全 文 ：第 18 卷 第 3 期
Vol. 18 No. 3
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2010 年 5 月
May 2010
LyzGFP双元基因在苜蓿愈伤组织中的转化
韩 斌1, 2, 3 , 马晖玲* 1, 2, 3, 李云霞1, 2, 3
( 1.甘肃农业大学草业学院, 甘肃 兰州 730070; 2.草业生态系统教育部重点实验室, 甘肃 兰州 730070;
3.中- 美草地畜牧业可持续研究中心, 甘肃 兰州 730070)
摘要: 利用农杆菌介导法将溶菌酶( Ly z)与绿色荧光蛋白( GFP )基因转入 甘农 1 号杂花苜蓿 ( Medicag o sativa
Martyn)和甘农 3号紫花苜蓿(Medicag o sativa L . )品种中, 获得含有该双元基因的苜蓿转基因愈伤组织 ;采用
荧光检测和 PCR扩增技术, 检测到溶菌酶 Lyz 和绿色荧光蛋白 GFP 基因在苜蓿愈伤细胞中的表达; 研究该双元基
因在苜蓿品种 甘农 1 号和 甘农 3 号中转化的若干影响因素,确定适宜的转化条件以期提高基因转化效率。结
果表明: 75 mg L - 1的卡那霉素对苜蓿愈伤组织的生长具有显著抑制效应; 300 mg L- 1头孢霉素能够有效地抑
制农杆菌 LBA4404 的生长; OD600值为 0. 4~ 0. 5的农杆菌适宜的侵染时间是 10 min;经预培养 3~ 4 d的材料侵染
后再共培养 3 d 之后,在愈伤组织诱导培养基 MS+ 2, 4D 2. 0 mg L - 1+ KT 0. 5 mg L - 1+ 0. 6%琼脂+ 2. 5%蔗
糖的培养基上诱导出抗性愈伤组织; 甘农 1 号和 甘农 3 号的抗性愈伤组织诱导率分别为 35%和 32%。
关键词:苜蓿; 溶菌酶 Lyz 基因;绿色荧光蛋白 GFP基因; 愈伤组织;农杆菌介导
中图分类号: Q786; Q814. 9 文献标识码: A 文章编号: 10070435( 2010) 03035206
LysozymeGFP Dual Gene in the Transformation in Callus of Alfalfa
Han Bin
1, 2, 3
, MA Huiling 1, 2, 3 , Li YunXia1, 2, 3
( 1. College of Pratacul ture, Gansu Agricul tu ral U nivers ity, Lanzh ou 730070, Chin a; 2. Key Lab oratory of Gras sland E cosystem, M inist ry
of E ducation/ S inoU . S. , Lanzhou 730070, Chin a; 3. Centers for Graz ingland E cosystem Sustainabi lit y, Lanzh ou 730070, China)
Abstract: Hypocotyls o f 2 variet ies of alfalfa ( Gannong No. 1 and Gannong No . 3) w ere used as receptors
respectively for tr ansformat ion o f LyzGFP genes by A grobacter ium tumef aciens mediated since December
2007. The callus containing dual g enes of Ly zGFP genes w ere harvested in this research. T he r esults of
fluorescence observat ion and PCR amplif ication show ed that the LysGFP genes could express their func
t ion in alfalfa callus successful ly. T he effects of t ransfo rmat ion of LysGFP dual g enes in Gannong No. 1
and Gannong No. 3 w ere also studied in this paper, and better t ransformat ion condit ions w ere established.
A larg e number of resistant callus had been received. The results indicated that 75 mg L- 1 Kanamycin
could rest rain gr ow th of alfalfa cal lus, 300 mg L - 1 Cefotaxine could inhibit g row th of Ag robacter ium tu
mef aciens LBA4404. T he opt imum condit ions fo r g ene t ransfo rmat ion in alfalfa were that hypocoty ls w ere
conducted to be precultured fo r 34 days, A grobacter ium tumef aciens whose concentration w as OD600 0. 4-
0. 5 w as needed to inoculate alfalfa explants fo r 10 minutes. And M S medium supplemented w ith 2. 0 mg
L
- 1
2, 4D, 0. 5 mg L - 1 KT, 0. 6% agar and 2. 5% sucrose w as needed to induce product ion of callus
w hich r esist Kanamycin f rom hypocoty ls of alfalfa af ter these explants being incubated w ith Agr obacterium
tumef aciens fo r 3 day s. T he induction rates of callus w hich resist Kanamycin of Gannong No. 1 and Gan
nong No. 3 w ere 35% and 32% , respect ively.
Key words: Alfalfa; lysozyme gene; green f luo rescent protein( GFP) gene; Callus; A gr obacterium tumef a
ciens mediated.
紫花苜蓿 (M edicago sat iva )属豆科多年生小
灌木,是世界上最重要的饲料作物,有牧草之王的
美称, 也是优良的水土保持植物。在苜蓿的生产实
践中会往往遇到病原微生物侵染而导致苜蓿病害,
严重时会造成苜蓿减产和毁灭性损伤, 带来巨大的
生产和经济损失。随着基因工程手段的不断完善,
利用优良的抗病基因, 构建在紫花苜蓿中高效表达
的质粒载体,将抗病基因导入苜蓿栽培品种中, 可在
收稿日期: 20091209;修回日期: 20100128
基金项目:甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目( GNSW200703)、国家科技支撑计划( 2006BAD04A040108)资助
作者简介:韩斌 ( 1984) ,男,河北人,硕士研究生,研究方向为牧草种质资源及育种, Email: han bindavid@ 163. com; * 通讯作者 Auth or
for correspondence; Email : mahl@g sau . edu. cn
第 3期 韩斌等: LyzGFP 双元基因在苜蓿愈伤组织中的转化
短期内直接改良苜蓿的抗病性 [ 1]。
溶菌酶( Lysozyme, Lyz)是一类抗菌蛋白, 具有
几丁质酶的活力,能选择性地分解细菌或真菌细胞
壁组分中多糖的 1, 4糖苷键, 从而破坏细菌细胞
壁的致密网状结构, 以抵御病原菌的侵染 [ 2] ,将溶菌
酶基因转化到植物细胞中,使其表达,并可提高植株
的抗病性能。绿色荧光蛋白 ( Green f luor escent
pro tein, GFP)是一类存在于水母、水螅、珊瑚等肠腔
动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发
时, 绿色荧光蛋白发射绿色荧光。目前, GFP 已作
为一种新型的报告分子广泛应用于生命科学的众多
领域,尤其在基因表达和定位等方面更具优越性[ 3] 。
本研究拟采用农杆菌介导法将溶菌酶( Lyz)与
绿色荧光蛋白( GFP)基因转入甘农 1号杂花苜蓿
和甘农 3号紫花苜蓿品种中, 通过对该双元基因
在甘农 1号和甘农 3号苜蓿中转化操作, 确立
适宜的转化条件, 以期提高基因转化效率。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
苜蓿品种为甘农 1号杂花苜蓿和甘农 3号紫花
苜蓿,由甘肃农业大学草业学院曹致中教授提供。
双元载体质粒 PBI121LyzGFP 由柴燕文完成
构建[ 4]。该质粒含有 CaMV35S启动子及其控制下
的 Lyz基因和 GFP标记基因。
农杆菌菌株 LBA4404为转化受体菌,由中国科
学院遗传与发育研究所提供。
1. 2 试剂与培养基
采用的各类培养基及其附加成分如表 1所示。
表 1 不同培养阶段所用培养基种类
Table 1 Basic composit ion of media in different stage
编号 Number 培养基用途 U sage of media 基本成分 Basic com posit ion
1 无菌苗形成 T he form of steril ity seedl ings M S+ 0. 7%琼脂 Agar+ 2. 5%蔗糖 Sucrose
2 预(共)培养 Pre ( of ) trainin g MS+ 2, 4D 2. 0 mg/ L+ 0. 6%琼脂 Agar+ 2. 5%蔗糖 Su crose
3 愈伤组织诱导 Induct ion of callu s M S+ 2, 4D 2. 0 mg/ L+ KT 0. 5 mg/ L 0. 6%琼脂 AgarL+ 2. 5%蔗糖 Sucrose
4 分化培养 Different iate culture M S+ NAA0. 4 m g/ L+ 0. 6%琼脂 Agar+ 2%蔗糖 Sucrose
1. 3 培养条件
愈伤组织预(共)培养、诱导和继代采用暗培养,
培养温度 25 2 (表 1)。
1. 4 苜蓿品种对卡那霉素敏感性测试
将甘农 1号和甘农 3号苜蓿种子用蒸馏水浸泡
40 min, 用 70%酒精消毒 30 s,再用 0. 1%升汞消毒
10 min, 无菌水冲洗 3- 5次。将种子接种到 MS 固
体培养基上, 25 , 充分光照, 7- 10 d可获得无菌
苗。将无菌苗的下胚轴剪成 4 mm 左右的小段, 转
入含不同卡那霉素浓度的培养基中, 每皿 20个, 3
次重复,卡那霉素 ( Kan) 的浓度梯度为: 0, 10, 25,
50, 75, 100 mg/ L。30 d后统计出愈率。
1. 5 抗菌素抑菌效果的确定
将甘农 1号无菌苗的下胚轴剪成 4 mm 左右的
小段, 在预培养基中暗培养 3 d, 用 OD600值为 0. 4
0. 5 的农杆菌 ( LBA4404) 侵染苜蓿外植体 (下胚
轴) , 然后用无菌水将其冲净, 用灭菌滤纸将水吸干,
共培养 3 d 后转入含不同浓度 (分别设为 0, 100,
200, 300, 400, 500 mg L - 1 )的头孢霉素( Cef )和羧
苄青霉素( Carbentcillin)的培养基中, 30 d后统计
出愈率。
1. 6 农杆菌的活化和基因转化方法
取内含供试质粒 PBI121LyzGFP 的LBA4404
农杆菌,在含 50 mg L- 1卡那霉素( Kan)和 20 mg
L- 1利福平( Rif)的 YEB 平板上划线, 26 培养 3
d后,挑取单菌落接入 5 mL 含相应抗生素 YEB液
体培养基, 26 振荡培养过夜。
分别取甘农 1号、3号苜蓿无菌苗的下胚轴,采
用叶盘法[ 5, 6] ,并参照本实验室建立的转化方法[ 7]。
先将下胚轴预培养 3- 4 d, 用上述活化的农杆菌
( OD600值为 0. 4- 0. 5)侵染一定的时间(设置为 5、
10和 15 m in)并采用静止和摇晃 2种方式处理待转
化的组织,侵染完用无菌水将组织材料清洗干净,用
无菌滤纸将水吸干,共培养 3 d后转入诱导培养基。
1. 7 苜蓿抗性愈伤组织诱导、分化和生长条件确定
把共培养 3 d 后的外植体(下胚轴)接种到含
300 mg/ L Cef的诱导培养基 3上, 25 2 黑暗条
件下培养,诱导抗性愈伤组织。25 d继代一次,第 2
次继代淘汰呈褐色和水浸化的愈伤组织, 选取质地
结实,浅黄绿色的胚性愈伤组织。在抗性愈伤组织
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草 地 学 报 第 18卷
的继代培养中, 经过 2- 3 次的继代后, 抗生素浓度
降为 200 mg L- 1。
1. 8 苜蓿愈伤组织的荧光检测
1. 8. 1 解离 在超净工作台里切取小米粒大小的
愈伤组织,将其放入解离液( 95%酒精与浓盐酸按 1
1比例配制)中浸泡 10 m in。
1. 8. 2 洗涤 将残留在愈伤组织表面上的过多盐
酸用水或 50%酒精清洗。
1. 8. 3 压片 将样品放在载玻片上,用镊子轻轻捣
碎样品,滴一滴清水, 盖上盖玻片,并在盖玻片上垫
上一层滤纸,用铅笔轻轻敲打,敲打时由轻而重, 不
可横向磨动盖玻片。
1. 8. 4 镜检 做好制片后, 在 OLYPU S BX51/
BX52型荧光显微镜下, 用蓝光激发观察愈伤组织
切片并照相。
1. 9 苜蓿愈伤组织的 PCR扩增
1. 9. 1 植物总 DNA 的提取 取经过农杆菌侵染
的苜蓿愈伤组织, 采用李维平 [ 8, 9]改进的提取 DNA
的方法,提取愈伤组织中的 DNA。
1.9. 2 PCR扩增 GFP 基因的序列设计扩增引物:
P1: 5CGCGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAA C3;
P2: 5GCGCCCGGGTTTGTATAGTTCATCCAT3。
引物合成及测序分析均由上海生工生物工程公
司完成。
PCR扩增反应体系: 模板 DNA1. 0 L, 10
PCR Buf fer 2. 5 L, dNT Ps( 0. 25 mmo l L- 1 ) 1. 0
L, P1( 10 pmol L - 1 )和 P2( 10 pmo l L - 1 )各
为 1. 0 L, T aq DNA 聚合酶( 1 U L - 1 ) 0. 5 L,
加 ddH 2O 至 25 L。PCR反应条件: 94 预变性 4
m in; 94 变性30 s, 60 退火30 s, 72 延伸1 min,
30个循环; 72 延伸 7 m in。
配制 1%琼脂糖凝胶, 取全部扩增产物进行电
泳。保持电流 80 mA, 电泳 40 min 后, 紫外透射仪
下观察结果并照相。
2 结果与分析
2. 1 卡那霉素对愈伤组织诱导和生长的影响
对甘农 1号杂花苜蓿品种和甘农 3号紫花
苜蓿品种愈伤组织进行抗卡那霉素敏感性试验, 结
果表明, 2个苜蓿品种的下胚轴卡那敏感性接近,分
别在卡那霉素浓度 10- 25 mg L - 1的诱导培养基
上长势均良好,并诱导产生愈伤组织,只是有少数发
生褐化,在 50 mg L - 1浓度时愈伤组织只有少数能
正常生长,并且逐渐褐化,当浓度达 75 mg L - 1时,
愈伤组织生长几乎停滞,褐化严重(表 2) , 因此选择
75 mg L - 1卡那霉素为甘农 1号杂花苜蓿和甘
农 3号紫花苜蓿转化组织的筛选临界浓度。
表 2 卡那霉素不同浓度对苜蓿愈伤组织诱导的影响
Table 2 The effect o f Kan on the callus induction
苜蓿种类
( T ype of Alfal fa )
卡那霉素浓度
Con cen t rat ion
of Kan ( mg/ L)
外植体数
Number of ex plants
愈伤组织数
Number of callu s
愈伤组织诱导率
in duct ion rate
of Callus( % )
愈伤增殖体积
Volum e of callus
prolif erat ion
CK 0 60 60 100 a + + +
甘农 3号 10 60 39 65 b + +
Gannong No. 3 25 60 31 51 c + +
50 60 6 10 d +
75 60 0 0 e -
100 60 0 0 e -
甘农 1号 10 60 42 70 b + +
Gannong No. 1 25 60 32 53. 3 c +
50 60 5 8. 3 d +
75 60 0 0 e -
100 60 0 0 e -
注: + :愈伤组织较少,体积小,直径多小于 0. 3 cm ; + + :愈伤组织较多,体积较大,直径多在 0. 3- 0. 6之间; + + + : 愈伤组织最多,体积
最大,直径多在 0. 6- 1. 5之间; - :没有愈伤组织。方差分析用 SPSS 13. 0的 Duncan法( P< 0. 05)分析。下同
Note: + : L ess callus, sm aller volume, diam eter less than 0. 3 cm; + + : m or e callus, b igger volume, diam eter in 0. 3- 0. 6 cm; + + + : m ost
cal lus, biggest volume, diameter in 0. 6- 1. 5 cm; - : no callus. Variance analysis using the Duncan method of SPSS 13. 0. ( P< 0. 05) . Same as fol low s
2. 2 抗生素的抑菌效果及其对苜蓿愈伤组织诱导
和生长的影响
当外植体与农杆菌共培养后, 其表面及浅层组
织中附带大量农杆菌,必须进行脱菌培养,以抑制农
杆菌的生长,减少对转化外植体生长的伤害, 提高基
因转化效率。既能够抑制农杆菌的生长, 又对植物
细胞伤害最小的抑菌素种类和适宜浓度的选择是基
因转化中的一个重要环节。头孢霉素( Cef )与羧苄
本试验表明,经过 30 d的脱菌培养,头孢霉素的抑
菌效果优于羧苄青霉素, 在 300 mg L - 1时就能起
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第 3期 韩斌等: LyzGFP 双元基因在苜蓿愈伤组织中的转化
到抑菌作用,此时甘农 1号杂花苜蓿愈伤组织诱导
率达到 96. 7%, 且长势良好; 而羧苄青霉素浓度在
500 mg L - 1时愈伤组织诱导率才达到 90% (图
1) ,因此选择 300 mg L - 1头孢霉素为抑菌剂浓度。
图 1 抗生素对甘农 1 号愈伤组织诱导率的影响
F ig . 1 The effect o f Cef and Carb on the
callus induction o f Gannong No. 1
2. 3 预培养、侵染时间和方式对苜蓿愈伤组织诱导
的影响
2种苜蓿品种下胚轴经预培养 3- 4 d后,侵染
后的外植体增殖速度最快, 愈伤组织的个体较大,质
量也较好。
农杆菌侵染时间也是基因转化中重要的因素之
一。侵染时间过长外植体污染严重, 不易成活, 过短
转化率又较低。本研究结果显示, 当农杆菌浓度
OD600值在 0. 4~ 0. 5,侵染 10 min,侵染时将被侵染
的外植体放在 100 rpm min- 1摇床上缓慢摇动,此
时 2种苜蓿愈伤组织诱导率最高 (表 3) , 甘农 1
号杂花苜蓿和甘农 3号杂花苜蓿的抗性愈伤组
织诱导率分别为 35%和 32%。
2. 4 愈伤组织的荧光检测
目的基因- 溶菌酶( Lyz)基因与报告基因- 绿
表 3 侵染时间对转化率的影响
Table 3 The effect of immer sed time on tr ansfo rmation rate
侵染方式
Infect ion meth od
侵染时间
Infect ion t ime( min)
外植体数
Num ber of
explants
甘农 1号抗性愈伤率
The rate of resistant cal lus
of Gannong No. 1 ( % )
甘农 3号抗性愈伤率
T he rate of resistant callus
of Gannong No. 3 ( % )
静止 Static 5 100 19a 15a
10 100 25ab 20ab
15 100 22ab 23abc
摇床震荡 Shaker
( 100 rpm/ m in)
5 100 27ab 20ab
10 100 35b 32c
15 100 32ab 28bc
色荧光蛋白( GFP)基因连接在同一个表达载体上,
构成双元表达载体,因此可对转化了的胚性愈伤组
织进行前期荧光跟踪检测, 可方便地检测目的基因
是否导入到植物细胞中。结果表明,在荧光显微镜
(蓝光激发下)下可以检测到转化的苜蓿愈伤组织发
出绿光(图 21, 图 22) , 说明外源基因 LyzGFP 已
成功转入甘农 1号和 3号苜蓿愈伤组织中。
2. 5 胚性愈伤组织 PCR检测
荧光检测结果表明目的基因已经转入愈伤组织
中,为使检测更加准确,提取经荧光检测的苜蓿 2个
品种愈伤组织基因组 DNA, 进行 PCR扩增, 扩增后
分别从甘农 1号杂花苜蓿和甘农 3号紫花苜蓿中得
到片段大小为 750bp的条带(图 3) ,双重检测结果
证明外源基因 LyzGFP 已成功转入甘农 1号杂花
苜蓿和 3号紫花苜蓿愈伤组织中。
图 2 荧光显微镜下观察到的重组质粒在甘农 3号紫花苜蓿(图 21)、
甘农 1 号杂花苜蓿(图 22)愈伤组织细胞中的表达和未转化的甘农 1 号紫花苜蓿(图 23)愈伤组织
Fig . 2 The expression o f the recombinant plasmid in alfalfa callus o f Gannong No. 3 ( Fig 21) , Gannong No. 1( Fig 22)
under the fluor escent micr oscope upon excitat ion of blue light, and no expression of the recombinant plasmid
in a lfalfa callus of Gannong No . 1 ( F ig 23) under the fluor escent micro scope upon
355
草 地 学 报 第 18卷
图 3 重组农杆菌转化甘农 1 号和 3 号苜蓿
愈伤组织的 PCR 检测结果
F ig . 3 Indentification of GFP gene in
alfalfa ca llus of Gannong No . 1 and No. 3
注: M . DL 2000; 1.阳性对照; 2.阴性对照;
3, 4, 5.甘农 1号转基因愈伤组织; 6, 7. 8甘农 3号转基因愈伤组织
Note: M . DL 2000; 2, Negative cont rol; 1. Posit ive con t rol ; 3, 4, 5.
PCR of The t ransformed GFP gene in callu s of gannong 1 alfalfa;
6, 7, 8. PCR of The transformed GFP gene in callus of gannong 3 alfalfa
3 讨论
3. 1 预培养对农杆菌介导转化率的影响
许多研究认为预培养使植物组织代谢活跃, 可
促进细胞分裂, 而分裂状态下的细胞更易整合外源
DNA,促进酚类物质的产生, 酚类物质可活化 Vir
基因,有助于提高转化效率[ 10, 11] 。但也有相反的观
点认为,预培养甚至会降低转化率和瞬时表达,苜蓿
转化不需要预培养[ 7, 12, 13] 。陈晨等[ 14] 对预培养影响
苜蓿的转化效率做了详细研究, 表明预培养 5 d 的
抗性愈伤组织形成率及稳定转化率最高。本试验通
过预培养处理研究, 发现 3- 4 d的预培养有助于外
植体形成抗性愈伤组织, 与陈晨等[ 14] 的研究结果相
似。预培养可使培养材料易于与外源 DNA 整合,
提高转化率。
3. 2 农杆菌介导的基因转化中适宜条件的确立
根癌农杆菌对植物的侵染过程是受到植物伤口
分泌的酚类化合物诱导, 菌体先吸附于组织表面, 然
后将 T i质粒上的 TDNA 转移并整合进植物基因
组中[ 15] 。掌握好外植体在菌液中浸泡的时间, 有助
于减少后继培养中可能造成的污染,并可减轻农杆
菌对植物细胞的毒害作用。采用负压处理(注射器
抽拉法产生负压,摇床摇动)能造成对外植体一定程
度的伤害,引起农杆菌吸附,这有利于菌液渗入组织
内部,可提高愈伤组织的转化率,但负压处理时间不
宜过长,以免对外植体的伤害过大,从而影响生长。
梁慧敏等[ 16] 对 5种无性系叶片进行转化, 农杆
菌最适浓度 OD600值为 0. 3- 0. 5; 而本试验结果表
明菌液浓度 OD600值为 0. 4- 0. 5转化效率较高,与
该研究结果较一致。
本研究还发现, 通常共培养第 4 d农杆菌会大
量生长,覆盖整个外植体, 继续培养外植体会萎蔫,
且不利于后面抑菌培养与分化。因此, 试验采用共
培养 3 d后,置于诱导培养基中诱导愈伤组织形成。
3. 3 筛选方式对转化率的影响
目前卡那霉素在植物基因工程中被广泛应用于
选择标记,大量研究表明,选择压加入的时机和强度
显著影响转化效果 [ 17]。本研究首先对侵染后的苜
蓿外植体进行前期选择,转化率较低,不易得到抗性
愈伤组织和后期的分化,而后期选择的工作量较大,
大量转化苗需要鉴定, 而且假阳性较高,因此采用延
迟选择,对提高愈伤组织的转化率具有较好效果。
抗生素浓度在转化中也起着关键作用, 浓度过大影
响出愈率,太小又不能起到抑菌作用,因此确定 300
mg L - 1Cef为最佳抗生素浓度。
3. 4 荧光蛋白基因在基因表达检测中具有突出的
优点
对转化后代的筛选鉴定是基因工程的重要组成
部分。当前使用最为广泛的报告基因为 GU S 基
因,而检测 GUS时需逐个取样,再经保温、脱色、固
定等繁琐步骤,如果转化后代群体有上百或上千个
样品, 按 GU S 检测方法, 工作量很大[ 18] ; 半乳糖
苷酶( lacZ)和荧光素酶( LUC)也常作为报告基因,
它们的产物都是酶, 均需要底物和辅助因子参与才
能检测其活性[ 19]。而 GFP 具有荧光强度高、不需
要底物或辅助因子、无种属特异性、相对分子质量
小、易与其他蛋白融合、对细胞无伤害、检测方便、可
在活细胞实时观察等优点, 以 GFP 作为报告基因
时,不必破碎组织或外加底物,直接通过荧光显微镜
就能显示目的基因在细胞中的表达情况[ 20]。Win
f ield等 [ 21]已证明 GFP 可以在甘薯的不同组织中表
达,本试验发现 GFP 基因作为报告基因能够在苜蓿
转化愈伤组织充分表达,这表明 GFP 基因在苜蓿转
基因研究中具有广泛的应用前景。
4 结论
以杂花苜蓿甘农 1号和紫花苜蓿甘农 3号
356
第 3期 韩斌等: LyzGFP 双元基因在苜蓿愈伤组织中的转化
7- 10 d龄无菌苗下胚轴为外植体, 建立了适合农
杆菌介导的转基因再生体系, 所选用的培养基、抗生
素浓度、农杆菌菌液侵染浓度和侵染时间均适合这
2种苜蓿的农杆菌介导方法。得到大量的抗性愈伤
组织和分化芽, 对抗性愈伤组织进行荧光和 PCR 检
测,转化率分别达到 35%和 32%。本试验为其他基
因转入甘农 1号和甘农 3号苜蓿提供了适合农
杆菌介导的转基因组织再生体系,为其基因转化工
作打下基础。
参考文献
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(责任编辑 李 扬)
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