全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2001) 02-0099-07
苜蓿基因组 DNA提取和 RAPD反应条件优选
袁庆华1 ,桂　枝2,张文淑1
( 1.中国农业科学院畜牧研究所, 北京 100094; 2. 甘肃农业大学,兰州 730070)
摘要: 采用 CTAB 法、N 2—SDS 法、SDS 法和改进的 CT AB 法,提取苜蓿基因组 DNA, 比较其分离效果。结果表
明, 改进的 CTAB 法为最佳提取法。对 RAPD 反应程序中的一些重要参数进行摸索和优化试验, 建立适合苜蓿
RAPD 分析应用的体系组成为: 反应液总体积 25 LL, 174 ng /LL 模板 DNA, 2. 5 LL 10x 反应缓冲液 , 10 碱基引物
浓度 0. 1 Lmol/ L , T aq DNA 聚合酶 1 U , dNTP 浓度 0. 3 mmo l/ L , Mg 2+浓度 2. 5 mm ol/ L。PCR 反应循环为: 94℃
4 min, 36℃ 30 s, 72℃ 1 min; 94℃ 30 s, 36℃ 30 s, 72℃ 1 min, 45 个循环; 72℃ 延伸 10 min。
关键词: 苜蓿; DNA 提取方法; RAPD; 反应条件
中图分类号: S541; Q943　　文献标识码: A
Optimization of Alfalfa Genomic DNA Extraction And RAPD Conditions
YUAN Qing-hua
1
, GU I Zhi
2
, ZHANG Wen-shu
1
( 1. Institute of Animal Science , CAAS, Beijing 100094, China; 2. Gansu Ag riculture U niver sity , L anzhou 730070, China )
Abstract: Four differ ent methods w ere tested in isolat ion of alfalfa (Medicago sativa) genomic DNAs. T he
results show that the reformed CT AB is mo re ef fective. Based on the genom ic DNA ex tracted f rom alfalfa,
essent ial facto rs af fecting the result of RAPD assay w ere tested and compared. An opt imal react ion sy stem
suitable fo r the assay and usage of RAPD in alfalfa w as established. T his opt imal of 25 LL reaction solution
contained 2. 5 LL 10x buffer , 2. 5 mmo l/ L MgCl2, 0. 3 mmol/ L each dNT P, 0. 1 Lmo l/ L random primer, 174
ng/ LL template DNA, 1 U T aq po lymerase. The react ion prog ram was devised fo r one cycle at 94℃ 4 m in-
utes, 36℃ 30 seconds, 72℃ 1 minute, w hich is fol low ed by 45 cycles, each w ith 30 seconds at 94℃, 30 sec-
onds at 36℃, 1 minutes at 72℃, and a f inal ex tension at 72℃ for 10 m inutes.
Key words : Alfalfa; DNA ex tract ; RAPD; React ion conditions
　　快速提取高质量的 DNA 分子是植物基因组研
究的基础,也是对植物遗传转化后的组织、再生植株
或后代进行分子鉴定的前提。目前,国内外已有许多
DNA 提取方法,这些方法因研究对象和目的不同而
异。本实验选用 3种有代表性的 DNA 提取方法,并
对其中一种方法加以改进。以此对苜蓿总 DNA 提
取进行比较研究, 以便从中筛选出快速、简便且可获
得高质量 DNA 分子的方法。在确定有效分离方法
并获得高质量 DNA 后, 再进一步优选适合苜蓿的
RAPD 条件, 使之能够获得清晰和稳当的扩增效
果,为进一步开展苜蓿分子生物学研究奠定基础。
1　材料与方法
1. 1　试验材料
供试材料为伊鲁瑰斯苜蓿(Medicago sat iva L.
cv. Iroquo is)和沙湾苜蓿(M . sativa L. cv. Shaw an) ,
种子由中国农业科学院畜牧所提供。
苜蓿种子经 0. 1%升汞消毒后放入消毒培养皿
的滤纸上,加适量灭菌水以保持种子吸水膨胀后, 放
　　收稿日期: 2000-10-26;修回日期: 2001-03-08
　　基金项目:国家自然科学基金(编号 39870559)资助项目
　　作者简介:袁庆华( 1959-) ,女,副教授,在中国农业科学院畜牧研究所工作,目前从事草地保护及品种资源的研究工作,已发表论文 30余篇
第 9卷　第 2期
　Vol. 9　　No. 2
草　地　学　报
ACTA AGREST IA SIN ICA
　2001 年　6月
June 　2001
入 20℃生长箱,发芽 2 d,待幼根长到 1 cm 时, 移植
到装有蛭石和草碳(比例为 1∶2)的塑料盆( 5 cm×
7 cm) ,并接种根瘤菌。每盆栽 1株, 放入温室, 温度
为 10～30℃, 2个月后取顶部嫩叶进行 DNA 提取,
各品种分别取 20个单株。
1. 2　DNA提取方法
1. 2. 1　CT AB 法　各样品称取 100 mg 嫩叶为实
验材料,按照 Etch 等的方法 [ 1]提取DNA。用 752-C
型紫外分光光度计测定 DNA 的纯度和浓度, 根据
浓度测定值用 0. 1×T E 将 DNA 沉淀稀释到
0. 1 mg / mL, 置于- 20℃冰箱备用。
1. 2. 2　N 2-SDS 法　各样品称取 100 mg 嫩叶, 按
照 Pich 等的方法[ 2]提取苜蓿基因组 DNA, 最后将
DNA 溶于 TE 缓冲液( pH8. 0)中。
1. 2. 3　SDS 法　各样品称取 100 mg 嫩叶切成小
片,按照顾红雅等的方法[ 3]提取 DNA, 沉淀经过真
空抽干后溶于 T E 液( pH8. 0)中。
1. 2. 4　改进 CT AB法　各样品称取 100 mg 单叶,
置于 1. 5 mL 离心管中, 加液氮,用特制研棒(前端
形状与离心管吻合,在液氮中预冷 1 min)研磨至粉
末,加入 900 LL 预热到 65℃的 2×CT AB 缓冲液
( 100 mmol / L Tr is-HCl; 20 mmol/ L EDTA;
1. 4 mo l/ L NaCl; 2% CTAB) , 65℃水浴 20 min(每
隔 2 min 摇匀一次) ,取出放凉。加入500 LL 氯仿—
异戊醇混合液( 24∶1)摇匀,在 4℃下7500 rpm离心
10 min。取上清液置 1. 5 mL 离心管中, 再加入 500
LL 氯仿—异戊醇,轻轻混匀后, 在 4℃下 7500 r pm
离心 10 min。取出上清液置于新的离心管中, 加入
1/ 10体积 3 mo l/ L N aAc 和等体积的异丙醇,轻摇
至出现絮状沉淀。弃去上清液后,用 75%乙醇( 100
LL)清洗两次,室温下干燥 1 h, 溶于 T E缓冲液( pH
8. 0)。
1. 3　RAPD扩增反应
1. 3. 1　扩增反应在 0. 5 mL 离心管中进行, 25 LL
的反应体系中含有: 10×缓冲液 2. 0 LL, 15 mmol / L
M gCl2 3. 5 LL, 100 mmol/ L dNT P 0. 05 LL(上海生
工公司产品) , 5 pmol/LL 10碱基引物 0. 05 LL(美
国 OPERON 公司产品, G1—20) , T aq DNA 聚合酶
1 U (中国科学院遗传所提供) , DNA 模板 1 LL,其
余体积以 ddH2O 补足。利用 Biomedizinische Ana-
ly tik GmbH 公司的 Personal CyclerTM扩增仪进行
扩增。
1. 3. 2　扩增反应程序:预变性 94℃ 4 min, 36℃ 30
s, 72℃ 1 min; 94℃变性 30 s, 36℃退火30 s, 72℃延
伸 1 m in, 45个循环; 72℃延伸 10 min。
1. 3. 3　取 10 LL 的 PCR扩增产物与 2 LL 溴酚蓝
( 0. 25%溴酚蓝, 0. 25%二甲苯氰蓝, 40%蔗糖)混
匀, 点入含有 0. 5 Lg / mL 溴化乙锭的 1. 2%琼脂糖
凝胶中,在 5 V/ cm 电场强度下电泳 1～2 h, 取出凝
胶,紫外灯下观察照相。
1. 4　RAPD反应条件优选
确定最佳反应条件时, 对反应体系的因素设置
不同的梯度水平:模板 DNA 浓度分别设置为 43. 5
ng /LL、87 ng/LL、174 ng /LL、261 ng /LL、348 ng /
LL、435 ng /LL; Mg 2+ 浓度为 0. 5 mmol / L、1. 0
mmol / L、1. 5 mmol / L、2 mmol/ L、2. 5 mmol/ L、3. 0
mmol / L、3. 5 mmol/ L ; T aq DNA 酶的浓度为 0. 25
U、0. 5 U、0. 75 U、1. 0 U、1. 25 U、1. 5 U; dNTP 的
浓度为 0. 1 mmol/ L、0. 2 mmol/ L、0. 3 mmol/ L、0.
4 mmol / L、0. 5 mmol/ L、0. 6 mmol / L ;引物浓度依
次为 0. 05 Lmol/ L、0. 1 Lmol/ L、0. 15 Lmol/ L、0. 2
Lmol/ L、0. 25 Lmol/ L ;预变性时间设置为 0 m in、1
m in、2 min、3 min、4 min; 退火温度为 35℃、36℃、
37℃、38℃、39℃。在整个反应过程中,除对上述比较
因素进行梯度设置而变动外, 其余参数和反应条件
不变, 并相应地调整 ddH 2O 量以保持反应体系为
25 LL,以确保试验的准确性和可比性。
2　结果与分析
2. 1　基因组 DNA提取方法比较
2. 1. 1　紫外吸收检测
用 4 种方法提取的 DNA , 分别在 Beckman
DU-70型紫外分光光度计进行不同波长的紫外吸
收检测,重复测定 4次(表 1)。可以看出, 用 4种方
法提取的 DNA A 260 / A 280均高于 1. 8,其中CTAB 法
和 SDS 法, 两个供试苜蓿 DNA 的 A 260/ A 280分布在
1. 8～1. 9 之间, 而改进 CT AB 法的 A 260 / A 280为
1. 95, N 2-SDS 法略高于 2. 0, 说明用 4 种方法提取
的 DNA 中都含有 RNA 杂质, 只是 CT AB 法和
SDS法提取的 DNA 中 RNA 杂质较少。此外,用这
100 草　地　学　报 第 9卷
4种方法提取 DNA 的 A 310值均较低,说明有机杂质
的含量均较低。DNA 产量间的比较表明, 改进
CTAB 法提取 DNA 的产率最高, 浓度可达 170～
180 Lg / mL,其次为 N 2-SDS 法,浓度 149～160 Lg/
mL,而 CT AB法和SDS法的 DNA 产率较低。
2. 1. 2　琼脂糖凝胶电泳检测
将 4种方法提取的基因组 DNA 分子(沙湾苜
蓿)在含有 0. 5 Lg/ mL 溴化乙锭的 0. 8%的琼脂糖
凝胶上电泳分离结果见图 1。4种提取方法均能获得
苜蓿基因组 DNA ,但其完整性和产量间存在差别。
SDS 法不仅产量较低, 而且有大量降解片断存在;
CT AB 法虽然降解片段略少, 但是 DNA 的得率不
高; 改进 CT AB 法和 N 2-SDS 法在产量和完整性方
面都较理想。
表 1　苜蓿基因组 DNA 紫外吸收状况
Table 1　U V absorption condit ions of t he a lfalfa genomic DNA
苜蓿品种
Alfal fa variety
方法
Method
A 230
　
A 260
　
A 280
　
A 310
　
A 260/ A 280
　
A 260/ A 230
　
DNA 产率
( Lg/ mL )
伊鲁瑰斯苜蓿 CT AB 0. 070 0. 102 0. 056 - 0. 003 1. 821 1. 457 105
M edicago sat iv a SDS 0. 045 0. 064 0. 035 - 0. 006 1. 829 1. 422 70
L . cv. Iroquois N 2-SDS 0. 128 0. 158 0. 078 0. 009 2. 026 1. 234 149
改进 CT AB 0. 146 0. 184 0. 094 0. 004 1. 957 1. 260 180
Reformed CT AB
沙湾苜蓿 CT AB 0. 069 0. 105 0. 056 0. 007 1. 875 1. 522 98
M edicago sat iv a SDS 0. 057 0. 083 0. 044 0. 002 1. 886 1. 456 81
L . cv. Shaw an N 2-SDS 0. 109 0. 161 0. 076 0. 001 2. 118 1. 477 160
改进 CT AB 0. 090 0. 172 0. 088 - 0. 002 1. 955 1. 911 174
Reformed CT AB
图 1　沙湾苜蓿基因组 DNA 样品电泳分析
Fig . 1　Electropho ret ic analy sis of Shaw an
alfalfa g enomic DNA samples
　　1. N 2-SDS 法 N 2-SDS meth od　2. 改进的 CTAB法 Reformed
CT AB meth od　 3. SDS 法 SDS method　 4. CT AB 法 CT AB
meth od
2. 1. 3　RAPD扩增检测
2. 1. 3. 1　以 4种 DNA 提取方法获得的沙湾苜蓿
为材料, 以 OPG1-20为引物进行检测, 将扩增产物
在含有 0. 5 Lg / mL 溴化乙锭的 1. 2%琼脂糖凝胶进
行电泳分析(图 2)。结果表明,在 20种引物中 OPG-
5的扩增效果最好, 4种方法中,除 SDS法无法扩增
出谱带外,其余 3种方法均能扩增出谱带, 尤以改进
CT AB法提取的 DNA 做模板时RAPD 谱带清晰,比
其它方法的谱带多、清晰。对该结果进行了 5次重复,
除某些微弱谱带外,其它主带型均表现良好的重复性。
图 2　沙湾苜蓿基因组 DNA样品 RAPD 分析
F ig . 2　RAPD analysis of Shaw an alfalfa
g enomic DNA sample
　　1. 改进CTAB法 Reformed C TAB m ethod　2. N 2-SDS 法 N 2-
SDS m ethod　3. CTAB法 CT AB method　4. SDS 法 SDS meth od
101第 2期 袁庆华等:苜蓿基因组 DNA 提取和RAPD反应条件优选
2. 1. 3. 2　分别用紫外吸收检测、琼脂糖凝胶电泳检
测和 RAPD 扩增 3 种分析方法对 SDS 法、CT AB
法、N 2-SDS 法、改进 CTAB 法提取的基因组 DNA
进行分析,结果表明, 后者最适于苜蓿基因组 DNA
提取, 用该法提取的 DNA 不仅纯度较高、产量高、
完整性好, 而且产生带型丰富、清晰的 RAPD图谱。
SDS 法和 CTAB 法提取的 DNA 尽管纯度高,但是
产量高,降解片段多,扩增结果较差。DNA 产量低可
能与叶片未经液氮充分冷冻和研磨、组织破碎程度
低、残余的核糖核酸酶活性并未全部被抑制、以及提
取步骤多有关。
2. 1. 3. 3　用 4种方法提取的 DNA 中有机杂质的
含量均较低, 这与氯仿、异戊醇的混合使用有关。氯
仿不仅对蛋白质具有变性作用, 且与水不相混溶,不
会带走基因组 DNA。在抽提 DNA 时,为了混合均
匀,必须充分震荡容器数次,这时在混合液内容易产
生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用。异戊醇能降
低分子表面张力,因此加入异戊醇后能减少抽提过
程中气泡的产生, 并且有利于分相,使离心后的上层
水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持
稳定。
2. 1. 3. 4　在 SDS 法和 CTAB 法提取基因组 DNA
的过程中,由于 RNase A 酶中混杂的脱氧核糖核酸
酶常会将部分或全部 DNA 降解掉,所以经 RNA 降
解后会对RAPD反应产生影响,从而影响RAPD图
谱的重复性。而改进的 CTAB 法和 N 2-SDS法均没
有使用 RAase A 酶,但却获得了较理想的基因组
DNA ,表明模板 DNA 中的 RNA 对扩增结果无影
响, 结果与汪小泉等[ 5, 6] 在银杉 ( Cathaya ar gy-
roghy lla)研究的一致。
2. 2　RAPD反应条件比较
RAPD反应条件, 主要包括反应体系组成和热
循环状态。由于 RAPD 对反应体系要求较严格,扩
增反应中诸成分的变化都可能影响到扩增结果。因
此,对影响 RAPD反应结果的主要因素:模板 DNA
量、Taq DNA 聚合酶酶量、Mg2+ 浓度、dNT P 浓度、
引物浓度等进行比较试验, 确定最优的反应体系,以
期得到稳定的反应结果。而在热循环条件中,则主要
考虑预变性时间和退火温度, 至于延伸温度, 是由
Taq DNA 聚合酶本身的特性所决定的,一般不需要
调整。
2. 2. 1　建立苜蓿 RAPD反应体系
2. 2. 1. 1　文献报道的 RAPD 分析时不同植物使用
的模板 DNA 浓度各不相同 [ 7, 8] , 为确定苜蓿 RAPD
分析时模板 DNA 浓度, 采用 25 LL 反应体系,试验
共设计 6个浓度。由 PCR扩增结果可见(图3) ,模板
DNA 加样量为 43. 5～261 ng /LL 的情况下,均能产
生 RAPD 条带,说明 RAPD技术对模板 DNA 浓度
的要求不很严格。但是,低浓度时只有清晰的主带,而
无弱带,高浓度时有非特异扩增产物出现。建议在苜
蓿的研究中,取 174～348 ng /LL 的模板浓度即可。
图 3　模板 DNA 浓度对扩增结果的影响
F ig . 3　Effect of template DNA concentr ation
on amplification pattern
　　1. 43. 5 n g/ LL　2. 87 ng /LL　3. 174 ng/ LL　4. 261 n g/ LL　
5. 348 ng/ LL　6. 435 ng / LL
2. 2. 1. 2　Mg 2+是 RAPD反应中的一个重要因素,
M g
2+为 T aq DNA 聚合酶的激活剂, 其浓度不仅影
响酶的活性及合成的可靠性, 而且还影响引物与模
板的结合效率、模板与 PCR产物的解链温度以及产
物的特异性和引物二聚体的形成 [ 4]。在实验中共设
置 7个Mg 2+梯度,从图 4的扩增结果可知, M g2+ 浓
度过低 ( ≤0. 5 mmol/ L ) , 无扩增产物; 而在 1
mmol / L～3. 5 mmol / L 的 Mg 2+ 均能产生条带, 但
低浓度的 Mg2+ (≤2. 0 mmol / L )所产生的带型不稳
定, 高浓度的 Mg 2+ (≥3. 5 mmol/ L )出现非特异性
扩增。只有 2. 5 mmol / L 的 Mg 2+浓度可以获得最佳
的扩增效果。
2. 2. 1. 3　T aq DNA 聚合酶是扩增反应的关键因
素, 改变 Taq DNA 聚合酶浓度, 从低到高共设置 6
102 草　地　学　报 第 9卷
个梯度。由图 5可见, T aq DNA 聚合酶具有很高的
活性,即使在低浓度( 0. 25 U)下也有扩增结果, 只
是条带稍少且不稳定; 在高浓度( 1. 5 U )下带型丰
富,而且非特异性扩增产物增多; 1. 0 U 和 1. 25 U
扩增带型清晰可见。从实验效果及节约实验费用的
角度考虑, 在 25 LL 反应体系中, 1. 0 U T aq DNA
聚合酶量较合适。
2. 2. 1. 4　三磷酸脱氧核苷酸( dNT P)作为 PCR 反
应的原料,其浓度的大小直接影响产物的产量、特异
性及合成的可靠性。实验中共设置 6个梯度。结果
表明 dNTP 为 0. 1 mmo l/ L 时, 产生的条带较少,
0. 2 mmol / L～0. 6 mmol/ L 时条带间差异不显著
(图 6) , 这说明PCR反应对 dNTP 量的要求不很严
格, 0. 1 mmol / L 以上即可满足扩增所需,随着量的
图 4　Mg2+ 浓度对扩增结果的影响
Fig . 4　Effect of M g2+ concentr ation
on amplification patt ern
　　 1. 0. 5 mmol /L 　 2. 1. 0 mmol/ L　 3. 1. 5 mm ol / L　 4. 2
mmol / L　5. 2. 5 mmol/ L　6. 3. 0 mmol/ L　7. 3. 5 mmol/ L
图 5　Taq DNA 聚合酶浓度对扩增结果的影响
Fig. 5　Effect o f Taq po lymera se concentr ation
on amplification pattern
　　1. 0. 25 U　2. 0. 5 U　3. 0. 75 U　4. 1. 0 U　5. 1. 25 U　6.
1. 5 U
图 6　dNTP 和引物浓度对扩增结果的影响
F ig . 6　Effect o f concent ration of dNTP and primer on amplifica tion pattern
　　( 1) dNTP 的浓度　dNT P concent rat ion: 1. 0. 1 mmol/ L　2. 0. 2 mm ol / L　3. 0. 3 mmol / L　4. 0. 4 mmol / L　5. 0. 5 mmol/ L　6. 0. 6
mmol / L
　　( 2)引物浓度　primer con cent rat ion: 1. 0. 25 Lm ol/ L　2. 0. 2 Lmol / L　3. 0. 15 Lmol/ L　4. 0. 1 Lmol/ L　5. 0. 05 Lmol/ L
103第 2期 袁庆华等:苜蓿基因组 DNA 提取和RAPD反应条件优选
增加, 扩增产物也增多,但当浓度过高时, dNT P 容
易与Mg2+ 结合而降低游离Mg2+ 浓度从而影响 Taq
DNA 聚合酶的活性。
2. 2. 1. 5　在 25 LL 反应体系中,对引物( OPG15)用
量设置了 5个梯度, 1. 0 U T ap DNA 聚合酶,扩增
结果见图 6。加入 0. 05 Lmol/ L 引物后,无扩增结果
或条带减少;引物用量在 0. 1 Lmol/ L～0. 25 Lmol/
L 之间, 扩增结果无明显差异, 均可以得到丰富、稳
定的条带,且非特异扩增产物较少。这是因为引物浓
度过低,无法与所有的模板 DNA 结合位点结合,导
致扩增结果不理想;引物浓度过高时,会促使引物错
误地引导非特异性产物——引物二聚体的合成,非
特异性产物和引物二聚体亦均是 PCR 反应的底物,
与靶序列竞争 DNA 聚合酶和底物dNT P, 均使靶序
列的扩增量降低, 而出现非特异条带。结合实验费用
和效果等因素考虑,引物浓度应采用 0. 1 Lmo l/ L。
2. 2. 2　确定热循环状态
预变性时间: 实验中分别对预变性进行 0 min
～4 min 5个处理的设置, 发现各处理间的扩增带型
存在差异(图 7)。预变性时间短, 模板没有充分解
链,引物无法完全结合到模板上,则条带少或有减弱
的趋势, 只在 4 min 时得到了丰富、清晰的条带,故
应采用 4 min的预变性时间。
图 7　预变性时间对扩增结果的影响
F ig . 7　Effect of initially denatur ed t ime
on amplification patt ern
　　1. 0 min　2. 1 min　3. 2 min　4. 3 min　5. 4 min
　　引物退火温度:对退火温度共设置 5个处理。由
图 8可见, 温度高于或低于 36℃,都不能得到满意
的扩增结果, 一方面是无扩增产物或量少, 另一方面
是非特异性产物多。因此建议对苜蓿采用 36℃的退
火温度。
图 8　退火温度对扩增结果的影响
Fig. 8　Effect o f annealing t emperatur e
on amplification pattern
　　1. 35℃　2. 36℃　3. 37℃　4. 38℃　5. 39℃
　　由于 RAPD 反应非常敏感、重复性较差, 很容
易受反应条件的影响,因此应根据扩增片段的大小、
引物长度和( G+ C) %调节热循环条件,摸索出适合
于不同植物的反应条件。延伸温度一般设置为
72℃,以利于 T aq DNA 聚合酶发挥其最佳活性[ 4] ,
若温度不适宜不仅会影响其扩增产物的特异性, 而
且还会影响其产物。由于核苷酸掺入率为每秒 16～
35个核苷酸[ 9] , 苜蓿基因组 DNA 扩增出的片段一
般为 0. 2 Kb～2 Kb,故本试验延伸时间确定为 1
m in。如果时间太长,将会引起非特异性扩增。
3　结语
3. 1　以 2 个苜蓿品种为材料进行 4 种 DNA 提取
方法的比较研究,试验证明改进 CTAB 法提取苜蓿
基因组 DNA 效果最佳, 其主要优点是: 提取 DNA
纯度高、产量大、完整性好、而且可产生丰富的带型
和清晰的 RAPD图谱。
3. 2　试验筛选出适合苜蓿随机扩增多态性 DNA
( RAPD)的反应条件为:在 25 LL 的反应体系中, 含
有 1 LL 模板, 2. 5 LL 的 10×反应缓冲液, 10 碱基
引物的浓度为 0. 1 Lmo l/ L , T aq DNA 聚合酶 1 U ,
dNTP 的浓度为 0. 3 mmol/ L , M g2+ 浓度为 2. 5
mmol / L。PCR反应循环为: 94℃ 4 m in, 36℃ 30 s,
104 草　地　学　报 第 9卷
72℃ 1 min; 94℃ 30 s, 36℃ 30 s, 72℃ 1 min, 45个
循环; 72℃延伸 10 min。
参考文献
[ 1]　Ech t C S , Erdahl L A, McCOY T J. Genet ic seg regat ion of ran-
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(上接 91页)
3　结论
3. 1　不同放牧强度条件下,多年生黑麦草/白三叶
人工草地的饲用价值各异,以适度放牧区的价值为
高,草地质量指数为 78. 4,粗蛋白质含量高, 粗纤维
含量低。
3. 2　引起人工草地退化的首要因素是 0～10 cm土
壤速效磷含量, 偏相关系数为 0. 7655,但放牧引起
的土壤紧实及其互相作用是人工草地退化的重要因
素。
3. 3　分析人工草地的饲用价值和退化原因,不难认
为,适度放牧不但可获得较高利用价值,而且是维系
群落稳定防止退化的重要措施。
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105第 2期 袁庆华等:苜蓿基因组 DNA 提取和RAPD反应条件优选