全 文 ：第 19 卷 第 3 期
Vol. 19 No. 3
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2011 年 5 月
M ay. 2011
云南野生和逸生苜蓿资源 POD和 EST同工酶分析
马向丽 , 毕玉芬*
(云南农业大学, 云南 昆明 650201)
摘要: 为了摸清云南苜蓿( Medicag o L . )资源的遗传多样性, 采用聚丙烯酰胺凝胶不连续垂直板电泳系统, 对30 份
云南野生和逸生苜蓿材料过氧化物酶( POD)和酯酶( EST ) 同工酶酶谱进行了分析。结果表明: 供试材料的 2 种同
工酶酶带数均为 10 条, 多态位点百分数均达到 100%。除二倍体材料外,其余材料均具有多条相同的共有谱带, 有
着丰富的多态性,但 POD 和 EST 酶谱存在明显差异; 供试材料的 POD和 EST 遗传距离均在 0. 00~ 1. 00 之间, 其
中 1 号、3 号和 4号二倍体苜蓿 ,与其他逸生材料遗传距离较大, 亲缘关系较远;其余均为紫花苜蓿( M. sativa L. ) ,
POD 和 EST 的遗传距离分别在 0. 00~ 0. 56 和 0. 00~ 0. 33 之间。采用类平均法( UPGMA) Nei氏距离进行聚类
分析,表明 30 份供试材料亲缘关系的远近与地理分布呈一定的相关性。这将为云南苜蓿资源遗传关系的研究提
供基础数据。
关键词:苜蓿; 野生;逸生; 过氧化物同工酶;酯酶同工酶
中图分类号: Q944 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2011) 03-0509-07
Isozyme Analysis of Peroxidase and Polyphenol Oxidase in Wild and
Escaped Alfalfa Germplasm Resources of Yunnan
MA Xiang- li, BI Yu-fen*
( Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan Provin ce 650201, C hina)
Abstract: Perox idase ( POD) and esterase ( EST ) of 30 w ild and escaped alfalfa g ermplasm resources in
Yunnan were analy zed by PA GE to study their g enet ic diversities. Results show ed that bo th isozymes sep-
arated 10 enzyme bands by PAGE w ith 100% po lymor phic loci. Except diplo id w ild alfalfa resources, the
same char acteristics of iso zyme bands were observ ed in other materials w ith rich genet ic po lymor phism.
Enzyme spect rums o f POD and EST w ere significant ly different . Genet ic distances of POD and EST in all
tested materials ranged from 0. 00~ 1. 00. T here w as larg er g enetic distance betw een diplo id w ild alfalfa
( 1, 3 and 4) and escaped alfalfa compar ed w ith others. Genet ic distances o f POD and EST in tested M ed-i
cago Sat iva L . materials ranged fr om 0. 00~ 0. 56 and 0. 00~ 0. 33 respect ively. U PGMA cluster analysis
of Nei s distance indicated that the relat ionships among 30 w ild and escaped alfalfa germplasm resources
w ere related to their geogr aphic dist ribut ion. These results are useful in studying genetic relat ions o f alfa-l
fa g ermplasm resources in Yunnan.
Key words: Alfalfa; Wild; Escaped; Per ox idase; Esterase
苜蓿( Med icago L. )是世界上栽培最早、面积
最大、经济价值最高的牧草, 有 牧草之王的美
称[ 1]。云南是我国南方草地面积第二大省份, 发展
畜牧业需要大量的豆科牧草, 而我国苜蓿种植主要
集中在北方,苜蓿在云南利用的主要限制因素是缺
乏适应云南的苜蓿品种, 特别是缺乏耐酸、耐瘠薄和
耐干热条件的苜蓿品种。云南蕴藏着丰富的苜蓿资
源[ 2 , 3] ,经过长期的自然选择和人工选择, 这些资源
表现出不同的生态适应性和特征特性 [ 4~ 8]。
同工酶是由于生物进化过程中适应细胞代谢方
面要求而形成的, 过氧化物酶在高等植物中广泛而
大量地存在且活性较强, 酯酶是目前已发现的诸多
同工酶中基因位点比较多(一般 2~ 10 个)的一种。
目前同工酶技术已被广泛应用于植物的系统、生理、
收稿日期: 2010-09-17;修回日期: 2011- 04-16
基金项目:国家自然科学基金项目 云南野生和逸生苜蓿资源特异耐受性机理的研究 ( 30860198)资助
作者简介:马向丽( 1980- ) ,女,湖北襄樊人,博士研究生,研究方向为牧草遗传育种, E-mail: xfmaxiangli@ 126. com; * 通讯作者 Author for
cor respond ence, E- mail : biyu fenynnd@ sina. com
草 地 学 报 第 19卷
病理、遗传分析、基因标记、个体发育、杂种优势以及
鉴定远缘杂种真实性等方面[ 9]。为了探清云南苜蓿
资源生态适应性的遗传多样性基础,本试验对来自
云南的 30份野生和逸生苜蓿资源同工酶谱带特征
进行分析,为科学保护和充分利用云南苜蓿资源及
选育适合云南种植的苜蓿品种提供理论依据。
1 材料和方法
1. 1 试验材料
2007 2008年, 对滇西北、滇中、滇东、滇南地
区的野生和逸生苜蓿资源进行调查研究, 材料收集
和生态调查方法参照白史且 [ 10] 野外调查的方法进
行,共收集到苜蓿资源 30 份(表 1)。为保护资源,
每个采样地材料均取单株。将野外收集的单株材料
栽植在云南农业大学园林园艺学院温室的花盆(内
径 21 cm, 高31 cm)中,常规管理。待植株恢复正常
生长后,以扦插栽植的方式在试验地建立保存。
1. 2 试验方法[ 11, 12]
1. 2. 1 酶液提取
选取相同生育期主茎尖端完全展开的苜蓿幼嫩
叶片 0. 5 g,放入研钵, 加入 3 mL 酶提取缓冲液,在
预冷的研钵内研磨成匀浆, 转入预冷的 5 mL 离心
管内。4 下 12 000 r min- 1离心 20 m in, 上清液
即为酶粗提液, - 20 的冰箱保存备用。
表 1 30份云南野生和逸生苜蓿材料的采集地
T able 1 Collection ar eas of 30 w ild and escaped alfalfa resources in Yunnan
编号
Code
中文种名
Chin ese n am e
拉丁种名
Lat in name
采集地
Collect ion area
海拔, m
Alt itu de
资源类型
Type
1 天蓝苜蓿 M. lup ul ina L. 宜良草甸坡地 1949 野生
2 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 迪庆德钦县佛山乡坡地 2661 野生
3 南苜蓿 M. p olymor p ha L. 禄丰南冲村农田边 1609 野生
4 南苜蓿 M. p olymor p ha L. 晋宁牛恋阳坡 1929 野生
5 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 德钦县奔子栏金沙江干热河谷撂荒地 2030 野生
6 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 昆明农大草业实习基地路边 1968 逸生
7 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 昆明农大草业实习基地阳坡 1975 逸生
8 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 大理奶牛场附近 2012 逸生
9 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 嵩明嘉丽泽农场旁 2059 逸生
10 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 小哨公路旁 1989 逸生
11 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 小哨草地动物科学研究院附近山坡 2011 逸生
12 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 曲靖朗姆山路边 2165 逸生
13 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 曲靖朗姆山路边大树下 2152 逸生
14 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 通海城边 1885 逸生
15 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 通海公路边的地埂上 1890 逸生
16 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 通海路边的山坡上 1893 逸生
17 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 通海农田边 1872 逸生
18 紫花苜蓿 M. sat i v a L 玉溪研和玉米地田埂边 1635 逸生
19 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 玉溪研和农田边 1710 逸生
20 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 寻甸羊场附近的坡地 2059 逸生
21 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 寻甸县城边 2067 逸生
22 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 元江青龙厂镇公路边山坡上 1414 逸生
23 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 元江青龙厂镇农田旁 1403 逸生
24 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 元江青龙厂镇大树下 1351 逸生
25 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 元江红龙厂镇公路边山坡上 1122 逸生
26 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 建水普雄农田边 1358 逸生
27 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 建水普雄撂荒地 1349 逸生
28 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 建水普雄田埂上 1347 逸生
29 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 建水普雄玉米地旁 1346 逸生
30 紫花苜蓿 M. sat i v a L. 建水面甸镇公路旁 1264 逸生
1. 2. 2 加样
用微量移液器吸取样品粗酶液和上样缓冲液按
51比例混合即 25 L+ 5 L 加入每一梳齿。不
同样品之间要防止污染。
1. 2. 3 电泳
采用不连续的系统的聚丙烯酰胺垂直板凝胶电
510
第 3期 马向丽等:云南野生和逸生苜蓿资源 POD 和 EST 同工酶分析
泳法( VPAGE)。过氧化物酶( POD)使用 7. 5%的
分离胶,酯酶( EST )使用 10%的分离胶。浓缩胶均
为 5%。
起始电压调至 100 V, 当溴酚蓝到达下层分离
胶时电压调至 150 V, 待溴酚蓝移至距玻板下端 1
cm 处停止电泳, 关电源及冷却水,回收电极缓冲液。
电泳时间约 4~ 6 h。
1. 2. 4 染色、固定及拍照
参照卢欣石 [ 13]的方法进行。
1. 3 数据处理
依据染色酶谱带位置计算迁移率( Rf值) , Rf=
谱带中心点移动距离/前沿指示剂迁移距离。对电
泳谱带进行统计,转化为 0, 1性状的二元属性,构建
0 1信息矩阵。计算多态位点百分数( P ) [ 14] , 计
算公式为:
P= ( k/ n) 100%
式中: k为多态位点数目, n 为所测定的酶位点
的总数。
根据 Nei氏片段共享度公式[ 14] 计算不同材料
遗传相似系数( GS)和遗传距离( GD)。利用MEGA
2聚类分析统计软件采用类平均法( U PGMA, Un-
w eighted Pair Group M ethod Arithmetic averages)
进行聚类分析。
2 结果与分析
2. 1 酶谱谱型分析
2. 1. 1 过氧化物酶谱型分析
如图 1所示, 在 30份云南野生和逸生苜蓿材料
过氧化物酶同工酶的检测中共分离出 10 条酶带。
由负极到正极分成 A区和 B区, 各区酶带分别标为
A1~ A5, B1~ B5。其中 A 区有 5条着色深浅不一
且宽窄不一的酶带,材料间差异较大; B区有 5 条着
色深,宽窄不一的酶带,酶活性强。1号材料为野生
种天蓝苜蓿,其在 Rf为 0. 294, 0. 410和 0. 742处分
别有 3 条特征带。3 号和 4 号材料为野生种南苜
蓿,其仅在 Rf为 0. 635处有 1条特征带。
图 1 30 份云南野生和逸生苜蓿材料过氧化物酶同工酶电泳图
Fig . 1 POD isozyme elect rophor og ram of 30 w ild and escaped alfalfa r esour ces in Yunnan
过氧化物酶同工酶多态位点百分数达 100% ,
高频率条带 4条,中频率 3条, 低频带 3 条, 强带分
布主要集中在高频带和低频带上。30份供试材料
的过氧化物酶同工酶酶谱在质(酶带数目和迁移率)
和量(酶的活性)上表现出不同程度的差异。过氧化
物酶是供试酶系统中多态性较为丰富的酶种, 且稳
定性好,活性较高, 是研究不同苜蓿资源遗传多样
性较理想酶种。
2. 1. 2 酯酶谱型分析
如图 2所示,在 30份供试苜蓿材料酯酶同工酶
的检测中共分离出 10 条酶带。由负极到正极分成
A区和 B区, 各区酶带分别标为 A1~ A5, B1~ B5。
其中 A区有 5条着色较浅的酶带, 酶活性较弱,材
料间差异较大; B区有 5条着色深浅不一,宽窄一致
的酶带,酶活性较强。1号材料在 Rf 为 0. 737处仅
出现 1条特征带; 2号和 5号材料在 Rf为 0. 567处
出现 1条特征带; 3 号和 4号材料在 Rf 为 0. 464,
0 485和 0. 515处较为集中地出现 3 条特征带; 15
号材料在 Rf为 0. 604处出现 1 条特征带。在逸生
苜蓿材料中,酶带分布较为集中,且相似度较高。酯
酶同工酶多态位点百分数达 100% ,高频率条带有 4
条,中频率条带有 5 条, 低频率条带有 2条,强带分
布不集中。
511
草 地 学 报 第 19卷
图 2 30份云南野生和逸生苜蓿材料酯酶同工酶电泳图
Fig . 2 EST isozyme elect rophor og ram of 30 w ild and escaped alfalfa r esour ces in Yunnan
2. 2 遗传距离
统计各条带谱出现的频率,计算出各品种间的
遗传距离(表 2和表 3)。结果表明, 云南野生和逸
生苜蓿材料的过氧化物酶和酯酶同工酶的遗传距离
均在 0. 00~ 1. 00 之间, 其中 1 号、3 号和 4 号野生
材料为二倍体苜蓿, 与其他逸生材料遗传距离较大,
亲缘关系较远。其余材料均为紫花苜蓿, 其过氧化
物酶和酯酶同工酶的遗传距离分别在 0. 00~ 0. 56
和 0. 00~ 0. 33之间,表明各材料的亲缘关系有一定
的差异,遗传资源丰富。
2. 3 聚类分析
2. 3. 1 过氧化物酶聚类分析
以遗传距离对 30份材料过氧化物酶谱聚类分
析的结果见图 3, 当欧氏距离大于 0. 400时,可将 30
份材料分为 2 个一级类群, 即 3号和 4 号为 类,
其余 28份材料为 类。当欧氏距离大于 0. 200 小
于 0. 400时, 可将 30 份材料分为 3个二级类群, 即
3号和 4为类, 1号单独为 类;其余 27 份材料
为类;以 0. 1为阈值时,可将 30份苜蓿材料聚为
6类: 3号和 4 号为 类, 1号单独为 类; 8号、19
号和 20号为 类, 11 号单独为类, 7、12、13、22、
23号为类,其余 18份材料为 类。1号、3号和 4
号材料均为野生类型, 与其他材料亲缘关系较远。
14、15、16、17号( d= 0)之间和 2、5、6、24、25、26、27、
28、29号号之间亲缘关系极为近似。
2. 3. 2 酯酶聚类分析
30份云南野生和逸生苜蓿材料的酯酶酶谱聚
类分析结果见图 4。在欧氏距离为 0. 05的水平上
划分为 6个类群, 1号材料单独为 类, 3号和 4 号
材料为 类; 8号材料为 类; 2号和 5号材料为
类, 15号和 28号材料类,其余 22份材料为 类。
图 3 30 份云南野生和逸生苜蓿材料
过氧化物酶酶谱的聚类树系图
Fig . 3 Dendrog ram of POD isozyme cluster analy sis of
30 wild and escaped alfalfa accessions in Yunnan
3 讨论与结论
3. 1 同工酶的主要研究目的之一是利用酶谱差异
探讨品种间遗传差异, 分析其亲缘关系及其演
化[ 1 2]。本研究中,过氧化物酶谱及酯酶的电泳凝胶
上共出现 10条谱带,这与陈玉林和卢得仁 [ 17]、邓蓉
等[ 1 8]研究结果较为一致。但 25份逸生材料的酯酶
电泳凝胶中,仅集中检测出 3条谱带,基因位点比较
少,这与张凤仙[ 19]以紫花苜蓿杂交亲本及子代为材料,
512
第 3期 马向丽等:云南野生和逸生苜蓿资源 POD 和 EST 同工酶分析 513
草 地 学 报 第 19卷514
第 3期 马向丽等:云南野生和逸生苜蓿资源 POD 和 EST 同工酶分析
检测出 11条谱带,基因位点较多的研究结果不同。
图 4 30 份云南野生和逸生苜蓿材料
酯酶酶谱的聚类树系图
Fig . 4 Dendrog ram of EST isozyme cluster analy sis of
30 w ild and escaped alf alfa accessions in Yunnan
3. 2 苜蓿属中二倍体物种与四倍体物种遗传基础
上存在较大的差异。本研究供试材料中, 1 号材料
为天蓝苜蓿, 3 号和 4号为南苜蓿, 均是二倍体材
料。南苜蓿在过氧化物酶酶谱中只有 1 条谱带, 天
蓝苜蓿在酯酶酶谱中只有 1条谱带。二倍体植物具
有一条同工酶带谱特性还需要进一步研究, 以确定
其在鉴定倍数性鉴定方面的作用。本研究中遗传距
离分析结果表明,天蓝苜蓿和南苜蓿与其他四倍体
明显分在不同类群中。在酯酶遗传分析中, 天蓝苜
蓿与其余紫花苜蓿的遗传距离为 1. 00, 南苜蓿的为
0. 71~ 1. 00;过氧化物酶遗传分析中,天蓝苜蓿与其
余紫花苜蓿的遗传距离为 0. 56~ 1. 00, 南苜蓿的为
1. 00, 亲缘关系均较远。在紫花苜蓿资源中尽管不
同材料在 2种酶的聚类结果中表现不一, 但趋势相
同,表现出较小的遗传距离和较近的亲缘关系。其
中 8号材料(采自大理奶牛场)在 2种酶谱的聚类结
果中稍有特别, 其原因有待进一步研究。
3. 3 供试紫花苜蓿材料中, 2号和 5号为迪庆州德
钦县野生苜蓿。以往的研究发现,德钦紫花苜蓿的
形态特征与栽培紫花苜蓿存在明显差异 [ 5, 19] , 但本
研究中德钦紫花苜蓿的 2种同工酶酶谱与其他紫花
苜蓿没有明显差异, 均具有多条相同的共有谱带, 表
明德钦紫花苜蓿在遗传基础上变异较小。云南野生
和逸生紫花苜蓿资源具有一定遗传稳定性,这可能
与云南的气候条件和资源分布地区有关。德钦紫花
苜蓿在云南德钦县长期自繁自用, 且近年来新品种
很难适应当地条件, 造成了德钦紫花苜蓿良好的就
地保种自然条件, 致使其遗传基础相对稳定。
3. 4 在紫花苜蓿 2个酶谱中, 不同材料的酶带数
量、带级、位点及活性强度存在较明显的差异。在过
氧化物酶的电泳凝胶上酶带着色深浅差异大,用于
同种内不同材料间的变异分析具有较好的灵敏性。
在酯酶的电泳凝胶上酶带着色深浅差异较小,且各
自特有的酶谱特征明显。表明本试验中酯酶较为保
守,但表现出较强的稳定性,可与其他指标结合进行
苜蓿种间及遗传关系较远材料间的遗传分析。
参考文献
[ 1] 耿华珠.中国苜蓿[ M ] .北京:农业出版社, 1995
[ 2] 奎嘉祥,钟声,匡崇义.云南牧草品种与资源[ M ] .昆明:云南科
技出版社, 2003
[ 3] 毕玉芬,车伟光,顾垒.德钦地区野生紫花苜蓿群落多样性特征
及其来源分析[ J] .草地学报, 2007, 15( 4) : 306-311
[ 4] 张凤仙,毕玉芬,王晓云.云南野生苜蓿与引进苜蓿的核型分析
[ J] .云南农业大学学报, 2008, 23( 4) : 431-435
[ 5] 顾垒.云南野生苜蓿资源和利用潜力研究 [ D] .昆明:云南农业
大学, 2004
[ 6] 王新海,毕玉芬,奎嘉祥.耐酸性苜蓿的研究进展[ J] .云南农业
大学学报, 2005, 20( 5) : 705-709
[ 7] 钱庆,毕玉芬,朱栋斌.利用野生苜蓿资源进行耐酸铝研究的前
景[ J] .中国农学通报, 2006, 22( 4) : 248-251
[ 8] 王小云.云南红壤区紫花苜蓿杂交育种的遗传背景和遗传规律
的研究[ D] .昆明:云南农业大学, 2005
[ 9] 周光宇.有关同工酶分析的几个问题[ J] .植物生理通讯, 1983,
( 1) : 1-4
[ 10] 白史且. 中国假俭草遗传多样性研究 [ D] . 成都: 四川大学,
2002
[ 11] 胡能书.同工酶技术及其应用[ M ] .湖南科学技术出版社, 1985
[ 12] 王中仁.植物等位酶分析[ M ] .北京:科学出版社, 1996
[ 13] 卢欣石.中国紫花苜蓿国家审定品种的等位基因酶分析[ J] . 中
国草地, 1997, 19( 1) : 1-4, 18
[ 14] Nei M . Math emaucal m odel for studing geneon variat ion in
term s of res trict ion em comucleaseproc[ J ] . Proceedin gs of the
National Academy of S cien ces , USA, 1979, 76: 5269-5273
[ 15] 韩烈保,杨碚,邓菊芬.草坪草种及其品种[ M ] .北京:中国林业
出版社, 1999
[ 16] 郭晓霞,郑哲民,于广志.酯酶同工酶多态性及其在昆虫分类学
中的应用价值[ J] .昆虫知识, 2000, 37( 6) : 371-374
[ 17] 陈玉林,卢得仁.苜蓿过氧化物酶同工酶系统的应用研究 [ J ] .
黄牛杂志, 1994, 71( 20) : 46-51
[ 18] 邓蓉,张文,徐忠惠.紫花苜蓿三种同功酶分析[ J] .贵州农业科
学, 2005, 33( 6) : 24-26
[ 19] 张凤仙.云南紫花苜蓿杂种后代的遗传变异分析[ D] .昆明: 云
南农业大学, 2008
[ 20] 毕玉芬.北疆苜蓿属植物遗传多样性分析[ J] .草业科学, 1998,
9( 3) : 13-17
[ 21] 赵志强,曹清国,张幽静,等.几种紫花苜蓿过氧化物同工酶遗
传规律的研究[ J] .华北农学报, 2007, 22( 3) : 93-96
(责任编辑 李美娟)
515