全 文 ：第 15 卷 第 4 期
Vol. 15 No. 4
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2007 年 7 月
Jul. 2007
文章编号: 1007-0435( 2007) 04-0348-04
长穗偃麦草与中间偃麦草杂种成熟胚离体培养
与再生体系的建立
鲍 芫 , 米福贵*
(内蒙古农业大学生态环境学院, 呼和浩特 010018)
摘要: 以长穗偃麦草( Ely tr igia elongata)和中间偃麦草杂交种( Ely tr igia hybr id ; E. elongata@ E. intermedia)的
成熟胚为外植体,进行组培再生体系的研究。结果表明: 诱导愈伤组织的适宜培养基为 MS+ CH ( 500 mg/ L ) + 2,
4-D( 1. 0 mg/ L ) + 6-BA ( 0. 2 mg/ L) ,其诱导率为 73% ,适宜分化培养基为 MS+ 6-BA( 4. 0 mg / L ) + NAA( 0. 5 mg/
L) ,分化率最高, 为 37. 8%。本研究建立了一套有效的以成熟胚为外植体偃麦草杂种组织培养再生体系。
关键词: 长穗偃麦草; 中间偃麦草; 杂交种; 成熟胚; 愈伤组织; 再生植株
中图分类号: S812; Q943. 1 文献标识码: A
A Study on Induction of Emdryogenic Callus and Plant Regeneration from
Mature Embryos of Elytrigia hybrid (E. elongata @ E. intermedia)
BAO Yuan, M I Fu-gui*
( College of Ecology and Environment S cien ce, Inner M on gol ia Agricu ltural U nivers ity, H ohhot ,
Inn er Mongolia Autonom ou s Region 010018, China)
Abstract: T he regenerat ion fr om mature embryos w as studied using the mature embryo s of E ly t rigia hy-
br id ( E. elongata @ E. intermedia) as explants. Results indicate that the f requency o f callus induct ion
reached 73% in the callus induct ion medium supplemented w ith 1. 0 mg/ L 2, 4-D and 0. 2 mg/ L 6-BA. Dur-
ing subcultures, r apid grow th of callus and embryogenesis w ere maintained in the callus subcul ture med-i
um plus 1. 0 mg/ L 2, 4-D and 0. 5 mg/ L 6-BA. Af ter callus subcultures, the rate of shoot regenerat ion f rom
callus w ere 37. 8% in the differ ent iat ion medium supplemented w ith 4. 0 mg / L6-BA and 0. 5mg/ L NAA.
An effect iv e sy stem o f mature embryos reg ener at ion for Ely tr igia hybr id ( E . elongata @ E. interm edia)
w as developed.
Key words: E ly t rigia elongate ( H ost ) Nev ski; E. intermed ia ( Host) Nevski; E. hybrid; M ature embry-
o ; Embryogenic callus; Plant regenerat ion
偃麦草属( Elyt rig ia Desv . )中蕴藏着许多对小
麦改良极其有用的基因, 如抗病, 抗寒, 耐盐碱等。
该属的大多数种植株高大, 穗大花多, 茎叶柔嫩, 种
子和饲草产量较高, 营养价值好。本试验以长穗偃
麦草与中间偃麦草种间杂种的成熟胚为外植体, 探
索建立其组织培养再生体系的方法,以期为偃麦草
新品系的选育及基因工程育种奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
供试材料为长穗偃麦草和中间偃麦草的杂交种
( E ly t rigia hybr id ; E. elongata @ E . intermedia) ,
来源于莫斯科总植物园( 2004)。
收稿日期 : 2006-12- 25; 修回日期: 2007-05- 28
基金项目: 国家转基因植物与产业化研究重大专项项目( J2002-B-008)
作者简介: 鲍芫( 1980-) ,女,蒙古族,内蒙古呼伦贝尔人,硕士研究生,研究方向为饲料遗传育种、栽培与加工, E-mail: baoyuan1980@ 163.
com; * 通讯作者 Author for correspondence, E-mail: mfgui@ yahoo. com. cn
第 4期 鲍芫等:长穗偃麦草与中间偃麦草杂种成熟胚离体培养与再生体系的建立
1. 2 培养基
基本培养基为 MS培养基。成熟胚愈伤组织诱
导培养基:选取 MS培养基(添加水解蛋白 500 mg/
L)附加不同浓度的 2, 4-D( 1. 0mg/ L、2. 0 mg/ L、3.
0 mg/ L )和 6-BA ( 0. 1 mg / L、0. 2 mg / L、0. 4 mg/
L)。分化培养基: MS 培养基附加不同浓度的 6-BA
( 1. 0 mg/ L、2. 0 mg/ L、3. 0 mg / L、4. 0 mg / L ) ,
NAA( 0. 2 mg/ L、0. 5 mg / L )。生根培养基: 1/ 2MS
培养基附加0. 5 mg/ L NAA。培养基的蔗糖浓度为
3%,琼脂浓度为 0. 7%, pH 值均为 5. 8~ 6. 0。
1. 3 成熟胚愈伤组织的诱导
选取饱满的种子浸泡 8 h, 剥去内外稃, 置于湿
滤纸上继续吸胀 1~ 2 h, 将材料冲洗干净; 在超净
工作台上用 75%乙醇消毒 30 s, 无菌水冲洗 3次,
然后用 0. 1%升汞表面消毒 7 min,再用无菌水冲洗
7次,置于铺有湿的无菌滤纸的培养皿中;用解剖针
从盾片处挑出胚(尽量少带胚乳)盾片朝下接种在培
养基上, 每瓶接种 20 粒成熟胚, 每处理 5次重复。
25 e 暗培养 30 d。
1. 4 愈伤组织继代培养
经过 30 d的暗培养,将诱导出的愈伤组织转入
继代培养基。培养条件: 温度 25 e , 14 h光照,光强
为 3000~ 4000 lx。继代 2~ 3次, 每次 20 d。
1. 5 植株再生
挑选生长状态良好的胚性愈伤组织转入分化培
养基上进行分化,培养条件同继代培养,分化的小苗
转入生根培养基上, 生根后移栽到花盆中。
2 结果与分析
2. 1 供试培养基对愈伤组织诱导的影响
将成熟胚接种到愈伤组织诱导培养基上, 在黑
暗条件下培养 5~ 9 d后胚开始膨大, 10~ 20 d 形成
无色透明的愈伤组织, 25 d左右达到出愈高峰。从
表 1看出成熟胚在实验选取的愈伤组织诱导培养基
中均能诱导出愈伤组织, 但诱导率及愈伤质量各有
差异,以 2, 4-D的浓度为 1. 0 mg/ L 的培养基和附
加 2, 4-D( 1. 0 mg/ L) + 6-BA( 0. 2 mg / L )的培养基
诱导的愈伤组织最好, 结构紧密,其余的愈伤组织结
构疏松、水浸棉絮状。
2. 2 继代改造培养基对愈伤组织发生和分化的影响
在成熟胚经过 25 d的暗培养后, 形成的愈伤组
织大多为白色透明絮状、质地较柔软的初生愈伤组
织,这种愈伤组织在各种分化培养基中很难分化成
苗,需将其转到继代培养基中继代培养, 经过 2次
(每次30 d)继代培养, 部分愈伤组织转化为淡黄色、
质地紧密颗粒状的胚性愈伤组织。试验选取 MS培
养基添加不同配比的激素, 其中 1号、2号培养基没
有添加 6-BA, 其胚性愈伤组织的发生率低, 仅为
4. 6%和 5. 8%。在此基础上添加不同浓度的 6-
BA,胚性愈伤组织的发生率有所提高。以 5号培养
基中胚性愈伤组织发生率最高, 为 37. 5% (表 2)。
这表明在继代培养基中附加 6-BA 并与 2, 4-D保持
适当比例,有助于改善愈伤组织状态,促进胚性愈伤
组织的发生。
2. 3 激素配比对胚性愈伤组织分化的影响
选择继代后色泽鲜亮、淡黄、结构较紧密的胚性
愈伤组织置于 MS 附加不同浓度的 6-BA 和 NAA
的培养基上,研究不同组合对愈伤组织分化的影响。
结果见表 3。愈伤组织在含有适宜浓度 6-BA 和
NAA 的培养基上, 均可以分化出绿色小苗。其中
部分胚性愈伤发生褐变。以 MS+ 6-BA( 4. 0mg/ L)
+ NAA( 0. 5mg / L )的配比最为合适, 分化率最高,
为 37. 8% (表 3)。
表 1 供试培养基对成熟胚愈伤组织诱导的影响
Table 1 Effect of differ ent mediums on ca llus induction o f mature embryo s
培养基( m g/ L)
Medium ( mg/ L)
形成愈伤
No. of callus produced
愈伤组织诱导率
Frequen cy of in duct ion( % )
愈伤状态
State of cal lus
M S+ CH ( 500) + 2, 4-D( 1. 0) 52 52 致密 Compact
M S+ CH ( 500) + 2, 4-D( 2. 0) 41 41 疏松 Loosen
M S+ CH ( 500) + 2, 4-D( 3. 0) 40 40 疏松 Loosen
M S+ CH ( 500) + 2, 4-D( 1. 0) + 6-BA( 0. 1) 60 60 疏松 Loosen
M S+ CH ( 500) + 2, 4-D( 1. 0) + 6-BA( 0. 2) 78 78 致密 Compact
M S+ CH ( 500) + 2, 4-D( 1. 0) + 6-BA( 0. 4) 66 66 疏松 Loosen
M S+ CH ( 500) + 2, 4-D( 2. 0) + 6-BA( 0. 1) 32 32 疏松 Loosen
M S+ CH ( 500) + 2, 4-D( 2. 0) + 6-BA( 0. 2) 23 23 疏松 Loosen
M S+ CH ( 500) + 2, 4-D( 2. 0) + 6-BA( 0. 4) 18 18 疏松 Loosen
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草 地 学 报 第 15卷
表 2 继代改造培养基对胚性愈伤组织发生的影响
Table 2 Effect of differ ent improved subculture medium on embryogenic callus induction
培养基
Medium No.
2, 4- D
(m g/ L)
6- BA
( mg/ L)
初生愈伤组织数
No. of primary callus
胚性愈伤组织数
No. of embryogenic callus
胚性愈伤组织发生率(% )
Induction f requency of em bryogenic cal lus( % )
1 1 0 65 3 4. 6
2 2 0 69 4 5. 8
3 1 0. 2 74 14 18. 9
4 2 0. 2 76 11 14. 5
5 1 0. 5 64 24 37. 5
6 2 0. 5 62 14 22. 6
表 3 6-BA和 NAA的不同配比对胚性愈伤组织的分化的影响
T able 3 Effect of differ ent combinations o f 6-BA and NAA on regener ation o f embryogenic callus
6-BA
( mg/ L)
NAA
( mg/ L)
接种的胚性愈伤组织数
No. of inoculatedemb ryogenic callu s
分化的愈伤组织数
No. of em bryogeniccallus dif f erent iated
分化率( % )
Dif feren tiat ion frequen cy ( % )
1. 0 0. 2 31 2 6. 4
2. 0 0. 2 34 3 8. 8
3. 0 0. 2 38 5 13. 2
4. 0 0. 2 37 4 10. 8
1. 0 0. 5 35 6 17. 1
2. 0 0. 5 42 9 21. 4
3. 0 0. 5 33 6 18. 8
4. 0 0. 5 37 14 37. 8
2. 4 再生植株的生根和移栽
当分化出的小苗长到 2~ 3 cm 高时, 取健壮植
株接种于附加 NAA ( 0. 5 mg/ L )的 1/ 2M S 培养基
上,可正常生长并形成完整小植株。一般两周即可
诱导出根,待植株长出 3~ 5条根, 根长 3~ 4 cm, 植
株健壮,叶色浓绿时, 即可移栽。移栽前先去掉封
口膜, 往瓶中加适量自来水, 室温下炼苗8 h, 冲掉
根部所带培养基, 移栽到温室花盆中, 套上带孔的
塑料膜,以便于统一保湿。一周后去掉塑料膜, 常
规管理。
3 讨论与结论
3. 1 长穗偃麦草与中间偃麦草杂交种的成熟胚相
对较大,接种后污染率高,采用常规的灭菌时间效果
不理想。试验采用的灭菌剂为 0. 1%的升汞 ( Hg-
CI2 ) , 随着灭菌时间的延长, 污染率降低, 但死亡率
增高,当灭菌时间为 10 min 时, 基本没有愈伤组织
产生,灭菌时间为 7 min时, 效果最好,存活率最高。
3. 2 试验发现有部分成熟胚没有经过胚性愈伤分
化而直接出苗, 但直接萌发芽细长、弱小、颜色浅白,
在继代过程中, 常常夭折,不能形成再生植株。适当
提高 2, 4-D的浓度后,直接再生芽现象减少。
3. 3 从试验结果看, 解决长穗偃麦草和中间偃麦
草杂交种组织培养的关键是获得高质量的胚性愈
伤组织。禾本科植物的愈伤组织较为丰富, 其质
量间存在明显差异, 主要有 4 种类型: 第 1 类生长
迅速,结构致密, 颗粒小; 第 2 类生长迅速, 质地疏
松;第 3类生长缓慢, 结构致密; 第 4 类松软无定
型、呈果冻状或棉絮状[ 3 ~ 6]。本试验中的初生愈伤
组织为第 4 类。为了加快胚性愈伤组织形成速
度,必须对其进行调整, 使之向 1、2 类型转化。本
研究在成熟胚初生愈伤组织的继代过程中, 通过
降低 2, 4-D的浓度, 并加入适当浓度的 6-BA,创造
了适合胚性愈伤发生的外界培养条件, 使致密的
颗粒状胚性愈伤组织的发生率提高, 从而实现了
长穗偃麦草和中间偃麦草杂交种成熟胚愈伤组织
再生绿色植株。
3. 4 一般认为,初诱导产生的胚性愈伤组织或经过
短期培养的胚性愈伤组织较易诱导长出体细胞胚,
但随着培养时间的延长和继代次数的增多,体细胞
胚发生能力会下降。结缕草在继代三次后再生能力
明显下降, 而水稻在继代三个月以上再生力丧
失[ 8 ~ 10]。本试验过程中发现在继代 2次后,接入分
化培养基,再生率较高。
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第 4期 鲍芫等:长穗偃麦草与中间偃麦草杂种成熟胚离体培养与再生体系的建立
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(责任编辑 梁艳萍 才 杰)
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