全 文 ：第21卷 第4期
Vol.21 No.4
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2013年 7月
July 2013
doi:10.11733/j.issn.1007-0435.2013.04.020
基于SSR标记的苜蓿种质资源遗传
多样性与群体结构分析
陈 斐,魏臻武*,李伟民,潘 玲,郑 曦,刘 倩,张 栋,屠德鹏
(扬州大学动物科学与技术学院 扬州大学草业科学研究所,江苏 扬州 225009)
摘要:种质资源遗传多样性和群体结构的分析是进行复杂性状关联分析的前提条件。从140对SSR引物中筛选到
16对多态性引物,对82份苜蓿(Medicagospp.)材料进行遗传多样性与群体结构分析。结果表明:16对SSR引物
共检测出190个等位变异,平均11.88个;多态性比率66.67%~100%,平均为83.05%;基因多样性为0.1447~
0.3637,平均为0.2577;PIC为0.0079~0.9432,平均为0.5501。群体结构分析表明,当K=5时ΔK 最大,即82
份苜蓿材料可划分为5个类群,其中75.61%的种质遗传组分相对比较单一,24.39%的种质遗传背景比较复杂。
苜蓿种质资源遗传多样性丰富,群体结构的划分与种质的来源不完全相关。
关键词:苜蓿;种质资源;SSR标记;遗传多样性;群体结构
中图分类号:S603.6 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2013)04-0759-10
AnalysisofGeneticDiversityandPopulationStructurein
MedicagoGermplasmbySSRMarkers
CHENFei,WEIZhen-wu*,LIWei-min,PANLing,ZHENGXi,
LIUQian,ZHANGDong,TUDe-peng
(ColegeofAnimalScience&Technique,InstituteofForageandGrasslandScience,
YangzhouUnicersity,Yangzhou,JiangsuProvince225009,China)
Abstract:Understandingthegeneticdiversityandpopulationstructureisaprerequisitefortheassociationmapping
ofcomplextraitsinatargetpopulation.Geneticdiversityandpopulationstructureof82alfalfamaterialswereeval-
uatedusing16polymorphicSSRmarkersscreenedfromatotalof140SSRprimerpairs.Resultsshowedthatato-
talof190aleleswereamplifiedusing16SSRprimerpairs,withanaverageof11.88alelesperprimerpair,the
polymorphicrateaveraged83.05%,rangingfrom66.67%~100%.Thegeneticdiversityaveraged0.2577,ran-
gingfrom0.1477~0.3637,andthePICaveraged0.5501,rangingfrom0.0079~0.9432.Resultsindicatedthat
△KhadamaximumvaluewhenK=5,namely,these82alfalfamaterialscouldbedividedinto5groups.75.61%
Medicagogermplasmwerewithsinglegeneticcomponents,therest24.39%werewithmixedgeneticcomponents.
ThegeneticdiversitiesofMedicagogermplasmwereabundantandthedivisionofpopulationstructurewasnot
completelyrelatedtogermplasmsource.
Keywords:Alfalfa(Medicagospp.);Germplasmresources;SSRmarkers;Geneticdiversity;Population
structure
种质资源积累了自然和人工引起的遗传变异,蕴
藏着极其丰富的基因类型。这些丰富的基因类型不
仅是新品种选育的依据,也是作物遗传、分类等基础
生物学研究的重要材料。对于种质资源遗传多样性
和群体结构的研究可以揭示和评估种质的遗传特性,
提高种质资源利用的效率。近年来,苜蓿(Medicago
spp.)种质资源的研究主要集中于遗传多样性上,关
于苜蓿群体结构的研究鲜有报道。魏臻武等[1]、李
拥军等[2]、杨占花等[3]和周良彬等[4]分别利用SSR,
ISSR,RAPD和SRAP分子标记技术对不同来源的
收稿日期:2013-01-16;修回日期:2013-03-12
基金项目:国家自然科学基金项目(30972136);江苏省科技支撑计划 (BE2012340);江苏省六大人才高峰资助项目资助
作者简介:陈斐(1988-),女,甘肃兰州人,硕士研究生,研究方向为牧草遗传育种,E-mail:chenfei_198807@yahoo.com.cn;*通信作者
Authorforcorrespondence,E-mail:zhenwu_wei@yahoo.com.cn
草 地 学 报 第21卷
苜蓿种质资源进行了划分。这些研究充分揭示了苜
蓿种质资源丰富的遗传多样性。
关联分析是将表型性状和基因多样性结合起来
进行研究,从而得到与表型变异紧密相关的等位变
异的分析方法,但复杂的群体结构可能导致表型与
基因型间的假阳性关联。因此,关联分析之前,首先
需要对试验材料的群体结构进行分析。目前,对于
群体 结 构 的 报 道 主 要 集 中 在 玉 米 (Zeamays
L.)[5-7]、大豆(GlycinemaxL.)[8-10]、小扁豆(Lens
culinaris Medik)[11]、大刍草 (Zeadiploperennis
L.)[12]和燕麦(AvenasativaL.)[13]等作物上,对苜
蓿种质群体结构的分析尚未开展。本研究利用
SSR引物分析了82份苜蓿材料的遗传多样性和群
体结构,这对揭示苜蓿的遗传特性,提高苜蓿资源利
用效率、亲本的合理选配有着重要意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为不同品种(系)的苜蓿材料共82份
(表1),田间试验采用随机区组设计,3次重复。
2011年9月20日播种,行距0.3m,小区面积4.5
m2(3m×1.5m),播量为15kg·hm-2。田间管理
措施包括中耕、锄草、病虫害防治、适时灌溉,每次刈
割后施适量复合肥。
表1 供试苜蓿品种(系)名称及来源
Table1 Sourcesandvarieties(lines)ofalfalfainexperiment
编号 品种(品系)名称 品种类别 来源
Code Varietyorline Varietytype Source
1 敖汉 ACAah 地方品种Localvarieties GRI,China
2 ACA85L 待选品系Line YZU,China
3 WL343HQ 引进品种Introducevarieties RYTWAY,China
4 8920MF 育成品种Syntheticvarieties SARDI,Australia
5 游客Eureka 引进品种Introducevarieties SARDI,Australia
6 德福 Defi 引进品种Introducevarieties SARDI,Australia
7 标杆Biaogan 育成品种Syntheticvarieties RYTWAY,China
8 安斯塔 Anstar 引进品种Introducevarieties GRI,China
9 ACA80190 待选品系Line YZU,China
10 金皇后 GoldenEmpress 引进品种Introducevarieties CLOVER,China
11 赛迪5Sardi5 育成品种Syntheticvarieties SARDI,Australia
12 维多利亚 Victoria 引进品种Introducevarieties CLOVER,China
13 四季旺Siriver 引进品种Introducevarieties BARENBRUG,China
14 阿尔冈金 Algonquin 引进品种Introducevarieties GRI,China
15 WL323ML 引进品种Introducevarieties GRI,China
16 ACA114 待选品系Line YZU,China
17 阿尔泰 Altai 引进品种Introducevarieties GAU,China
18 顶点 Apex 引进品种Introducevarieties BARENBRUG,China
19 牧歌401+ZAmeriGraze401+Z 引进品种Introducevarieties CLOVER,China
20 多仑 Duolun 待选品系Line YZU,China
21 皋兰苜蓿 Gaolanalfalfa 待选品系Line GAU,China
22 PL55 育成品种Syntheticvarieties SARDI,Australia
23 同德苜蓿 Tongdealfalfa 地方品种Localvarieties GRI,China
24 甘农3号 GannongNo.3 育成品种Syntheticvarieties GAU,China
25 伊盟苜蓿 YiMengalfalfa 地方品种Localvarieties GRI,China
26 青海湖 Qinghaihu 待选品系Line YZU,China
27 新疆大叶 Xinjiangdaye 地方品种Localvarieties GAU,China
28 WL232HQ 引进品种Introducevarieties RYTWAY,China
29 中苜1号ZhongmuNo.1 育成品种Syntheticvarieties IAS,CAAS,China
30 L173 育成品种Syntheticvarieties SARDI,Australia
31 甘农1号 GannongNo.1 育成品种Syntheticvarieties GAU,China
32 FD10 待选品系Line BJFU,China
33 FD11 待选品系Line BJFU,China
067
第4期 陈 斐等:基于SSR标记的苜蓿种质资源遗传多样性与群体结构分析
续表1
编号 品种(品系)名称 品种类别 来源
Code Varietyorline Varietytype Source
34 FD8 待选品系Line BJFU,China
35 FD1 待选品系Line BJFU,China
36 丰宝PowerPlant 引进品种Introducevarieties BARENBRUG,China
37 康赛Concept 引进品种Introducevarieties BARENBRUG,China
38 Creno 引进品种Introducevarieties BARENBRUG,China
39 1045 待选品系Line YZU,China
40 名流 Daisy 引进品种Introducevarieties BARENBRUG,China
41 1085 待选品系Line YZU,China
42 大富豪 Milionaire 引进品种Introducevarieties BARENBRUG,China
43 多叶王 Multiking 引进品种Introducevarieties BARENBRUG,China
44 CUF101 引进品种Introducevarieties YZU,China
45 苏联1414SovietUnion1414 引进品种Introducevarieties BARENBRUG,China
46 赛迪10Sardi10 育成品种Syntheticvarieties SARDI,Australia
47 1055 待选品系Line YZU,China
48 惊喜 Adrenalin 引进品种Introducevarieties RYTWAY,China
49 WL612 引进品种Introducevarieties RYTWAY,China
50 猎人河 Hunterriver 引进品种Introducevarieties RYTWAY,China
51 爱菲尼特 Affinity 引进品种Introducevarieties BARENBRUG,China
52 WL320 育成品种Syntheticvarieties GRI,China
53 爱米 ALEZE 待选品系Line YZU,China
54 德宝 Derby 引进品种Introducevarieties SARDI,Australia
55 赛迪7Sardi7 育成品种Syntheticvarieties SARDI,Australia
56 WL525HQ 引进品种Introducevarieties RYTWAY,China
57 ACA89L 待选品系Line YZU,China
58 飞马 Grandeur 引进品种Introducevarieties CLOVER,China
59 苜蓿王 Alfaking 引进品种Introducevarieties BARENBRUG,China
60 三得利Sandili 引进品种Introducevarieties SARDI,Australia
61 高种繁 Gaozhongfan 待选品系Line Gansu,China
62 北疆苜蓿Beijiangalfalfa 地方品种Localvarieties GRI,China
63 保定苜蓿Baodingalfalfa 地方品种Localvarieties BARENBRUG,China
64 无棣苜蓿 Wudialfalfa 地方品种Localvarieties BARENBRUG,China
65 草原2号CaoyuanNo.2 育成品种Syntheticvarieties GRI,China
66 陕北苜蓿Shaanbeialfalfa 地方品种Localvarieties GRI,China
67 130 待选品系Line YZU,China
68 公农1号 GongnongNo.3 育成品种Syntheticvarieties GRI,China
69 蔚县苜蓿 YuXianalfalfa 地方品种Localvarieties GRI,China
70 L125 育成品种Syntheticvarieties SARDI,Australia
71 L90 育成品种Syntheticvarieties SARDI,Australia
72 WL903 引进品种Introducevarieties RYTWAY,China
73 FD4 待选品系Line BJFU,China
74 FD7 待选品系Line BJFU,China
75 FD5 待选品系Line BJFU,China
76 FD6 待选品系Line BJFU,China
77 FD2 待选品系Line BJFU,China
78 1075 待选品系Line YZU,China
79 1044 待选品系Line YZU,China
80 马克辛 Maxim 引进品种Introducevarieties BARENBRUG,China
81 威拉 Vela 引进品种Introducevarieties BARENBRUG,China
82 淮阴苜蓿 Huaiyinalfalfa 地方品种Localvarieties YZU,China
注:BARENBRUG:百绿;BJFU:北京林业大学;CLOVER:克劳沃;GAU:甘肃农业大学;GRI:中国农业科学院草原研究所;IAS,CAAS:
中国农业科学院畜牧研究所;RYTWAY:正道;SARDI:澳大利亚南澳研究与发展研究所;YZU:扬州大学
Note:BJFU:BeijingForestryUniversity;GAU:GansuAgricultureUniversity;GRI:GrasslandsResearchInstitute;IAS,CAAS:Insti-
tuteofAnimalSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences;SARDI:SouthAustraliaResearchandDevelopmentInstitute;YZU:Yan-
gzhouUniversity
167
草 地 学 报 第21卷
1.2 DNA的提取与检测
以苜蓿鲜叶片提取DNA,每份试验材料取40
株混合[14],加液氮研磨,迅速转预冷的1.5mL离心
管中,放入-20℃冰箱保存。基因组DNA的提取
采用魏臻武[15]改进的CTAB法提取。用紫外分光
光度计检测DNA纯度与浓度,通过测量OD260值确
定DNA浓度,用OD260/OD280值(在1.8~2.0范围
内为合适)确定DNA纯度的高低。样品稀释后放
入4℃冰箱备用,原液放入-20℃冰箱长期保存。
1.3 SSR引物来源与PCR扩增体系
试验对140对来自蒺藜苜蓿(Medicagotrun-
catula)的引物进行筛选,SSR引物序列来自文献
[16],由上海生物工程有限公司合成。PCR反应体
系和电泳程序参考屠德鹏等[17]的方法。
1.4 数据分析
采用Quantityone统计软件对扩增谱带进行统
计,将清晰可见的条带和反复出现的弱条带记为1,
无带记为0,建立0,1统计表,用Excel2003进行整
理。每个SSR位点的多态性信息量(polymorphism
informationcontent,PIC)按公式PIC=1-∑pi2
计算[18],其中pi为第i种等位位点占总等位位点的
比率。用软件POPGENE计算基因多样性和Shan-
non指数[19]。
利用软件Structure2.2[20-21]对参试材料进行
基于数学模型的类群划分,计算相应的Q值(第i份
材料SSR位点变异源于第K 群体的概率)。先设
定群体数目(K)为2~10,将 MCMC(MarkovChain
MonteCarlo)的不作数迭代(lengthofburn-inperi-
od)设为10000次,再将不作数迭代后的 MCMC设
为100000次,每个K 值运行2次,以拟然值最大为
原则选取一个合适的K 值,计算各材料的Q值,分
析群体结构。利用 NTSYS-pc2.20软件[22]中的
Dcenter与Eigen模块对试验材料进行主成分分析
(PCA)。
2 结果与分析
2.1 SSR引物的筛选与遗传多样性分析
选取分布在蒺藜苜蓿8条染色体上的140对
SSR引物,取6份苜蓿材料(敖汉、WL323ML、甘农
3号、三得利、FD6、淮阴苜蓿)进行多态性分析。最
后选取多态性高、条带清晰、重复性好的16对引物
进行试验(表2)。
表2 SSR引物相关信息
Table2 SSRprimerinformation
引物 正向引物序列 反向引物序列 连锁群
Primer Forwardprimer Reverseprimer Linkagegroup
MTB8 CCATCCTTTTACGATGACCG GGCTTACCACCACCACATTC 6
MTB34 GACGTCGGAGACATGGAGTT TCTAAGCCTCACCCCAAAGA 7
MTB41 TGGTGATAGTTTTAAGCCTTTGG TCCAGACATGTCCCTGATGA 5
MTB46 TTGATGATGGGCTGCACTAA CACCGTTGGATTTTTCTGCT 1
MTB58 CCTCCAAAGAATATGGATGC AGGGCTGTCTGCTGGAGTTA 8
MTB60 AAGAATGACGAAGAGGCGAA TCAGAAATTCCCTCCCATTG 5
MTB65 AGCGGCACCGTGTTGTT AAGACGGAAGAAGAACGATGTG 1
MTB73 TGGAAGAGACCGGAGAAGAA TCGAGAGCTCGGTATTCGAT 4
MTB74 CATATGGTTCTCCGTCGCTT AGGAGTGGCAGTTGAACCAC 8
MTB153 GGTCCATCCCAATCATTGAA GGTTGGGTAGTGCAATTGTG 5
MTB192 CCCGTCCAAAACAAAATCAG TTTTCACCAAAGGGTTTTGC 4
MTB230 GCACTGAGTTTATGGGTCTC AGTTTGTTGGGAATCAAGTG 5
MTB244 TCTGGAGTAGAGTTGGAAGC CCCAACAGATGAAACAACA 5
MTB249 CCATCATCTCACCAACTAGA AGGCTTACTTACACATTCATCA 7
MTB307 TCCAAACAATGACAGAGCCA CTCCTTTGTTCGCGCTTTTA 4
MTB330 ATCAACGTGTTGTCACCTCCT TCCATAAGCATTGTCGCTTG 5
16对SSR引物在82份苜蓿材料中共扩增出190
个等位变异,平均每个位点11.88个。不同引物扩增出
的等位变异有明显差异。等位变异最多的是 MTB41,
有19个,最少的是MTB230和MTB244,各有4个。多
态性比率为66.67%~100%,平均高达83.05%。基因
多样性为0.1447~0.3637,平均为0.2577。16个标记
的PIC值变化范围在0.0079~0.9432之间,超过0.5
的有11条,平均PIC为0.5501,表明所选的SSR引物
在苜蓿种质上多态性丰富。16个标记扩增出的DNA
片段集中在100~500bp之间(图1,图2,表3)。
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第4期 陈 斐等:基于SSR标记的苜蓿种质资源遗传多样性与群体结构分析
图1 引物 MTB41在部分材料中的扩增电泳图谱
Fig.1 AmplificationproductsofprimerMTB41
注:图中各泳道电泳图为表1中编号所对应样品的扩增产物,下同
Note:ThenumberisthesameasthecodeofTable1,thesameasbelow
图2 引物 MTB60在部分材料中的扩增电泳图谱
Fig.2 AmplificationproductsofprimerMTB60
表3 SSR引物扩增结果
Table3 SSRprimeramplifyingresults
引物 等位变异个数 多态性比率 基因多样性 多态性信息量
Primer AleleNo. Polymorphicrate/% Genediversity PIC
MTB8 10 83.33 0.2629 0.7521
MTB34 8 80.00 0.3384 0.6254
MTB41 19 86.36 0.3203 0.0648
MTB46 12 80.00 0.3045 0.5091
MTB58 18 85.71 0.1569 0.6663
MTB60 13 76.47 0.1447 0.0079
MTB65 17 80.95 0.2552 0.0140
MTB73 9 90.00 0.3637 0.7870
MTB74 11 91.67 0.1627 0.9432
MTB153 15 83.33 0.3188 0.0883
MTB192 10 83.33 0.3387 0.6907
MTB230 4 66.67 0.2385 0.8794
MTB244 4 66.67 0.1881 0.8834
MTB249 15 83.33 0.1737 0.2808
MTB307 15 100.00 0.2319 0.8193
MTB330 10 90.91 0.3240 0.7900
平均Average 11.88 83.05 0.2577 0.5501
367
草 地 学 报 第21卷
2.2 不同来源苜蓿种质的群体结构分析
利用Structure软件对82份不同品种(系)苜蓿
材料的群体结构进行了系统分析。设定类群数K
值在2~10之间,以每个K 值为横坐标,以相应lnP
(D)值为纵坐标做曲线图(图3-A),可知,自然对数
lnP(D)值随着亚群数的增加而增加,曲线无明显拐
点,无法确定适宜的亚群数。因此参考 Evanno
等[23]的方法,用ΔK 来确定合适的K 值(图3-B),
可知,ΔK 在K=5时有明显的峰,因此将82份不同
品(系)的苜蓿材料划分为5个类群。分析各苜蓿材
料在不同类群的 Q值,发现其中的62个苜蓿种质
(75.61%)在某一类群中的 Q值大于或等于0.5,
推测其遗传组分相对比较单一,可以被划分到5个
类群中的一个,其他20个(24.39%)在5个类群中
的Q值均小于0.5,没有明确的类群归属特性,形成
了一个混合群体(mixedgroup)(表4)。
图3 K值曲线图
Fig.3 CurvediagramofKvalue
图4 82份苜蓿材料依据混合模型的群体遗传结构
Fig.4 Geneticstructureof82alfalfabasedonmixedmode
表4 82份材料的群体结构
Table4 Populationstructureof82materials
编号Code 材料名称Accessions Q1 Q2 Q3 Q4 Q5 类群Group
1 敖汉 Aohan 0.061 0.335 0.315 0.199 0.090
2 ACA85L 0.007 0.675 0.033 0.207 0.077 2
3 WL343HQ 0.010 0.929 0.010 0.018 0.033 2
4 8920MF 0.193 0.659 0.085 0.052 0.010 2
5 游客Eureka 0.052 0.431 0.040 0.027 0.450
6 德福 Defi 0.026 0.102 0.113 0.337 0.423
7 标杆Biaogan 0.182 0.070 0.021 0.662 0.065 4
8 安斯塔 Anstar 0.096 0.460 0.040 0.397 0.007
9 ACA80190 0.696 0.012 0.006 0.278 0.008 1
10 金皇后 GoldenEmpress 0.039 0.497 0.117 0.323 0.023
11 赛迪5Sardi5 0.649 0.265 0.023 0.008 0.054 1
12 维多利亚 Victoria 0.643 0.005 0.008 0.337 0.008 1
13 四季旺Siriver 0.384 0.010 0.018 0.544 0.043 4
14 阿尔冈金 Algonquin 0.916 0.011 0.006 0.018 0.049 1
15 WL323ML 0.933 0.006 0.051 0.004 0.005 1
16 ACA114 0.838 0.011 0.061 0.010 0.080 1
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第4期 陈 斐等:基于SSR标记的苜蓿种质资源遗传多样性与群体结构分析
续表4
编号Code 材料名称Accessions Q1 Q2 Q3 Q4 Q5 类群Group
17 阿尔泰 Altai 0.960 0.005 0.024 0.003 0.007 1
18 顶点 Apex 0.974 0.006 0.011 0.004 0.005 1
19 牧歌401+ZAmeriGraze401+Z 0.943 0.010 0.031 0.009 0.007 1
20 多仑 0.957 0.009 0.009 0.007 0.018 1
21 皋兰苜蓿 Gaolanalfalfa 0.470 0.063 0.005 0.427 0.036
22 PL55 0.002 0.002 0.003 0.987 0.006 4
23 同德苜蓿 Tongdealfalfa 0.280 0.216 0.412 0.023 0.068
24 甘农3号 GannongNo.3 0.046 0.633 0.301 0.012 0.008 2
25 伊盟苜蓿 YiMengalfalfa 0.430 0.024 0.518 0.014 0.014 3
26 青海湖 Qinghaihu 0.006 0.128 0.644 0.057 0.164 3
27 新疆大叶 Xinjiangdaye 0.023 0.814 0.006 0.005 0.153 2
28 WL232HQ 0.565 0.331 0.050 0.008 0.046 1
29 中苜1号ZhongmuNo.1 0.006 0.967 0.009 0.009 0.009 2
30 L173 0.786 0.188 0.010 0.003 0.013 1
31 甘农1号 GannongNo.3 0.017 0.453 0.252 0.018 0.260
32 FD10 0.003 0.007 0.005 0.855 0.130 4
33 FD11 0.004 0.028 0.005 0.944 0.018 4
34 FD8 0.003 0.007 0.005 0.968 0.018 4
35 FD1 0.025 0.090 0.004 0.847 0.034 4
36 丰宝PowerPlant 0.404 0.065 0.006 0.254 0.270
37 康赛Concept 0.322 0.566 0.028 0.062 0.022 2
38 Creno 0.011 0.111 0.400 0.117 0.361
39 1045 0.406 0.098 0.022 0.007 0.466
40 名流 Daisy 0.009 0.019 0.040 0.827 0.106 4
41 1085 0.006 0.011 0.005 0.966 0.012 4
42 大富豪 Milionaire 0.013 0.020 0.013 0.090 0.865 5
43 多叶王 Multiping 0.169 0.184 0.008 0.113 0.525 5
44 CUF101 0.141 0.005 0.006 0.402 0.446
45 苏联1414SovietUnion1414 0.078 0.003 0.004 0.060 0.854 5
46 赛迪10Sardi10 0.047 0.013 0.046 0.110 0.784 5
47 1055 0.004 0.029 0.008 0.017 0.942 5
48 惊喜Jingxi 0.058 0.006 0.007 0.411 0.518 5
49 WL612 0.004 0.389 0.004 0.593 0.010 4
50 猎人河 Hunterriver 0.034 0.350 0.138 0.359 0.119
51 爱菲尼特 Affinity 0.003 0.063 0.009 0.921 0.004 4
52 WL320 0.005 0.124 0.045 0.820 0.006 4
53 爱米 ALEZE 0.247 0.083 0.203 0.438 0.029
54 德宝 Derby 0.006 0.026 0.792 0.034 0.142 3
55 赛迪7Sardi7 0.059 0.006 0.498 0.358 0.079
56 WL525HQ 0.014 0.010 0.808 0.101 0.067 3
57 ACA89L 0.007 0.015 0.962 0.009 0.007 3
58 飞马 Grandeur 0.014 0.014 0.830 0.114 0.027 3
59 苜蓿王 Alfaking 0.049 0.005 0.932 0.008 0.006 3
60 三得利Sandili 0.019 0.021 0.819 0.076 0.064 3
61 高种繁 Gaozhongfan 0.100 0.132 0.175 0.573 0.020 4
62 北疆苜蓿Beijiangalfalfa 0.006 0.006 0.315 0.659 0.014 4
63 保定苜蓿Baodingalfalfa 0.002 0.004 0.004 0.984 0.005 4
64 无棣苜蓿 Wudialfalfa 0.004 0.034 0.045 0.908 0.009 4
65 草原2号CaoyuanNo.2 0.004 0.008 0.011 0.958 0.019 4
66 陕北苜蓿Shaanbeialfalfa 0.021 0.055 0.125 0.764 0.034 4
67 130 0.009 0.055 0.238 0.588 0.110 4
68 公农1号 GongnongNo.3 0.065 0.104 0.035 0.660 0.136 4
69 蔚县苜蓿 YuXianalfalfa 0.004 0.007 0.023 0.192 0.774 5
70 L125 0.005 0.008 0.006 0.500 0.481 4
71 L90 0.005 0.343 0.020 0.495 0.137
72 WL903 0.004 0.010 0.013 0.290 0.683 5
73 FD4 0.008 0.410 0.009 0.465 0.108
74 FD7 0.003 0.008 0.011 0.971 0.007 4
75 FD5 0.102 0.240 0.276 0.013 0.368
76 FD6 0.015 0.237 0.007 0.017 0.725 5
77 FD2 0.468 0.009 0.009 0.480 0.033
78 1075 0.005 0.005 0.004 0.437 0.549 5
79 1044 0.629 0.038 0.269 0.032 0.033 1
80 马克辛 Maxim 0.121 0.103 0.051 0.663 0.063 4
81 威拉 Vela 0.007 0.005 0.006 0.965 0.016 4
82 淮阴苜蓿 Huaiyinalfalfa 0.007 0.498 0.031 0.092 0.372
567
草 地 学 报 第21卷
对62份划入指定群体的苜蓿材料进行分析发
现,在5个类群中,类群1共包含13份材料,典型代
表是顶点和阿尔泰,占材料总数的15.85%。分入
类群2的材料最少,共7份,占群体的8.54%,典型
代表是中苜1号和 WL343HQ。分入第3个群体的
材料 有 8 份,占 总 体 的 9.76%,典 型 代 表 有
ACA89L和苜蓿王。分入第4个群体的材料最多,
为24个,占总材料的29.27%,代表材料有PL55和
保定。分入第5个群体的材料为10个,占82份材
料的12.2%,代表材料有1055和大富豪(表4)。
图5 群体结构分析中各类群所占比例
Fig.5 Proportionofeachsubgroupfrom
populationstructureanalysis
2.3 类群的遗传多样性及主成分分析
5个类群中,基因多样性和Shannon指数的变
化一致,基因多样性大的群体,Shannon指数也大。
从基因多样性来看,群体1>群体2>群体3>群体
5>群体4。群体1、群体2、群体3之间无显著差
异,群体4和5之间无显著差异,群体1、群体2、群
体3与群体4和5之间差异显著(P<0.05)。从I
指数来看,群体1>群体2>群体3>群体4>群体
5。群体1、群体2、群体3之间无显著差异,群体3
和4之间无显著差异,群体4和5之间无显著差异,
群体1、群体2、群体3与群体5有显著差异(P<
0.05),群体1和2分别与群体4和5有显著差异(P
<0.05)(表5)。
将82份苜蓿材料作为一个混合群体进行二元
PCA 分析,结果显示前两维的贡献率分别为
15.42%和10.14%,依据位置近表示亲缘关系近,
位置远就表示亲缘关系远的原则,将82份材料分为
4个部分(a,b,c,d)。PCA分析的结果与群体结构
分析划分的5个群体基本相对应:a部分与群体1
相对应,b部分与群体2相对应,c部分即群体4和
群体5的总和,d部分与群体3对应。4个部分间有
少量相互渗透现象(图6)。由表5可知,群体4与
群体5之间的遗传多样性无显著差异,PCA分析的
结果也显示2个类群之间亲缘关系较近,都划分到
了c部分。类群间差异显著的,在PCA分析图上相
距较远。群体结构分析中划分到混合群体的材料在
PCA分析中基本也被划分到与Q值最大的类群所
对应的区域,或与该区域较近的位置。例如:淮阴苜
蓿在二元PCA分析中分到了b部分,它在群体2中
的Q值也最大,群体2与b部分对应。因此,二元
PCA分析的结果与群体结构分析的结果是基本吻
合的。
表5 类群的遗传多样性
Table5 Summarystatisticsofgeneticdiversity
formodel-basedgroups
类群 样本大小 基因多样性 I指数
Group Samplesize Genediversity ShannonindexI
Group1 13 0.2462A 0.3733A
Group2 7 0.2410A 0.3592A
Group3 8 0.2208A 0.3322AB
Group4 24 0.1759B 0.2849BC
Group5 10 0.1779B 0.2760C
注:不同大写字母表示在0.05水平上差异显著
Note:Differentlettersmeansignificantdifferencesatthe0.05
level
3 讨论
3.1 SSR引物的筛选
本研究筛选的16对SSR引物,平均每个引物
有11.88个等位变异,PIC均值为0.5501,具有很
高的多态性。武自念等[24]筛选的多态性SSR引物
平均有8.25个等位变异,平均PIC为0.2185,李飞
飞等[25]筛选的SSR引物平均有4.3个等位变异,平
均PIC为0.54。本文筛选的SSR引物之所以能得
到更多的等位变异及更高的PIC,很大程度上可能
与参试种质的丰富程度和广泛的来源有关。本研究
证明这16对标记能够有效揭示不同苜蓿材料间的
遗传差异。孙友位等[26]利用SSR分子标记研究了
玉米375个自交系间的遗传变异,认为SSR能够真
实地揭示自交系之间的遗传多样性。本研究表明,
SSR能够很好地反映品种间的亲缘关系,利用分子
标记对群体结构进行划分是有效的。
667
第4期 陈 斐等:基于SSR标记的苜蓿种质资源遗传多样性与群体结构分析
图6 82份苜蓿材料二元主成分分析
Fig.6 Two-dimensionprincipalcomponentanalysesof82alfalfamaterials
3.2 苜蓿种质资源的群体结构分析
群体结构就是一个群体内存在的亚群情况。由
群体地域生态分化和自然选择压力产生的各种群体
结构,包括群体大小与遗传结构,对研究进化与指导
选择具有重要的意义。本研究将材料预先设定了几
个类群,根据不同位点的等位基因频率及各材料在
不同类群中的遗传相似性比例进行划分。Wang
等[27]在玉米的研究中将Q>0.8的自交系认为结构
相对单一,在小麦(Triticumaestivum L.)的研究中
刘丽华等[28]将Q>0.6视为结构相对单一。本文根
据研究材料遗传复杂程度的不同,将遗传相似性比
例≥0.5的材料划分到某个单一的类群中,发现
75.61%的苜蓿材料结构相对单一,说明不同地区的
苜蓿材料间存在着一定的基因交流。
关联分析以连锁不平衡(linkagedisequilibri-
um,LD)为基础,依据LD大小来判断性状与标记
间的关联程度,鉴定某一群体内目标性状与遗传标
记或候选基因关系的分析方法[29],是发现并且定位
基因,并对基因进行功能性分析的工具[30]。关联分
析最早应用于人类复杂的遗传疾病研究,近几年才
开始应用于植物数量性状的研究中。关联分析在植
物中运用的首要限制因素就是不同的群体结构,许
多作物经历了漫长时期的进化与育种选择过程,亲
缘关系较近的野生种群也存在着基因漂流,在进行
关联分析时,必需考虑和解决群体结构的问题[31]。
当研究所用材料的群体结构简单时,关联分析的功
效就会达到最大,结果出现假阳性的可能性也最低。
82份苜蓿材料不论是国内育成品种、国外引进
材料还是待选品系,在5个类群中都有分布,群体结
构趋于多样化,与地理分布不完全相关。造成这种
现象的原因可能与SSR标记的数量、类型及分析的
材料数量有关。选取覆盖整个染色体的标记,并且
增加参试材料的份数,更有助于类群之间的相互比
较。本研究筛选的16对 SSR标记经过反复的筛
选,稳定性好、可靠性高,可以很好地分析苜蓿的种
质资源。
3.3 不同类群的遗传多样性
在5个类群中,群体1和群体2的遗传多样性
较高,群体4和群体5的遗传多样性较低,群体3的
遗传多样性位于两者之间,群体的划分与种质的来
源并没有严格的对应关系。结合大田生长状况发现
群体1的分枝数多、产量高、叶片相对较大。群体2
相对株高矮,产量相对低。群体3的主枝侧枝数最
多。群体4的株高较高,但是分枝数少,产量相对较
低。群体5的分枝数相对较少,叶片相对小。
苜蓿种质资源的PCA 分析和STRUCTURE
遗传结构分析的结果基本一致。近年来,2种分析
方法的结合已应用到许多种质的亲缘关系研究当
中[32-33]。群体结构分析能提供丰富的信息,使结果
更直观;PCA分析能从不同的方向和层次揭示试验
材料的差异。本试验82份苜蓿材料的PCA分析结
果表明苜蓿种质资源分布宽广,其遗传多样性丰富,
2种分析方法的结合,有助于结果的相互验证,使结
果更为准确,也更易彻底分析不同材料间的遗传关
系。因此可在今后的研究中将2种方法结合使用。
767
草 地 学 报 第21卷
4 结论
本研究筛选了16对多态性丰富的SSR引物,
共获得了190个多态性位点。这些SSR引物能够
很好地检测不同苜蓿材料的遗传多样性。根据
Structure群体结构分析,参试苜蓿种质材料由5个
类群组成。按照遗传相似性比例 Q=0.5为标准,
20份材料Q<0.5,遗传结构复杂,分到了混合群体
中,占总数的24.39%。占总数75.61%的62份材
料Q>0.5,遗传组分单一,被划入特定类群。在5
个类群中,遗传多样性水平最高的是类群1,其次是
类群2、类群3,类群4和5的遗传多样性较低,群体
的划分与种质来源不完全相关。苜蓿种质资源的遗
传多样性丰富,表现出了遗传基础的异质性,可以为
关联分析和挖掘优良基因提供基础。
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(责任编辑 李美娟)
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