全 文 ：第 17 卷 第 5 期
Vol. 17 No . 5
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2009 年 9 月
Sep. 2009
珠芽蓼内生固氮菌鉴定及其固氮基因分析
李振东, 陈秀蓉* , 李 鹏, 满百膺, 王辰月, 邹雨坤, 徐长林
(甘肃农业大学草业学院,草业生态系统教育部重点实验室 ,中 美草地畜牧业可持续发展研究中心, 兰州 730070)
摘要:从东祁连山高寒草地采集优势植物珠芽蓼( Polyg onum viv iparum )并对其内生固氮细菌进行分离、筛选和鉴
定。结果表明:从珠芽蓼内分离到 14 株内生细菌, 其中 Z22、Z24、Z25、Z27、Z28、Z211、Z214 共 7 株内生细菌具有固
氮能力,对菌株 Z22 的固氮基因( nif H ) 进行了 PCR 扩增、测序和系统发育分析, 并在 GenBank 中登录(登录号为
EU693342) ; Z22菌体球形, 革兰氏阳性, 产芽孢,结合生理生化特征及 16SrDNA 基因序列测定和同源性分析,鉴定
其为球形芽孢杆菌(Bacillus sp haer icus ) ,该菌株的 16SrDNA 序列在 GenBank 中登录 (登录号为 EU236749)。本
文首次获得了球形芽孢杆菌编码铁蛋白的 nif H 基因序列。
关键词:珠芽蓼; 菌株;球形芽孢杆菌; 固氮基因
中图分类号: S182; S154. 381 文献标识码: A 文章编号: 10070435( 2009) 05055206
Identification of endogenous nitrogenfixing bacteria of Polygonum
vivip arum and analysis on nitrogen fixation gene ( nif H)
LI Zhendong, CHEN Xiurong* , LI Peng, MAN Baiying, WANG chenYue, ZOU Yukun, Xu Changlin
( Pratacultural College, Gansu Agricultural University, Key Laboratory of Grassland Ecosy stem Minis t ry of Edu cat ion, Sin oU. S.
Centers for Grazingland Ecosys tem Sus tainabilit y, Agricultu ral University, Lanzhou, Gansu Province, 730070 China)
Abstract: Biolo gical nit rog en fix at ion is the cleanest and the most economical nit rogen fert ilizer because it
can reduce the environmental pollut ion and save energ y. Endophyt ic nitr ogenf ix ing bacteria, living in
plants, can avoid being inhibited by nit ro gen compounds and the compet it io n w ith indigenous m icroo rgan
isms, show ing a higher eff iciency of nit rog en fix at ion. Endophy t ic nit rog enf ixing bacter ia have g reat po
tentials to sett le the problem of nit rogen sources of the host plants and enhance the adaptability to the envi
r onment . Now, more than 20 genera endophyt ic nit ro genfix ing bacteria have been found fr om the econom
ic crops and tropical plants, but few studies on the alpine grassland Polyg onum viviparum endophy t ic ni
t ro genfix ing bacteria are r eported. In this study, endogenous nit ro genfix ing bacteria w ere isolated,
screened and ident ified f rom Polygonum vivipar um which are advantageous plants in alpine gr assland in
the Eastern Qilian M ountains. 14 endophy t ic bacteria w ere isolated fr om Polyg onum viviparum , and 7 of
them have the ability of nit rogenf ixing. Z22 has been log ged in the Gene Bank and has an accession num
ber o f EU693342 after PCR amplif icat ion, sequencing and phylog enet ic analy sis on nit ro genfix ing genes
( nifH ) Z22. Z22 is spherical, Gramposit ive, and produces spore. Both 16SrDNA sequence homo logy a
nalysis and physiolog ical biochem ical character ist ics analysis indicated that Z22 can be ident ified as Baci l lus
sphaer icus. 16SrDNA sequence o f Z22 has got a Gene Bank accession number of EU236749. It is the f ir st
time that g ene sequence of nifH of encoding ferr it in of Bacil lus sp haer icus was gained.
Key words: Polygonum v iv ip ar um ; endophyt ic bacteria; Baci l lus sphaericus ; nitr ogen fix ation gene
( ni f H )
收稿日期: 20090304;修回日期: 20090421
资助项目:国家自然基金项目( 30471232)、甘肃农业大学草业学院草业科学国家级重点学科学术骨干科研项目暨草业生态系统教育部省
部共建重点实验室( CYGG200601)资助
作者简介:李振东( 1978 ) ,男,甘肃省临夏县人,博士研究生,研究方向为高寒牧草内生菌及草地微生物多样性, Email: lizh endong78@
tom. com; * 通讯作者 Author for correspondence, Em ail: chen xiurong@ gsau. edu. cn
第 5期 李振东等:珠芽蓼内生固氮菌鉴定及其固氮基因分析
氮素是植物生长发育所必需的基本元素之一,
但是,土壤氮素往往供应不足,成为限制植物生产的
重要因素。生物固氮是最清洁、最经济的氮肥,可以
降低环境污染和节省能源。自 1886 年 BeiJer inck
首次分离共生固氮的根瘤菌起, 各种固氮微生物相
继被分离鉴定, 国内植物内生固氮研究始于 1981年
丘元盛等从水稻根中分离到了粪产碱菌 ( A lcal i
genes f acali s ) A15[ 1] ; 至今已发现的固氮微生物
80余属,其中最常见的植物内生固氮菌多属于产碱
菌属( A lcal ig enes)、肠杆菌属( Enter obacter ) 、固氮
螺菌属( A z osp i ri l lum)和芽孢杆菌属( Baci llus)等
20多个属[ 2, 3, 4, 5] , 其宿主集中在经济作物和热带植
物,如甘蔗[ 6]、水稻[ 4]、小麦、甜马铃薯、高粱[ 7]、玉
米[ 8]、卡拉草 [ 9]、Cameroon 草[ 7]、羊草[ 10]、糖蜜
草[ 11]、圆果雀稗 ( Pasp alum or bicular e ) [ 12]、沙
竹[ 13]、刺竹[ 5] 、香椿 [ 14]等植物; 同时对植物内生菌的
生理生化特性、固氮能力及固氮机理等进行了研究,
部分菌编码铁蛋白的 ni f H 基因已完成测序。但
是,对高寒草地珠芽蓼内生固氮菌的研究鲜见报道。
珠芽蓼 ( Polygonum vivipar um )为多年生草本植
物,分布在海拔 2000~ 3900 m 的草甸和高原草甸,
广泛分布于全国各省区。珠芽蓼果实含有丰富的蛋
白质和总糖,氨基酸种类齐全,并含有多种对人体有
益的矿物质元素 [ 15]。不仅可作为优良的饲料, 而且
具有较高的食用价值;也可提栲胶;全草捣烂制成粉
剂或溶液能防治农作物害虫[ 16]。珠芽蓼属传统藏
药,又名高原拳参, 有退烧、止泻、调经、收敛止血
的功效[ 17]。近来研究发现珠芽蓼根茎具有明显的
抗超氧自由基作用[ 18] 、清除羟自由基作用 [ 19]和抗肿
瘤作用[ 16]。因此,本文选择了东祁连山高寒草地珠
芽蓼内生细菌为研究对象, 筛选和鉴定其中的固氮
菌,为高寒草地所特有的内生固氮菌的开发和利用
提供技术依据, 也为开发经济环保的生物菌肥提供
菌种资源。
1 材料与方法
1. 1 样地概况
试验地选自祁连山东端, 甘肃省天祝县金强河
甘肃农业大学高寒草原试验站前金杆沟山麓两侧。
北纬 3711~ 3718、东经 10223~ 10278, 海拔
2900~ 3200 m。年均温- 0. 1 , 全年大于 0 年积
温 1380 ;年日照时间 2600 h; 无绝对无霜期,冷季
长达 7个月, 植物生长季为 120- 140 d, 年降水量
416 mm,多为地形雨,集中于 7- 9月; 10月底至翌
年 4月为降雪期; 年蒸发量 1592 mm; 区内土层较
薄,厚 40~ 80 cm; 含水量 16. 32~ 29. 06%; 容重
0. 682~ 1. 120 g/ cm3 ;有机质含量高,为10%~ 16%。
1. 2 材料
2007年 7月中旬在珠芽蓼草地采集优势植物
珠芽蓼 5~ 10整株, 带回实验室分离内生菌保存备
用。菌株褐球(圆褐)固氮菌( A z otobacter chr oococ
cum 1. 178)和枯草芽孢杆菌( Baci l lus subt il i s ) 购
自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
T aq DNA 聚合酶、蛋白酶 K、溶菌酶、dNT P 和
氯仿、苯酚购自上海生工生物技术公司, DL2000marker
购自宝生物( T aKaRa)工程有限公司。其他化学试
剂均为国产分析纯。用于 DNA 提取的试剂制备参
考精编分子生物学实验指南等[ 20]。
1. 3 方法
1. 3. 1 内生细菌分离和固氮菌的筛选方法 将珠
芽蓼用水冲洗干净后称取 2 g,放在超净工作台上进
行消毒处理: 首先用 0. 1% SDS浸泡 30 min,然后在
3% NaClO浸泡 5 m in,再用0. 1%升汞浸泡15 min,
最后在 75%酒精中浸泡 1~ 2 min, 各消毒液之间均
用无菌水冲洗 3 次。取最后一次无菌水冲洗液
0. 2 mL涂布牛肉膏蛋白胨固体培养基,检测组织表
面是否带菌。消毒后的珠芽蓼置无菌研钵中研磨
后,各加 5 mL 无菌生理盐水,混匀,静置 15 min,取
1 mL 用无菌生理盐水稀释至 10- 5 , 取 10- 3、10- 4、
10- 53个稀释度的菌悬液各 0. 2 mL 涂布于牛肉膏
蛋白胨平板上;将平板倒置于 28 恒温培养箱培养
5- 7 d,根据菌落形态分类划线纯化, 将纯化后的菌
种 4 保存于牛肉膏蛋白胨斜面上 [ 21]。
用无菌生理盐水配制上述内生细菌幼龄菌悬
液,以 200 L 分别接种在阿须贝无氮平板(涂布)和
液体培养基内, 3 个重复, 以无菌水接种做对照,
28 培养(液体振荡 120 r/ min) ,在第3、7天目测其
生长状况,平板上有菌落和三角瓶内培养基变浑浊
者为阳性。
1. 3. 2 nif H 基因的扩增 参照文献 [ 22] 设计
nif H 基因引物, 对筛选出的内生固氮菌株的 ni f H
基因进行扩增、测序和生物信息学分析。ni f H 基
因引物序列为: nif H 34F5AAA GGY GGW AT C
GGY AAR TCC A CC AC3和 nif H 491R5T TG
T TS GCS GCR TAC ATS GCC AT C AT3,可以
553
草 地 学 报 第 17卷
扩增出约 460 bp的片段。
细菌基因组 DNA 的提取参考 F. 奥斯伯 [ 20] 等
的方法,略加改进。增加了 2 步操作: 用溶菌酶裂
解细菌,在用蛋白酶 K 之前先用加 5 L 的溶菌酶
( 50 mg / mL) , 37 水浴 1 h; 用等体积氯仿/异戊醇
( 24 1)除去苯酚, 将酚/氯仿/异戊醇( 25 24 1)
处理后的上清水相于另一离心管中,加等体积氯仿/
异戊醇( 241)充分混匀,离心,将上清液转移到-
1. 5 mL 新离心管中进行后续操作。
PCR 反应体系 10 buf fer5 L, MgCl2 ( 25
mM ) 5 L, dNT P( 5 mM) 1 L, nif H _34F ( 10 M )
1 L, ni f H491R ( 10 M ) 1 L, Taq DNA Po ly
mer se( 5 U/L) 0. 25 L, Template DNA1 L, (以
加固氮菌 1. 178 的 DNA 为阳性对照, 加超纯水 1
L 为阴性对照)补 ddH 2O 至 50 L。采用降落式
扩增,扩增程序为: 94 预变性 5 min; 94 变性 50
s, 59 退火 50 s(每循环降低 0. 5 , 共 7个循环) ,
72 延长 1 min; 94 变性 50 s, 55 退火 50 s,
72 延长 1 m in, 30个循环; 72 下延伸 8 m in;扩增
后,取 5 L 的扩增样品在 1. 2%的琼脂糖凝胶上
80V 电压下进行电泳检测,将亮度好、纯度高的特异
性条带( 460 bp左右)的 PCR产物送往上海生工生
物工程技术服务有限公司测序。
1. 3. 3 nif H 基因序列生物信息学分析 将所测
得的 ni f H 基因序列与 GenBank 中的相关数据进
行 Blast 相似性分析。然后, 用 DNA 分析软件
CLU STALX 1. 8 进行多重序列比较, 获取相似性
高的菌株 nif H 基因序列。再用 Mega (版本 4. 0)
中的邻接法( Neighbo rJoining )建立 ni f H 基因的
系统发育树, 其中的遗传距离用 TamuraN ei 公式
计算,枝长代表了分歧程度, 各枝上的数字是 1000
次 bootst rap重抽样分析的支持百分比。
1. 3. 4 固氮菌的鉴定 参照文献[ 23]进行菌体形
态观察和生理生化试验。用枯草芽孢杆菌( Baci l
lus subti li s )作为对照标准菌株, 以验证试验方法及
所用培养基正确性。
根据细菌 16SrDNA 两端的保守序列, 设计一
对细菌的通用引物, 用于 PCR扩增, 引物序列:引物
1: 5CCG GA T CCA GAG T TT GA T CAT GGC
TCA GCA3 , 引物 2: 5 CGG GAT CCT ACG
GCT ACC T TG TT A CGA CT T3。引物由上海
生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR 反应
体系同 1. 5. 2, 扩增程序为: 94 预变性 5 m in;
94 变性 40 s, 55 退火 30 s, 72 延长 1 min, 30
个循环; 72 下延伸 8 m in。扩增后, 取 5 L 的扩
增样品在 1%的琼脂糖凝胶上 80 V 电压下进行电
泳检测,将亮度好、纯度高的特异性条带( 1500 bp
左右)的 PCR产物置于- 20 下保存待测序。序列
的分析方法同nif H 基因。
2 结果与分析
2. 1 内生菌分离和内生固氮菌筛选
经过菌落形态对比最终从珠芽蓼内分离到内生
细菌 14 株, 分别编号为 Z21、Z22、Z23、Z24、Z25、
Z26、Z27、Z28、Z29、Z210、Z211、Z212、Z213 和
Z214。将分离得到的内生菌分别接种到阿须贝平
板和液体培养基中, 继代培养三代, Z22、Z24、Z25、
Z27、Z28、Z211、Z214共 7株可以生长, 具固氮能力;
但只有 Z22生长快菌落大,故对其做进一步研究 。
2. 2 nif H基因 PCR产物检测
nif H 基因 PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳
检测, 结果表明, 筛选出的 7 株内生固氮菌, 只有
Z22和阳性对照( A . chr oococcum 1. 178)在 460 bp
左右有一明亮的 PCR 特异性条带, 浓度都约为 60
~ 100 ng/ L , 且无其他非特异性条带(图1)。PCR
扩增获得的目的 DNA 片段产量髙、纯度好, 可用于
测序。该结果说明 Z22具有 ni f H 基因, 是一株内
生固氮菌。经测序 Z22 和 A . chroococcum1. 178的
nif H 基因分别是 441 和 435 个碱基; 将 A . chroo
coccum 1. 178和 Z22的 nif H 基因在 GenBank 中
登录, 获得登号分别为: EU 693338 和 EU693342
( ht tp: / / www. ncbi. nlm . nih. g ov)。
图 1 nif H基因 PCR扩增结果
F ig. 1 t he r esults o f PCR amplification o f nif H gene
注: CK1为阴性对照, CK2为阳性对照
Note: CK1: negat ive cont rol, CK2: posit ive cont rol
554
第 5期 李振东等:珠芽蓼内生固氮菌鉴定及其固氮基因分析
2. 3 nif H基因序列生物信息学分析
Blast 相似性分析结果表明: A . chroococcum
1. 178和 A . chroococcum ( M 73020)的 ni f H 基因相
似度高达 95% ; Z22和 A . chr oococcum ( M73020)的
nif H 基因相似度高达 96% ;在 nifH 基因的系统发
育树上 Z22 和 A z otobax ter sp. 的遗传距离比 Z22
和 Baci l lus sp. 的遗传距离近(图 2)。
图 2 Z22 nif H基因的系统发育树
F ig . 2 The nif H gene phy log enet ic tree of Z22 str ain
2. 4 固氮菌的鉴定
2. 4. 1 菌株形态特征的观察 在牛肉膏蛋白胨培
养基上 Z22菌落圆形扁平,边缘整齐, 土灰色, 无光
泽(图 3) ;菌体大小 1. 7- 4. 4 0. 6- 1 m。
图 3 Z22 的菌落
Fig . 3 Z22s colony
2. 4. 2 生理生化特征 固氮菌 Z22革兰氏染色呈
阳性, 产芽孢 (图 4、5) , 好氧菌, 具有运动性, 能在
pH510的范围内生长(图 6) ; 对供试的 8 种碳源
(葡萄糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、淀粉、甘油、
水杨素)都不能利用, 说明 Z22 对碳源的利用范围
非常狭窄。在所测的7种氮源中 Z22只能利用草酸
铵,其余 6种氮源(干酪素、硝酸钾、氯化铵、胱氨酸、
谷铵酸和尿素)均不能利用。其他测试结果见表 1,
所测试项目中标准菌株的反应均与文献报道一致。
根据伯杰氏细菌鉴定手册第八版和东秀珠常见细
菌系统鉴定手册初步鉴定 Z22 为球形芽孢杆菌
( Baci llus sphaericus)。
图 4 Z22革兰氏染色 图 5 Z22 芽孢染色
Fig . 4 Z22 Gram Fig. 5 Z22 Bacillus stain
2. 4. 3 16SrDNA PCR 产物检测 经琼脂糖凝胶
电泳检测,结果表明,从 Z22的基因组 DNA 中扩增
图 6 Z22最适 pH
F ig . 6 Z22 optimum pH
表 1 Z22和枯草芽孢杆菌部分生理生化特征
Table 1 Z22 and B. subtilis some of physio log ical
and biochemica l cha racterist ics
试验项目 T est it em Z22 枯草芽孢杆菌
B. su bt il i s
接触酶 C atalas e + +
吲哚试验 Form ed indole - -
硝酸盐还原 Nit rate redu ct ion - +
V . P.试验 V. P. test - +
7% NaCl生长Gow thw ith 7% NaCl - +
利用柠檬酸盐 U se of ci trate - +
利用丙酸盐 U se of propionate - -
淀粉水解 S tarch h ydrolysis - +
葡萄糖产气
Gas produ ct ion f rom glucos e
- -
葡萄糖利用 U se of glu cose - +
甘露醇利用 U se of manicol - +
木糖利用 U se of xylose - +
阿拉伯糖利用 U se of arab inose - +
酪氨酸利用 U se of ganimalon - -
果胶水解 Pect in hydrolysis - ND
明胶液化 Gelat in liqu efact ion - +
酪蛋白水解 Casein hydrolysis - +
出的 16SrDNA 核苷酸片段在 1500 bp左右处有一
明亮的 PCR 特异性条带, 浓度都约为 60 ~ 100
ng/L,且无其它非特异性条带(图 7)。说明 PCR
扩增获得的目的 DNA 片断产量髙、纯度好, 将其测
序, Z22的 16SrDNA 基因是 1450 个碱基, Z22的
16SrDNA 基因序列在 GenBank 中登录, 获得登录
555
草 地 学 报 第 17卷
号为 EU236749。
图 7 Z22 16SrDNA PCR电泳图
Fig . 7 Z22 16SrDNA PCR elect rophor esis map
2. 4. 4 16SrDNA 序列系统发育学分析 Blast 相
似 性 分 析 结 果, Z22 和 Bacil lus sp haer icus
( AY161044)相似度达 99%以上;从系统发育树(图
8)来看, Z22 与 Bacil lus sp haericus , Ly sinibaci l lus
sp haer icus 和L y sinibaci llus f usi f orm is 聚以一起,
Baci llus f usi f ormis 虽然在另一分支, 但其与 Z22
的遗传距离小于 0. 0012。说明 Z22与这 4种菌具
和很近的亲缘关系。一般认为, 16SrDNA 序列同
源性小于 98%属于不同的种[ 24] ,综合以上分子生物
学和生理生化结果确定 Z22 为球形芽孢杆菌( Ba
ci l lus sp haer icus )。
图 8 Z22 的 16SrDNA系统发育树
Fig . 8 16SrDNA phy lo genetic tree o f Z22
3 讨论
3. 1 珠芽蓼内生固氮细菌的分离筛选
与前人在经济作物和热带牧草等植物中分离到
内生固氮细菌的结果相比, 本试验中分离到的内生
细菌和内生固氮细菌数量较少。其可能原因为:
3. 1. 1 表面消毒 分离植物内生细菌时所选用的
表面消毒剂种类和消毒时间, 直接影响着分离的结
果。本试验选用 SDS、次氯酸钠、升汞、酒精四种消
毒剂,依次作用 30 m in、5 min、15 min、2 min。本试
验中表面消毒效果很好, 但是由于消毒剂的作用时
间长和较强的穿透力,不仅杀死了植物表面的细菌,
也杀死了植物表层的内生细菌。
3. 1. 2 对浸泡研磨植物组织的无菌生理盐水进行
稀释 经过梯度稀释方便了后续的纯化工作, 但是
也丢失了一些非优势内生细菌。
3. 1. 3 植物生长的环境 珠芽蓼生长在高寒草地,
低温高海拔的环境使微生物的数量减少了。
鉴于以上分析对以后分离植物内生细菌工作做
以下改进:优化表面消毒,选择穿透消毒力较弱的消
毒剂,适当缩短作用时间;直接将磨碎的植物组织涂
布于培养基或减少内生菌悬液的稀释。
3. 2 内生固氮菌的分子鉴定
所有固氮生物的固氮酶中都含有编码铁蛋白的
ni f H 基因。有研究表明, ni f H 亚基是固氮酶中最
保守的[ 25]。因此, ni f H 基因常常被用来作为检测
固氮菌的一个分子指标[ 5]。通过 ni f H 基因的 PCR
扩增获得了 Z22的 nif H 基因。说明高寒牧草珠芽
蓼内存在一定数量的内生固氮菌。球形芽孢杆菌
( B . sp haericus)
[ 3, 4] 作为植物内生固氮菌已有报
道,但球形芽孢杆菌( B. sphaericus)编码铁蛋白的
nif H 基因序列在 GeneBank 中没有记录,也未见文
献报道,本文为首次报道。
Young 等[ 26] 报道, nif H 基因的系统发育与
16Sr DNA 具有一致性, 本文的结果与之有差异。
在 nif H 基因系统发育树上 Z22 和 A z otobax ter
sp.的遗传距离比 Z22 和 Bacil lus sp. 的遗传距离
近,这与 16Sr DNA 系统发育不致, 可能是与已在
GenBank中登陆的芽孢杆菌属( Baci l lus) 细菌的
nif H 基因序列很少有关系; 也可能球形芽孢杆菌
( B . sphaer icus)的 ni f H 基因本身就与 Azo tobax
ter sp.的遗传距离近,具体原因有待于进一步研究。
If tikhar Ahmed 等[ 27] 认为 Baci llus f usif ormis 和
L y sinibaci llus f usi f orm is 同 物 异 名, Baci l lus
sp haer icus 和 L y sinibacil lus sphaericus 同一种菌;
Smith等 [ 28] ( 1952)认为 Bacil lus f usi f ormis 是Ba
ci l lus sp haericus 同物异名菌; 本研究在 16SrDNA
序列 BLAST 相似性分析时发现, 与 Z22相似度达
99%以上的球形芽孢杆菌( Bacil lus sp haer icus )有
28个, Baci l lus f usi f ormis 有 14个, Lysinibacillus
sphaer icus 有 7 个, Lysinibacillus fusiform is 有 4
个, Bacil lus sp. 有 25 个, Lysinibacillus sp. 有 10
个。通过以上笔者本文认为 Bacillus fusiform is 、
556
第 5期 李振东等:珠芽蓼内生固氮菌鉴定及其固氮基因分析
Bacillus sphaericus、Lysinibacillus fusiform is 和
Lysinibacillus sphaericus为同一菌。Z22与以上菌
的 16SrDNA 序列同源性大于 99% ,未达到 100% ,
可能与这些菌的生长环境不同有关,是同种菌的个
体差异。这种个体间的差异有待进一步研究。
3. 3 珠芽蓼内生固氮菌的生化特性
通过生理生化特性的测定发现 Z22 有以下适
宜植物内生的特性: Z22 具有运动性, 这有利于其
在珠芽蓼内运动, 定殖到最适宜的部位。有关内生
菌的定殖试验中,发现细菌能够从根部向上移动到
茎[ 9, 29]。接触酶可以催化将过氧化氢分解成为水和
氧的反应, Z22接触酶反应为阳性, 说明其具有排除
代谢过程产生的、具有毒性的过氧化氢能力, 以保护
细菌不被伤害。明胶液化试验阴性,不分泌明胶酶,
进入植物细胞后,不会将植物细胞中的蛋白质分解,
避免了对植物细胞正常生理活动造成不良影响; 果
胶水解试验阴性说明 Z22不分泌果胶质酶, 不分解
占植物体干重 15%~ 30%的果胶质, 不破坏植物中
毗邻细胞之间胞间层。Z22不产吲哚, 说明 Z22 不
会将植物细胞中的色氨酸转化成吲哚, 不会影响植
物细胞蛋白质的有效合成。固氮菌 Z22对供试的 8
种碳源都不能利用;在所测的 7种氮源中 Z22只能
利用草酸铵,其余 6 种氮源均不能利用。这可能与
Z22在珠芽蓼体内长期生存适应性有关。
明胶液化、果胶水解和吲哚试验均为阴性使
Z22避免了对宿主造成损害, 接触酶阳性保护 Z22
自身不被宿主伤害; Z22通过固氮作用给宿主提供
一定的氮素。Z22能与宿主和谐共生。以上研究表
明, Z22可作为一株为植物提供氮素的生物菌肥菌
种。Z22是如何侵入珠芽蓼、寄主范围是否广泛尚
待进一步研究。
4 结论
本试验从珠芽蓼内分离到内生细菌 14株,其中
7株具固氮能力; 菌株 Z22在阿须贝无氮培养基生
长快菌落大,故对其做进一步的研究;根据生理生化
测定结果和 16SrDNA 序列系统发育学分析, 参考
相关文献鉴定 Z22为球形芽孢杆菌( Bacil lus spha
er icus ) ;本文为首次报道了球形芽孢杆菌( B. spha
er icus)编码铁蛋白的 ni f H 基因序列。
参考文献
[ 1] 丘元盛,周淑萍,莫小真,等.稻根联合固氮细菌的研究 I 菌种
的分离和鉴定[ J] . 微生物学报, 1981, 21( 4) : 468472
[ 2] 罗明, 卢云. 植物内生固氮菌研究进展[ J] . 微生物学杂志,
2005, 25( 1) : 8288
[ 3] 杨海莲,孙晓璐,宋未,等.水稻内生联合固氮细菌的筛选、鉴定
及其分布特性[ J] . 植物学报, 1999, 41( 9) : 927931
[ 4] 王逸群,郑金贵,陈文列,等.水稻内生固氮细菌的分离及鹑鸡
肠球菌在水稻根中的分布[ J ] .热带亚热带植物学报, 2005, 13
( 4) : 296302
[ 5] 侯伟,彭桂香,许志钧,等.广东省刺竹内生固氮菌多样性 [ J ] .
农业生物技术学报, 2007, 15( 2) : 290294
[ 6] 陈丽梅,樊妙姬,李玲. 甘蔗内生固氮菌 重氮营养醋杆菌的
研究进展[ J] .微生物学通报, 2000, 27( 1) : 6366
[ 7] 安千里,李久蒂.植物内生固氮菌 [ J ] . 植物生理学通讯, 1999,
35( 4) : 265272
[ 8] 王逸群,钟秀容.水稻内生固氮细菌的生化特性及其对烟草和
玉米的侵染[ J] .云南植物研究, 2008, 30( 2) : 211220
[ 9] Reinh oldHmek B, H urek T , Gillis M et a l . Azoarcus gen .
nov. nit rogenf ixing proteobacteria ass ociated w ith root s of
Kal lar grass ( Leptorh loa fu sca ( L. ) Kun th) , and descriplion of
tw o species, Azoarcus indigen s sp. nov. and Azoarcus com
munis sp. nov. Int J Sys t Bacterial , 1993, 43: 574584
[ 10] 郑红丽,庞保平,樊明寿,等.羊草根际固氮菌的分离及其生长
条件的研究[ J] . 华北农学报, 2007, 22( 1) : 172177
[ 11] 彭桂香, 王华荣, 张国霞, 等. 糖蜜草内生固氮菌 ISPCR 和
16SrRNA 基因全序列分析[ J ] .华南农业大学学报, 2005, 26
( 4) : 7376
[ 12] 申磊,曾凤云,谭志远. pH、温度、NH+4 和盐度对圆果雀稗内
生固氮菌固氮特性的影响 [ J ] .热带亚热带植物学报, 2007, 15
( 1) : 4044
[ 13] 李久蒂,孙捷,匡柏健, 等. 沙竹中内生固氮菌的分离及鉴定
[ J] .植物学通报, 1997, 14 ( 1) : 52
[ 14] 吴若菁,陈奋飞,王逸群,等.香椿中内生固氮菌的分离筛选与
鉴定[ J] .福建师范大学学报(自然科学版) , 2007, 23( 4) : 129
132
[ 15] 张彩霞,胡凤祖. 珠芽蓼果实营养成分分析[ J ] . 天然产物研究
与开发, 2005, ( 5) 614616.
[ 16] 王一峰,杨文玺,王春霞,等. 甘肃野生药用植物珠芽蓼[ J] . 中
兽医医药杂志, 2005, (2) 2426.
[ 17] 张彩霞,李玉林,胡凤祖. 珠芽蓼果实化学成分研究[ J] . 西北
植物学报, 2005, ( 2) . 386387
[ 18] 陈仕江,马开森,钟国跃. 珠芽蓼抗超氧自由基作用研究 [ J ] .
西南农业学报, 2005, (1) . 3335
[ 19] 蔡仲军,陈仕江, 马开森,等. 珠芽蓼清除羟自由基作用研究
[ J] . 中国药物与临床, 2004, ( 2) 9698.
[ 20] F.奥斯伯, R.布伦特, R. E .金斯顿等. 精编分子生物学实验指
南 [ M ] .北京:科学出版社, 1998. 3940
[ 21] 满百膺,陈秀蓉,李振东. 高寒牧草内生细菌分离培养条件的
优化[ J] . 草原与草坪, 2008, ( 5) : 2730
[ 22] Rosch C, Mergel A, Bothe H . Biodiver sity of den it rifying an d
dinit rogenf ixing bacteria in an acid forest soil [ J] , Appl En vi
ron M icrobiol, 2002, 68: 38183829
[ 23] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[ M ] .北京: 科学出版
社, 2001. 6265, 353412
[ 24] 易有金,尹华群,罗宽,等. 烟草内生短短芽孢杆菌的分离鉴定
及对烟草青枯病的防效[ J] .植物病理学报, 2007, 37( 3) : 301
306.
[ 25] 张于光, 王慧敏, 李迪强, 等. 三江源高寒草甸土固氮基因
( ni f H )的多样性和系统发育研究 [ J ] . 微生物学报, 2005, 45
( 2) : 166171
[ 26] Young J P W. Phylogen et ic classif icat ion of nit rogenf ixing or
ganisms[ A] . In : Stacey G, Burris RH , Evan s H J. ed. Bio
logical Nit rog en Fix at ion[ C] . New York : Chapman and H all ,
1992, 4386
[ 27] Ift ikh ar Ahm ed, Akira Yokota, Atsushi Yamazoe e t a l . Pro
posal of L ysinibacillus boronitoleran s gen . n ov. , s p. nov. ,
an d t ransfer of Bacillu s fusiformis to L ysinibacillus fusiformis
comb. nov. and Bacillu s sph aericus to Lysinibacil lus sphaeri
cus com b. nov. Int . J. Syst . Evol . M icrobiol. , 2007, 57,
11171125.
[ 28] R. E.布坎南 N. E.吉本斯等. 伯杰细菌鉴定手册[ M ] .北京:
科学出版社, 1984. 729748
[ 29] 迟峰,沈世华,陈三凤,等. 巴西固氮螺菌 Yu62由水稻和烟草
根部向茎、叶的迁移运动[ J] . 植物学报, 2004, 46( 9 ) : 1065
1070
(责任编辑 才 杰)
557