全 文 ：第 18 卷
第 6 期

Vol. 18
No. 6
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2010 年
11 月

Nov.

2010
红三叶新品系无菌苗培养体系优化
高雪芹1, 2 , 王俊杰1, 2* , 云锦凤1, 2* , 侯永霞1 , 贾文秀1
( 1. 内蒙古农业大学生态环境学院, 内蒙古 呼和浩特
010019;
2.内蒙古自治区草品种育繁工程技术研究中心, 内蒙古 呼和浩特
010019)
摘要 : 以红三叶( T r if olium p ratense L . )新品系为材料, 对无菌苗培养的种子消毒方法和培养基组成进行研究, 以
期为红三叶新品系组培再生体系、分于育种及抗病性研究提供基础依据。结果表明: 0. 1% HgCl2 , 3% NaClO 和
15% H2O2 消毒不超过 15 min,对红三叶新品系种子发芽率没有显著影响,但消毒效果存在较大差异。红三叶种
子消毒的最佳方法为 75%酒精预处理, 0. 1% H gCl2 消毒 10 min, 发芽率可达 89. 44% ,并彻底无污染。最适培养
基为 1/ 4MS+ 1. 5%蔗糖,不添加激素, pH 6. 0, 发芽率可达 85. 78% , 无菌苗生长良好。培养基中无机盐的含量是
影响红三叶种子发芽率和无菌苗生长的关键因素。琼脂培养基培养比滤纸培养的无菌苗子叶和下胚轴出愈率显
著提高,但不同组分琼脂培养基的无菌苗出愈率无显著差异。
关键词:红三叶新品系; 无菌苗;种子消毒; 培养基;组织培养
中图分类号: Q813. 12; S339. 31



文献标识码: A




文章编号 : 1007
0435( 2010) 06
0880
05
Optimization for Aseptic Culture of Red Clover (Trif olium pratense L. )
GAO Xue
qin1, 2 , WANG Jun
jie1, 2* , YU N Jin
feng1, 2* , HOU Yong
x ia1 , JIA Wen
x iu1
(1. College of Ecology and Environmental Science, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot , Inner Mongolia Autonomous Region 010019, China;
2. Inner Mongolia Engineering Technology Research Center for Forage Breeding and Reproduction, Huhhot, Inner Mongolia Autonomous Region 010019, China)
Abstract: Effects for bo th seed disinfect ion methods and medium composit ion on tissue culture w ere inves

t ig ated in red clover ( T ri f ol ium p ratense L. ) . Results show that seed germinat ion rate has no significant
dif ferences using 0. 1% HgCl2 , 3% NaClO, o r 15% H 2O 2 sterilizat ion for less than 15 m in. H ow ever, the
ef f iciency o f sterilization is differ ent betw een the three disinfectants. T he best method of seeds ster ilizat ion
fo r red clover is the 75% ethyl alcoho l t reatment fol low ed by disinfection w ith 0. 1% HgCl2 for 10 min.
Germ inat ion rate reaches 89. 44% and is completely pollution
free. T he most suitable medium is 1/ 4M S
plus 1. 5% sucro se w ithout ho rmones at pH 6. 0 for seed culture. Germinat ion rate reached 85. 78% and
seedling s grew w ell w ith this medium . T he content of inorg anic salts in medium is one of the key factors
af fect ing seed germinat ion and grow th in aseptic cultures. Cal lus induction rates of coty ledons and hypo

cotyl are signif icantly increased in agar medium as compar ed w ith filter paper, but with no significant
dif ference among dif ferent components agar medium.
Key words: New line of red clover; A sept ic seedling; Seed disinfectant ; M edium; Tissue culture


红三叶( T r if ol ium p r atense L. )是豆科( Legu

minosae)车轴草属( Tr if olium L. )的一年生或多年
生牧草,以地中海为中心, 广泛分布于欧亚大陆、非
洲、南北美洲的温带地区,被世界各地广泛地用作牧
草、草坪地被和水土保持植物。我国自 20 世纪 30
年代引种以来, 三叶草主要在长江以南中下游平原
的鄂、湘、苏、浙、皖以及低山丘陵区的云、贵、川等地
栽培种植[ 1] , 但在内蒙古广大的草原畜牧业基地却
没有合适的三叶草品种。红三叶新品系是内蒙古农
业大学以内蒙古大兴安岭地区自然分布的红三叶为
材料,经过长期栽培驯化和系统选育而形成的抗寒
型新品系。该品系在内蒙古中西部的耐寒性和适应
性表现突出,填补了内蒙古乃至我国寒冷草原区红
三叶育种的空白。
组织培养研究中无菌苗的获得常常是关键环节
之一,无菌苗的好坏直接影响外植体的质量。在分
子生物学研究中, 为避免微生物的污染,常常用无菌
苗来提取高质量的 RNA [ 2]。无菌苗还能鉴定植物
的抗病性, 张志元[ 3] 用无菌苗法鉴定了油菜( Bras
sica campest ri s L. )对菌核病的抗性及抗病生理。
收稿日期: 2010
09
16; 修回日期: 2010
11
03
基金项目:内蒙古科技厅重大项目( 20071923
1)资助
作者简介:高雪芹 ( 1984
) ,女,甘肃白银市人,博士研究生,研究方向为牧草种质资源与育种, E
mail: qin qin _803@ sina. com; * 通讯作者
Auth or for correspon dence, E
m ail : jjw 62@163. com; csgrass@ public. hh. nm. cn
第 6期 高雪芹等: 红三叶新品系无菌苗培养体系优化
关于三叶草无菌苗培养的研究较少,许仕珍等[ 4] 研
究了卡那霉素对白三叶( T ri f ol ium r ep ens L. ) 种
子发芽及无菌苗生长的影响, 表明卡那霉素对白三
叶种子发芽势和发芽率没有影响,但对根系和地上
部分的生长作用显著,田新会 [ 5]研究了 NaClO和蔗
糖溶液对红三叶种子发芽特性的影响。本文研究了
不同消毒方法和培养基对新品系萌发生长的影响,
优化了红三叶无菌苗培养体系, 为建立红三叶新品
系组培再生体系、分子育种及抗病性研究等奠定了
基础。
1
材料和方法
1. 1
材料
红三叶新品系种子来源于内蒙古农业大学红三
叶新品系原种繁殖田,于 2008年 8月至 9月采收。
1. 2
方法
1. 2. 1
种子消毒处理的优化
挑选饱满、大小均匀
的种子,砂纸磨擦破除种子硬实。消毒之前用纱布
包裹,自来水冲洗约 20 min, 再用 75%的乙醇浸泡
0. 5~ 1 min后用无菌水冲洗 5~ 6 次, 灭菌滤纸吸
干种子表面。分别用 15% H 2O 2 和 3% NaClO 溶
液浸泡红三叶种子 5, 10, 15 m in, 0. 1% HgCl2 溶液
分别浸泡 6, 8, 10 min。无菌水冲洗 4~ 5次, 用无
菌滤纸吸干种子表面残留液体。每个处理设 3次重
复,共计 27个处理。以无菌水中浸泡 10 min 的处
理为对照( CK)。然后用滤纸培养法测定种子发芽
数、硬实数、吸涨未萌发数和种子霉烂数。即 100
mL 三角瓶,垫两层滤纸,加入适量蒸馏水, 121
灭
菌 20 min。每瓶放 30粒种子, 每个处理重复 4次。
GXZ268B 培养箱培养温度( 25
0. 5)
、光照 12 h

d- 1、光强 2000 lx。第 10 d观测结果。
1. 2. 2
无菌苗适宜培养基的筛选
75%酒精 30 s
+ 0. 1% HgCl2 10 min 消毒处理, 培养基培养法:
100 mL 三角瓶倒入 50 mL 不同成分培养基, pH
6. 0, 琼脂 7%, 121
灭菌 20 min。以 MS, 1/ 2M S,
1/ 4M S, B5及不添加 NH +4 的 MS和 1/ 2MS 为基础
培养基,添加不同的蔗糖浓度 0%, 1. 5%, 3%, 滤纸
培养条件下为对照( CK) ,筛选无菌苗适宜培养基,
共计 13 个处理, 每瓶 30 粒, 7 次重复 (表 2)。1/
2M S为 MS无机盐减半, 1/ 4M S为 MS 无机盐减为
原来的 1/ 4, 无 NH +4 处理即大量元素中去除
NH 4NO 3。GXZ268B 培养箱培养, 温度 ( 25

0. 5)
、光照 12 h
d- 1、光强 2000 lx。第 10天观
测种子发芽数。
1. 2. 3
不同培养基无菌苗对子叶和下胚轴外植体
出愈率的影响
以不同培养基上培养第 8 d的无菌
幼苗子叶和下胚轴为材料,比较外植体质量对愈伤
组织诱导的影响。将下胚轴剪成 5 mm左右长的小
段,子叶切为两半, 置于 MS+ 2. 0 mg
L - 1 2, 4D
+ 0. 5 mg
L- 1 6
BA 培养基上, pH 6. 0, 琼脂
7% ,蔗糖 3%, 在温度( 25
0. 5)
条件下暗培养。
每瓶 7个外植体,重复 7 次(表 2)。第 20 d 统计子
叶和下胚轴出愈数。
1. 2. 4
数据计算和处理
发芽率( %) = 10天内正常发芽的种子粒数/供
试种子粒数
100
硬实率( %) = 10天内硬实种子粒数/供试种子
粒数
100
吸涨未萌发率( % ) = 10 天内吸涨未萌发种子
粒数/供试种子粒数
100
霉烂率( %) = 10天内霉烂种子粒数/供试种子
粒数
100
愈伤出愈率( %) = 20天内出愈块数/植入总外
植体数
100
SAS 9. 0进行数据统计和方差分析。
2
结果与分析
2. 1
消毒方法对红三叶种子消毒效果及萌发的影响
不同消毒处理红三叶新品系种子发芽率稍有不
同, 但差异不显著, 平均发芽率在 89. 44% ~
92. 78%之间。0. 1% HgCl2 处理 6, 8, 10 min, 种子
吸涨未萌发率分别为 1. 11% , 2. 22%和 4. 72%, 差
异显著,表现出 HgCl2 处理时间增加毒害加重, Na

ClO和 H 2O 2 毒害轻微。平均霉烂数以 15% H2O2
处理最高, 3% NaClO 次之, 0. 1% HgCl2 最低,
0. 1%HgCl2处理 10 min,消毒彻底无污染(表 1)。
2. 2
培养基成分对红三叶种子萌发及无菌苗生长
的影响
2. 2. 1
无机盐离子对三叶草发芽率和生长情况的
影响
不同培养基影响种子的萌发时间、发芽率和
生长情况。在滤纸培养条件下红三叶第 2天即可露
出胚根开始萌发, MS 和 B5 培养基推迟种子的萌发
时间, 第 4 天才开始萌发, 降低无机盐浓度和无
NH
+
4 的处理第 3天萌发。
881
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报 第 18卷
表 1
消毒方法对红三叶种子消毒效果和萌发特性的影响
Table 1
Effects on germination characterist ics and disinfection efficacy o f T r if olium p ratense new line in different ster ilization
消毒剂
Disinfectant
处理时间, min
Tim es
发芽率, %
Germ inat ion rate
硬实率, %
Hard rate
吸涨未萌发率, %
Imbib it ion al non
germ inat ion rate
霉烂率, %
Rot rate
0. 1% H gCl2 6 92. 78
3. 98a 5. 28
2. 64a 1. 11
1. 64 bcd 0. 83
1. 51bcd
8 92. 22
4. 10a 5. 00
3. 89a 2. 22
2. 17 b 0. 56
1. 30d
10 89. 44
3. 12a 5. 83
3. 22a 4. 72
2. 23 a 0. 00
0. 00d
3% NaClO 5 90. 00
5. 32a 5. 83
3. 52a 0. 28
0. 96 cd 3. 33
2. 84ab
10 91. 67
3. 89a 5. 83
3. 79a 0. 67
1. 51 cd 1. 67
2. 25bcd
15 89. 72
3. 88a 6. 67
4. 26a 0. 56
1. 30 cd 3. 33
2. 46ab
15% H 2O 2 5 91. 11
5. 19a 4. 72
4. 13a 0. 00
0. 00 d 4. 17
4. 29a
10 90. 28
5. 77a 6. 11
3. 43a 1. 16
2. 24 bc 3. 06
2. 64ab
15 89. 17
4. 74a 6. 39
3. 61a 1. 11
1. 64 bcd 3. 33
2. 84ab
CK 10 91. 11
4. 34a 6. 11
4. 68a 0. 00
0. 00 d 2. 78
2. 39abc


注: 同列小写字母为差异显著性水平( P < 0. 05)。下同
Note: Different let ters in th e sam e colum n in dicate s ignif ican t dif feren ces ( P < 0. 05) . T he s am e as below


在 MS, 1/ 2M S及 1/ 4M S培养基上种子发芽率
最高分别为 34. 27%, 62. 94%和 85. 78%,随着无机
盐离子浓度的降低种子发芽率明显呈上升趋势, 差
异显著。1/ 4M S培养基发芽率达到 85. 78% , 与对
照滤纸培养条件下 85. 99%几乎相等,已经消除了
培养基无机盐离子对三叶草发芽的抑制作用。无
NH +4 的 MS 及无 NH +4 的 1/ 2M S 比 MS 及 1/ 2MS
发芽率明显提高, 低铵的 B5 也比 MS 发芽率高,
NH +4 显著影响三叶草的种子萌发。
25 d后幼苗生长好坏依次为 MS> 无 NH +4 的
MS, 1/ 2M S> 无 NH +4 的 1/ 2MS, 1/ 4M S> B5。MS
培养基幼苗鲜绿健壮, 无 NH+4 和降低盐浓度的 1/
2M S, 1/ 4MS 长势比 MS 差, B5 生长最差, 幼苗偏
黄,且有坏死茎(表 2)。
2. 2. 2
蔗糖浓度对三叶草发芽率和生长情况的影
响
MS培养基, 蔗糖浓度 3. 0% , 1. 5%, 0%时, 发
芽率为 18. 46% , 20. 78%和 34. 27%, 差异显著, 随
蔗糖浓度的降低发芽率升高。1/ 2M S 培养基和 1/
4M S培养基,蔗糖浓度 3. 0% , 1. 5%, 0%,发芽率分
别为 53. 29%, 62. 94% , 43. 36% 和 74. 59%,
85. 78% , 72. 73% , 蔗糖浓度 1. 5%, 发芽率最高。
观察 25 d后的幼苗,没有发现蔗糖浓度对其生长状
况的显著影响,而幼苗在MS, 1/ 2MS, 1/ 4M S, B5无
NH
+
4 培养基上生长状况差异显著(表 2)。
表 2
不同培养基对三叶草种子萌发及无菌苗生长的影响
Table 2
Effects on germination and g r owt h o f T r if ol ium p ratense new lines in different media
处理
T reat
培养基
Medium
蔗糖浓度, %
Su crose con cen t rat ion
胚根初露天数, d
Frist radicle appeared days
发芽率, %
Germination rate
25 d后幼苗生长状况
Gr ow th statu s af ter 25 d
1 M S 3. 0 4 18. 46
7. 00g + + + +
2 M S 1. 5 4 20. 78
5. 52fg + + + +
3 M S 0 4 34. 27
7. 56ef + + + +
4 1/ 2MS 3. 0 3 53. 29
7. 84c + + +
5 1/ 2MS 1. 5 3 62. 94
8. 81bc + + +
6 1/ 2MS 0 3 43. 36
9. 86e + + +
7 1/ 4MS 3. 0 3 74. 59
7. 80ab + +
8 1/ 4MS 1. 5 3 85. 78
3. 80a + +
9 1/ 4MS 0 3 72. 73
8. 25ab + +
10 无 NH +4 MS 1. 5 3 49. 73
7. 84cd + + +
11 无 NH +4 1/ 2MS 1. 5 3 69. 15
6. 89b + +
12 B5 1. 5 4 33. 57
8. 54ef +
13 CK 0 2 85. 99
8. 01a



注: + + + + 幼苗鲜绿,健壮; + + + 幼苗鲜绿,茎秆细嫩; + + 幼苗嫩绿,茎秆细嫩; + 幼苗偏黄,且有坏死茎叶;
没有生长
Note: + + + + excellent seedling grow th; + + + good seedl ing g row th; + + m oderate seedling grow th; + moderate s eedl ing grow th ,
l it tl e yellow leave;
no grow th
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第 6期 高雪芹等: 红三叶新品系无菌苗培养体系优化
2. 3
不同培养基无菌苗对子叶和下胚轴出愈率的
影响
为了比较不同培养基无菌苗是否对愈伤组织诱
导效果产生影响,以无菌苗子叶和下胚轴为外植体
进行了愈伤组织诱导,结果见表 3。
表 3
不同培养基条件下无菌苗子叶和下胚轴出愈率
Tabel 3
Callus induction r ate of hypoco tyl and
co tyledon in differ ent aseptic seedling
处理
T reat
无菌苗培养基
Medium
下胚轴出愈率, %
Cal lus induct ion
rate of hypocotyl
子叶出愈率, %
Callus induct ion
rate of cotyledon
1 M S+ 1. 5%蔗糖 100
0. 00a 100. 0
0. 00a
2 1/ 2M S+ 1. 5%蔗糖 100
0. 07a 97. 96
0. 07a
3 1/ 4M S+ 1. 5%蔗糖 100
0. 00a 97. 96
0. 07a
4 无 NH +4 MS+ 1. 5%蔗糖 97. 96
0. 07a
95. 92
0. 10a
5 无 NH +4 1/ 2MS+ 1. 5%蔗糖 100
0. 00a 100. 0
0. 07a
6 B5+ 1. 5%蔗糖 97. 96
0. 32a
95. 92
1. 99a
7 CK 40. 82
0. 07b
8. 16
0. 10b


由表 3可以看出, 6个琼脂培养基培养的无菌
苗子叶和下胚轴出愈率都很高, 达到 95. 92% ~
100. 0%, 方差分析显示, 在 0. 05水平上没有显著差
异。而对照滤纸培养下的无菌苗,子叶和下胚轴出
愈率仅为 40. 82%和 8. 16% ,显著低于琼脂培养基
培养的无菌苗( P< 0. 05)。
3
讨论与结论
3. 1
消毒剂和消毒时间会影响种子的发芽率和生
长情况,消毒剂在杀灭微生物的同时伤害外植体 [ 6]。
邢少辰等[ 7] 研究表明,升汞和次氯酸纳处理使浸泡
的栽培大豆 ( Gly cine max ( L inn. ) M err. )发芽率
极低。吴志刚等[ 8] 发现单纯使用 NaClO溶液处理
番茄( L y cop ersicon esculentum M il ler )种子消毒不
彻底,将近 20%有污染, 0. 1% HgCl2 虽然能有效控
制污染,但毒害严重,仅有 8%的种子发芽率。代宁
波等[ 9] 用 15%的 H 2O 2 消毒新疆紫草( Ar nebia eu

chr oma ( Royle ) Johnst . ) 种子 15 m in 发芽率达
92. 5%, 升汞消毒种子发芽率仅为 52. 7%。而且
H 2O2 具有腐蚀作用, 消毒后会加大种子向外渗漏
物质[ 10~ 1 2] ,影响种子发芽。可见常用的 H gCl2 , Na

ClO 和 H 2O 2消毒,存在消毒不彻底及毒害难去除
降低种子的发芽率的局限性。NaClO 消毒常用浓
度2% ~ 5%,厚彦明等[ 13]用 9%高浓度NaClO溶液
中震荡 25 min, 作为岷山红三叶种子的消毒方法,
但未对其消毒效果进行评价。本试验中使用 0. 1%
HgCl2 , 3% NaClO 和 15% H 2O 2 等消毒剂处理并
未明显影响红三叶新品系种子发芽率, 0. 1% HgCl2
消毒 10 min 种子发芽率为 89. 44%, 处理间差异不
显著( P< 0. 05) , 尽管吸涨种子的未萌发率增加到
4. 72% ,但相比其他几个处理消毒彻底无任何污染,
为最佳选择, 3% NaClO 和 15% H 2O2 消毒效果
差,污染严重。由此可见,不同植物种子对消毒剂的
耐受能力存在差异, 红三叶新品系种子对这 3种消
毒剂具有一定的耐受能力。
3. 2
除消毒方法外,不同的培养基也会影响种子的
发芽率。徐皓等[ 14] 对冬瓜 ( B enincasa hisp ida
( T hunb) Cogn. )无菌苗培养的研究认为,大量元素
含量越少,越利于萌发。本研究也得到相同的结果,
不同无机盐含量的培养基中,红三叶新品系种子发
芽率由低到高依次为 MS< 1/ 2MS < 1/ 4MS, 而且
各培养基间的差异显著。MS 培养基中的硝酸盐、
钾和铵的含量高, 三叶草萌发推迟且发芽率降低,但
MS培养基的高离子浓度保证了离子间的平衡及组
织生长所需的矿质营养,有利于植物的生长,无菌苗
生长最优。随着离子浓度降低, 植株表现出不同的
缺素症状。1/ 4M S盐浓度添加 1. 5%蔗糖种子发芽
率最高达 85. 78%为最佳培养基。无 NH +4 的 MS
和低铵 B5都比 MS发芽率显著提高, 可见 NH +4 对
三叶草种子发芽抑制作用明显, 但 NH +4 对植物的
生长有益,利于无菌苗的壮苗。
3. 3
吴志刚等[ 8]研究表明,蔗糖浓度增加会降低番
茄种子发芽率,蔗糖浓度达到 3%时发芽受抑制,浓
度过低又会影响长势。Anderson 等[ 15] 研究认为,
植物提取物的渗透压大于 1. 5
105 Pa 时, 对许多
植物种子发芽产生显著影响。田新会[ 5] 研究表明,
红三叶种子在没有添加蔗糖溶液 1/ 2M S培养基中
发芽率最高, 但长势较差。本研究结果显示, MS 培
养基随蔗糖浓度的降低种子发芽率升高, 但 1/ 2M S
和 1/ 4M S培养基并没有表现出种子发芽率随蔗糖
浓度的降低而升高的趋势, 而是蔗糖浓度在 1. 5%
时,发芽率最高。表明在较高无机盐含量的 MS 培
养基上,蔗糖抑制种子发芽,不添加蔗糖最利于红三
叶种子发芽。在无机盐含量较低的 1/ 2MS 和 1/
4M S培养基上, 红三叶种子发芽受到无机盐和蔗糖
的双重影响,适宜的蔗糖浓度有利于提高种子发芽
率。红三叶种子萌发的最适培养基组成为 1/ 4M S
+ 1. 5%蔗糖。
3. 4
不同琼脂培养基上的无菌苗,子叶和下胚轴出
(下转 896页)
883
草
地
学
报 第 18卷
究的关键。本研究采用全生育期内定期监测土壤含
水量,定量复水法使干旱胁迫处理下的土壤含水量
在 7. 17%~ 10. 23% 范围内变化, 土壤墒情处于相
对干旱状态,在此环境下进行抗旱性研究更具有科
学意义。植物对干旱的适应性和抵抗能力最终要体
现在产量上,产量是育种过程和生产过程中追求的
最终目标。运用全生育期内干旱胁迫, 以实现经济
产量为目的,依据抗旱指数对供试品种抗旱性进行
评价,既考虑了旱作条件下品种的稳产性又兼顾了
丰产性。与种子萌发期 PEG 干旱胁迫以及幼苗期
反复干旱法只侧重品种的抗旱稳产性相比, 全生育
期抗旱鉴定更具科学性,试验结果更具代表性。依
据抗旱指数评价供试品种抗旱性的相对强弱, 但不
同品种间的抗旱性等级无法划分。原因有二: 一是
是高丹草与小麦属不同属作物, 运用小麦抗旱性分
级标准来对高丹草的抗旱性进行分级是不合适的;
二是研究中供试品种数量少, 试验年限短,难以对抗
旱性等级进行划分。
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(责任编辑
李美娟)
(上接 883页)
愈率没有显著差异,而对照滤纸培养条件下的无菌
苗,子叶和下胚轴出愈率很低。因此,尽管滤纸培养
的种子能快速萌发得到子叶和下胚轴, 但愈伤诱导
效果不佳, 不能用于组培无菌苗的培养。琼脂培养
基无菌苗出愈率高的主要原因一方面可能是种子一
开始就处在无机盐环境中, 得到了一定的耐受性锻
炼;另一方面可能是琼脂培养基营养充分,无菌苗比
滤纸培养条件下的苗强壮,活力更旺盛。
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