊草愈伤组织的分化
继代 7 d后接种到分化培养基上。每 5 d观察
1次, 第 5- 7 d 可以观察到愈伤组织有绿色芽点出
现, 12 d后可以观察丛生芽产生(图 1E) , 以先长
芽,后长根的方式开始发育,真叶愈伤组织上的分化
芽没有成熟胚分化出的愈伤组织丛生化明显,一般
1个愈伤只分化 1个不定芽(图 1F)。20 d左右能
观察到分化愈伤已增长至 2~ 3 cm , 1个月后大约可
长至 20 cm 左右,同时根系发达, 可炼苗后移栽, 植
株生长良好(图 1G)。只有少数分化植株未长出
根,同时少量愈伤有褐化现象。
在 3 种分化培养基中, 分化率差异不显著, 以
Y 13号培养基分化率最高, 为 38. 88%(表 4)。
表 4 不同分化培养基对白羊草真叶外植体愈伤分化的影响
Table 4 Effect of different media on euphylla callus differ entiation o f B. ischaemum
培养基
Medium
激素浓度 ( m g/ L)
H ormon e concent rat ion
6BA NAA
接种愈伤数 (个)
In oculat ion No.
分化愈伤数 (个)
Dif ferent iat ion No.
分化率 ( % )
Dif ferent iat ion rate
差异显著性
Signif icance
Y 12 0. 1 0. 04 118 39 33. 52 a
Y 13 0. 1 0. 05 123 47 38. 88 a
Y 14 0. 1 0. 06 121 26 22. 86 a
3 讨论与结论
本试验以 7日龄的真叶为外植体, 诱导出大量
的愈伤组织,愈伤组织基本上都发生在真叶靠近下
胚轴端的切口, 这与倪德祥用甜叶菊( Stevia r ebau
diana ( Bertoni Hemsl) )的茎段培养所发现的规律
相一致[ 6]。试验结果表明, 白羊草下胚轴端在离体
培养时存在全息现象,其器官发生的部位及数量、频
率的梯度变化都遵循生物全息规律。因此, 以白羊
草真叶切段进行离体培养时, 选用其形态学下端切
段较好,这与郝建国以小麦( T r it icum aesti vum L. )
叶基愈伤的诱导结果一致 [ 7]。
植物生长调节剂的诱导作用对植物的脱分化有
着重要的意义, 不同植物生长调节剂与配比对愈伤
组织的诱导作用不同。田文忠[ 8] 指出, 禾本科植物
愈伤组织诱导, 2, 4D 通常是起决定作用的植物生
长调节物质,施加外源 2, 4D 可以促进植物细胞生
长素含量提高, 从而诱导胚性细胞的发生。大部分
脱落酸( ABA)对植物体细胞胚的发生与发育具有
重要作用。在浓度适宜时, ABA 能抑制多种异常体
细胞胚的发生, 有效诱导胚性愈伤组织的分化。
Bhasharan等[ 9]和张栋等[ 10]研究指出, ABA 能促进
禾本科胚性愈伤的诱导。本试验却发现, ABA 的诱
导效果远不及 KT ,且差异极显著,即对于白羊草真
叶来说, KT 的诱导作用较 ABA 明显。
真叶胚性愈伤组织的诱导率相对较高, 尤其在
继代后,使愈伤组织状态有了明显的改善,结构变得
致密,颜色更加鲜艳,表面更为干燥, 说明继代有助
于胚性愈伤组织的形成。真叶的愈伤组织质量良
好,但将其接种到分化培养基后,随着接种时间的延
长,愈伤质量下降,由以前鲜黄、颗粒状、易碎的胚性
愈伤组织转变为灰黄色、表面潮湿、松散无结构的愈
伤组织,使分化率下降。
参考文献
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[ 8] 田文忠. 提高粳稻愈伤组织再生频率的研究 [ J ] .遗传学报,
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[ 9] Bhaskaren S, and Smith, R H . Regen erat ion in cereal t is sue
cul tu re: a review [ J] Cr op Sci. , 1990, 30: 13281337
[ 10] 张栋, 陈季楚. ABA, NAA 诱导水稻胚性愈伤组织的研究
[ J] . 实验生物学报, 1995, 28 ( 3) : 230234
(责任编辑 李 平)
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