全 文 ：第 16 卷 第 1 期
Vol. 16 No . 1
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2008 年 1 月
Jan. 2008
加拿大披碱草、肥披碱草及其杂种 F1 RAPD分析
李小雷, 于 卓* , 贺鹏程, 马艳红, 李造哲
(内蒙古农业大学农学院, 呼和浩特 010019)
摘要: 利用 RAPD技术对加拿大披碱草( Elymus canadens is L . )和肥披碱草( Elymus ex celsus T urcz. )及其杂种 F 1
的遗传差异性进行研究,从 153 个随机引物中筛选出 16 个适宜引物, 共扩增出 215 个 RAPD 位点, 多态性位点比
率为 72. 1% ,平均每条引物的多态性位点为 4. 3~ 4. 8 个, DNA 片段长度在 100~ 2000 bp 之间。加拿大披碱草与
肥披碱草的遗传距离较大( 0. 7122) , 杂种 F 1 与父本肥披碱草的遗传距离较近( 0. 2329) ,而与母本加拿大披碱草相
对较远( 0. 6643) , 杂种 F1 更偏向其父本。该结果可为加拿大披碱草- 肥披碱草杂种后代的育性恢复和选育利用
提供依据。
关键词: 加拿大披碱草; 肥披碱草; 种间杂种; 基因组 DNA; RAPD
中图分类号: Q943 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2008) 01-0023-05
RAPD Analysis of Elymus canadensis , E. excelsus
and their Hybrid F1
LI Xiao- lei, YU Zhuo* , HE Peng-cheng, MA Yan-hong, LI Zao-zhe
( College of Agronomy, Inner Mongolia Agricultu re University, H ohh ot , Inner Mong ol ia Autonomous Region 010019, Chin a)
Abstract: The genet ic diversity of E lymus canad ensi s L. , E . ex cel sus T urcz. , and their hybrid F 1 were an-
aly zed by the RA PD molecular marker technolog y. T otal 215 loci w ere amplified f rom 16 primers out of
153 random primer s, the polymorphic loci percentag e w ere 72. 1%. T he no. of band per primer ranged
from 4. 3 to 4. 8, and the f ragment length of the amplif ied products w as f rom 100 to 2000 bp. T he genetic
distance betw een E . canadensis and E. ex cel sus reached to 0. 7122, w hile hybrid F1 was clo ser to to male
E. ex celsus ( 0. 2329) than female E. canad ensi s ( 0. 6643) , and hybrid F1 leaned to E. ex cel sus. These re-
sults could be used as foundat ion fo r the fert ility restor at ion and ut ilization o f the hybrid of E. canad ensi s
and E. ex cel sus.
Key words: Elymus canadensis L. ; Elymus ex cel sus Turcz. ; Interspecific hybrid; Genomic DNA ; RAPD
披碱草属植物是禾本科植物中与人类生存密切
相关的一大类群,它是良好的饲草和水土保持植物,
也是改良栽培小麦、大麦和黑麦的重要基因资
源[ 1~ 3]。加拿大披碱草( Elymus canadensis L. , 2n
= 4x= 28,染色体组 SSHH)具有产草量高、草质好
的特性,肥披碱草( E lymus ex celsus T urcz. , 2n= 6x
= 42, 染色体组 S fS fH fH fYY)具有抗寒、抗旱、耐瘠
薄等特性。为创造结合双亲优良特性的披碱草新种
质,我们将引自北美州的四倍体栽培种-加拿大披碱
草与产于内蒙古草原的六倍体驯化草种-肥披碱草
相组配进行远缘杂交, 成功地获得了种间杂种 F1
代。观察发现,该杂种 F1 代为五倍体( E. canadensis
@ E. excelsus, 2n= 5x= 35,染色体组 SSfHH fY) ,其
杂种优势很强,具有重要的育种利用价值[ 4~ 8]。
RA PD标记技术(随机扩增多态性 DNA)以其
引物无种属特异性、模板用量少、成本低、操作简单
快捷等优点,已被广泛用于植物遗传多样性分析、远
缘杂种鉴定、遗传作图、目标性状基因标记和辅助选
择育种等方面 [ 1] 。本试验拟对加拿大披碱草、肥披
碱草及其杂种F 1进行RAPD研究 , 旨在从基因组
收稿日期: 2007-07-06; 修回日期: 2007-09-03
基金项目: 国家自然科学基金( 30560100)和内蒙古自然科学基金( 200607010505)资助项目
作者简介: 李小雷( 1980-) ,男, 黑龙江绥化人,博士研究生,研究方向为饲用作物遗传育种; * 通讯作者 Au th or for correspondence,
E- mail : yuzhuo58@ sina. com
草 地 学 报 第 16卷
DNA 分子水平分析亲本间与其杂种 F 1 代间的遗传
差异性和相似性,为其杂交后代的育性恢复和选育
利用提供依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
供试材料为加拿大披碱草、肥披碱草及其杂交
种 F1 , 均种植在内蒙古农业大学农作物试验场。
1. 2 方法
1. 2. 1 基因组 DNA 的提取及纯度检测 2006 年
春季,分别从加拿大披碱草、肥披碱草及其杂交种
F1 代的材料圃中剪取分蘖期幼叶 0. 2 g (各材料随
机取 10个单株的叶片混合提取) ,先用自来水冲洗
杂质,再用蒸馏水和三蒸水各冲洗 2 次, 吸水纸吸
干,利用植物基因组 DNA 试剂盒(天根公司产品)
提取 DNA。取 5 Ll DNA溶液用 1. 2%的琼脂糖凝
胶电泳进行纯度检测,电泳缓冲液为 1 @ TAE Buff-
er,电泳 30 m in后, 取出胶板放入装有 0. 5 Lg/ ml
EB 中染色 30 min, 胶板用 Biometr a UVIdoc 凝胶
成像系统仪照相。最后将各材料的 DNA 浓度稀释
至 20 ng /Ll备用。
1. 2. 2 PCR反应条件与反应体系 参照 Williams
等的方法[ 9, 10] ,通过对 DNA 的浓度、引物等条件的
优化, 达到最佳的反应条件。聚合酶链式反应
( PCR)条件设置为: 94 e 预变性 4 m in, 每个循环
94 e 变性 45 s, 37 e 退火60 s, 72 e 延伸 1. 5 min, 40
个循环,最后 72 e 延伸 10 m in。
参照高海波等的实验方法[ 11] ,扩增反应总体积
25 Ll,反应液组成为 1 @ PCR buffer、2. 0 mmol/ L
MgCl2、0. 2 mmol/ L dNTP、0. 4 Lmol/ L 引物、1 U
Taq聚合酶、40 ng 模板 DNA。
1. 2. 3 引物筛选 以双亲的 DNA 样品做模板, 对
Sangon公司合成的 153个引物进行筛选, 选出能产
生条带清晰,重复性好的引物用于 PCR扩增试验。
1. 2. 4 扩增产物的分离与检测 DNA 扩增产物在
1. 0%的琼脂糖凝胶中稳压( 120 V)电泳分离,用 1.
0 @ T AE电泳缓冲液, 并用 DL 2000作为标准分子
量 Marker,电泳约 45 m in后,将凝胶放入 0. 5 Lg/
mL 的溴化乙锭中染色,照相。
1. 2. 5 DNA谱带的统计 在确定双亲间及其与杂
种F1 代间的遗传关系时, 分别把母本、父本、F1 代视
为3个群体,统计其 DNA谱带的多态性,同一引物的
扩增产物在电泳中迁移率相同的条带为同源性条带,
属于同一位点的条带将清晰可见的强带和反复出现
的弱带记为/ 10,否则为/ 00,形成二元统计数据[ 1, 9]。
1. 3 遗传多样性与遗传结构分析
1. 3. 1 多态性位点百分率 根据种群间 RAPD图
谱的位点差异,统计特异位点(即多态性位点)数目
占所有检测位点的百分数,即为遗传多态性位点百
分率: P ( %) = ( P/ B) @ 100%, P 表示多态座位数, B
表示所有扩增座位数[ 9] 。
1. 3. 2 种群间的遗传距离和遗传相似度 任意两
个体间的 Nei 氏遗传相似度和遗传距离为: S =
2Nxy/ ( Nx+ Ny) , D= 1- S。式中 S 为遗传相似
度, D为遗传距离; Nx、Ny 表示不同样品或种群中
的 RAPD标记数; Nxy 表示两个样品或种群中共同
拥有的 RAPD标记数, S、D的计算用 RA PDistance
2. 0软件 [ 12]。
2 结果与分析
2. 1 DNA的纯度
由图 1看出,用植物基因组试剂盒提取亲本加
拿大披碱草和肥披碱草及其杂种 F1 分蘖幼苗
DNA, 均出现 1条清晰的 DNA 带, 无拖尾现象, 说
明所提 DNA 完整性好, 纯度高,无降解现象, 完全
符合 RAPD的实验要求。
图 1 亲本及杂种 F1 的基因组 DNA电泳检测
Fig. 1 Elect rophores is detect ion of genomic DNA of
paren ts and hybrid F1
1. 母本加拿大披碱草 E. canad ensi s, Female; 2. 父本肥披碱草
E. ex cel sus, Male; 3. 杂种 F1 H yb rid F1
2. 2 RAPD扩增结果
从 153个引物中筛选出谱带清晰、稳定性好的
16个引物,对加拿大披碱草、肥披碱草及其杂种 F1
的基因组 DNA 进行 PCR 扩增,共检测到 215个位
点,其中 155 个位点具多态性, 多态性位点比率为
72. 1% (表 1、图 2)。
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第 1期 李小雷等:加拿大披碱草、肥披碱草及其杂种 F1 的 RAPD分析
表 1 引物序列及其扩增结果
T able 1 P rimer sequence and amplificat ion results
引物
Primer
序列( 5.-3. )
Sequen ces
总位点数
T otal loci
多态位点数
Polymorphism loci
多态位点百分率
Polymorp hism percentage ( % )
S445 CCCAGTCACT 15 3 20
S488 CT CCAGCGGA 17 14 82. 4
S516 CTCT GCGCGT 16 16 100
S510 CCAT TCCCCA 11 8 72. 7
S517 CCGT ACGT AG 10 10 100
S494 GGACGCT T CA 10 10 100
S480 GACCCT AGTC 17 8 47. 1
S441 GGCACGT AAG 16 7 43. 8
S1011 T CCGCTGAGA 15 9 60
S1004 CT CCCCAGAC 16 10 62. 5
S3 CAT CCCCCT G 14 11 78. 6
S519 CCT CCT CATC 13 10 76. 9
S1012 T CCAACGGCT 12 12 100
S470 T CCCGCCTAC 9 6 66. 7
S50 GGTCTACACC 12 12 100
S125 CCGAATT CCC 12 9 75
T otal 215 155 72. 1
图 2 部分引物的 RAPD图谱( A、B)
Fig . 2 RAPD plate of partial primer( A , B)
1.母本加拿大披碱草 E . canad ensi s, f emale; 2.父本肥披碱草 E. e xc el su s, male; 3.杂种 F1 Hyb rid F1 ; M . DNA m ak er( DL 2000)
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草 地 学 报 第 16卷
表 2 供试材料基因组 DNA扩增条带统计
T able 2 Amplificat ion bands of tested mater ials. genomic DNA
材料
Material s
条带数
Band number
条带数变幅
Chan ging b readth of ban d No.
各引物平均条带数
Average band No. of each p rimer
DNA 片段长度
DNA ( bp) length
加拿大披碱草 E. canad ensi s 68 1~ 7 4. 3 100~ 2000
肥披碱草 E . e xce lsus 71 3~ 6 4. 4 100~ 2000
种间杂种 F1 H ybrid F1 76 2~ 7 4. 8 100~ 2000
各种材料扩增的 RAPD 带数范围为 68~ 76
条,各引物带数变化幅度为 1~ 7条,平均每引物的
带数范围为 4. 3~ 4. 8条, 扩增片段长度在 100 ~
2000 bp之间。不同引物检测的位点数变动于 9~
17之间, 多态性位点变动于 3~ 16 之间, 且不同引
物扩增出的多态性位点数有较大差别, 其多态性位
点比率在 20%~ 100%之间(表 2)。
16个引物中,多数引物检测的多态性位点百分
率较 高, 如 S516 ( 100% )、S517 ( 100%)、S494
( 100% )、S1012( 100%)、S50( 100%)、S488( 82. 4%)、
S3( 78. 6%)、S519( 76. 9%) 等; 个别引物检测的多态
性位点百分率较低,如 S445( 20%)和 S441 ( 43. 8%) ,
它们适合于揭示物种的同源性。各引物对亲本加拿
大披碱草、肥披碱草及其杂种 F1 代基因组 DNA 扩
增的 RAPD带谱存在明显差异,同一引物对两亲本
和杂种 F1 扩增的 RAPD条带也存在一定的差异
(图 2)。
2. 3 种间遗传相似系数和遗传距离
根据 Nei的计算方法, 各材料间的遗传相似度
( S)和遗传距离( D)统计结果见表 3。亲本加拿大披
碱草和肥披碱草的遗传相似度较小,为 0. 2878;杂种
F1 与母本加拿大披碱草的遗传相似度为 0. 3357,而
与父本肥披碱草的遗传相似度为 0. 7671,说明杂种
F1 在遗传上更偏向其父本, 从 DNA 分子水平证实
了杂种 F 1 的真实性。亲本加拿大披碱草和肥披
碱草之间的遗传距离为0. 7122, 杂种F1与加拿大披
表 3 双亲及 F1 代遗传相似度和遗传距离
Table 3 Genet ic similarit y and genetic distance among
parents and hybr id F 1
材料
M aterials
加拿大披碱草
E. canadensis
肥披碱草
E. ex celsus
杂种 F1
Hybrid F1
加拿大披碱草 E. canadensis - 0. 2878 0. 3357
肥披碱草 E. ex celsus. 0. 7122 - 0. 7671
种间杂种 F1 Hybrid F1 0. 6643 0. 2329 -
注: 对角线以上数字表示种间的相似度,对角线以下数字表示种间的遗传
距离
Not e: data above the diag onal line are genetic similar it y and dat a below
diagona l line a re genetic dist ance
碱草的遗传距离为 0. 6643,而与肥披碱草的遗传距
离为 0. 2329,说明加拿大披碱草与肥披碱草遗传差
异较大,杂种 F 1 偏肥披碱草遗传。
3 讨论与结论
3. 1 RAPD技术继承了 PCR效率高、灵敏度高、检
测容易等优点,但由于 RAPD所用的随机引物是十
聚体寡核苷酸,扩增反应还会受到模板 DNA 用量、
dNTP、PCR缓冲液、Taq 酶等诸多因素的影响, 试
验结果重演性较差[ 13~ 16] 。我们通过严格控制试验
条件和对模板 DNA 用量、引物浓度等进行反复筛
选,得到了清晰、稳定、重复性好的 RAPD扩增条
带。利用筛选出的 16个适宜引物对加拿大披碱草、
肥披碱草及其杂种 F 1 的 DNA 进行 RAPD扩增结
果表明: 各材料扩增的 RAPD带数范围为 68~ 76
条,各引物带数变化幅度为 1~ 7 条, 平均每引物的
带数范围为 4. 3~ 4. 8 条, 扩增片段长度在 100~
2000 bp之间;不同引物检测的位点数变动于 9~ 17
之间,多态性位点变动于3~ 16之间; 3种材料共检测
到 215个位点,多态性位点比率为 72. I%,这些多态
性位点是亲本间及其与杂种间识别的重要分子依据。
3. 2 远缘杂交可使不同物种间的基因进行重新组
合,是增加生物多样性的重要方法,杂交子代有可能
产生优良的经济性状, 也可能出现致死、不育、杂交
劣势等情况[ 1~ 3] 。于卓等通过对加拿大披碱草与肥
披碱草杂种 F1 的生育及细胞学研究发现,杂种 F1
代植株生长势很强, 生长速度和平均株高明显超过
其双亲,花粉可育率和结实率为 0, 杂种优势强[ 4]。
遗传距离可以揭示双亲间及与杂种间的亲缘关系,
遗传距离大,说明亲本间及与杂种间的遗传差异也
大;遗传相似系数从一个角度反映亲本间及与杂种
间的遗传关系,遗传相似系数大,说明亲本间与杂种
间的遗传差异小[ 12]。本试验利用 RAPD技术测得
亲本加拿大披碱草和肥披碱草之间的遗传距离为
0. 7122,相似性系数为 0. 2878,杂种 F1 与加拿大披
碱草的遗传距离为 0. 6643, 相似性系数为 0. 3357,
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第 1期 李小雷等:加拿大披碱草、肥披碱草及其杂种 F1 的 RAPD分析
而与肥披碱草的遗传距离为 0. 2329, 相似性系数为
0. 7671。可见杂种 F 1 代与两亲本间的遗传差异是
不同的,造成这种偏离的原因可能是肥披碱草为六
倍体,加拿大披碱草为四倍体,杂交时肥披碱草提供
的 DNA 遗传物质较多; 亲本加拿大披碱草与肥披
碱草的遗传距离较大, 二者杂交可产生较大的杂种
优势。
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