全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2007) 01-0050-05
苜蓿绿汁发酵液发酵条件研究
张 涛1, 2, 李 蕾2, 崔宗均1, 李建平3, 胡跃高1*
( 1.中国农业大学农学与生物技术学院, 北京 100094;
2.大连水产学院 ,大连 116023; 3.郑州牧业工程高等专科学校 ,郑州 450011)
摘要: 苜蓿(Medicago sativa)绿汁发酵液作为青贮添加剂,可以提高青贮的质量。在苜蓿绿汁发酵液中添加不同比例的葡
萄糖( 0%、1%、2%和5% )和氯化钠( 0%、0. 5%和 1% ) , 做 3×4 正交试验, 研究其对绿汁发酵液发酵品质和乳酸菌数量
的影响。结果表明:绿汁发酵液中氯化钠和葡萄糖水平及其交互作用对 pH 值、可溶性碳水化合物、氨态氮和乙酸含量的影
响极显著( P< 0. 01) ;添加0. 5%氯化钠,氨态氮含量和pH 值极显著低于0%和1% ;可溶性碳水化合物含量极显著高于氯
化钠0%和 1%添加水平( P< 0. 01) ; 苜蓿绿汁发酵液中以同时添加 0. 5%氯化钠和 2%葡萄糖的发酵品质最好。
关键词: 绿汁发酵液; 苜蓿; 葡萄糖; 氯化钠
中图分类号: S 816. 7 文献标识码: A
Studies on the Optimal Ferment Conditions for Fermented
Green Juice of Alfalfa
ZHANG T ao
1, 2, L I Lei
2 , CU I Zong-jun
1 , L I Jian-ping
2, HU Yue-gao
1*
( 1. College of Ag ronomy and Biology, C hina Agricultur al Un iversity, Beijin g 100094, Ch ina;
2.C ollege of Aquat ic Pr od ucts Indus try , Dalian, Liaoning Pr ovin ce 116023, China;
3. College for Profes sional Tr ainin g of An imal Hu sbandry Indust ry, Zh engzhou, Henan Pr ovin ce 450011, China)
Abstract: The fermented g reen juice( FGJ) of alfalfa, as a natural silage addit iv e, can improve the fermenta-
tion quality of alfalfa ensilag es. Repor ts on how to enhance the quality of fermented al falfa g reen juice, and
improve the effect o f the addit iv e ar e r ather scarce in our country . A 3×4 or thogonal ex-periment w ith 3 re-
peats was conducted to invest igate the inf luence of dif ferent supplementat ion lev els of g lucose( 0%、1%、2%、
5% ) and NaCl ( 0%、0. 5%、1%) on the fermentat ion quality and the numbers of lact ic acid bacteria in the
FGJ. T he results show that the level of g lucose, NaCl and their interact ion did inf luence the amount of pH,
WSC, NH 3-N and acetic acid in the FGJ signif icant ly ( P< 0. 01) . With 0. 5% NaCl added in FGJ, the content
of NH3-N and pH in the g reen juice w ould decline more signif icant ly than w ith no or 1% NaCl added, w hile
the content of w ater soluble car bohydrate w ould rise signif icant ly higher than w ith no or 1% NaCl added.
The fermentat ion quality of FGJ w as the best w hen supplementat ion level of NaCl w as 0. 5% and g lucose w as
2% .
Key Words : Fermented g reen juice ( FGJ) ; Alfalfa ; Glucose; NaCl
苜蓿(Med icago sativa)因水溶性碳水化合物含
量少、缓冲能较高[ 1]和乳酸菌数量少, 采用常规青贮
技术很难调制优质青贮饲料。Ohshima[ 2]报道添加绿
汁发酵液( previously fermented juice, FGJ)的苜蓿
青贮, 乳酸含量显著增加, 丁酸及氨态氮含量显著减
少,发酵品质明显改善。张涛 [ 3]报道在苜蓿青贮(干物
质含量 50% )中添加绿汁发酵液与对照相比可以显
著提高乳酸和可溶性碳水化合物( WSC)含量, 降低
pH 值( P< 0. 05)。
青贮能否成功, 在很大程度上还取决于乳酸菌
能否迅速而大量地繁殖,研究结果表明,苜蓿等牧草
中乳酸菌的数量少于 102个/ g 鲜样[ 4～7]。为了增加
收稿日期: 2006-05-23; 修回日期: 2006-10-20
基金项目:国家跨越计划项目(编号: 2004BA520A14)
作者简介: 张 涛( 1976-) ,男,山西太原人,博士研究生,研究方向为动物营养与饲料科学; * 通讯作者 Author for corr espon dence, E-m ail :
第 15卷 第 1期
Vo l. 15 No . 1
草 地 学 报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
2007 年 1 月
Jan. 2007
有效能供应, 促进乳酸菌的生长, 常在青贮原料中加
入一些富含碳水化合物的原料, 如禾本科牧草、玉米
粉、淀粉等。同时一些乳酸菌菌系对氯化钠( NaCl)有
一定的耐受性, 当添加一定量 NaCl后,对 NaCl敏感
的有害细菌受到抑制, 而这些乳酸菌依然生存。
Mclaughlin
[ 8] 报道, 在苜蓿青贮的表层添加 NaCl
( 22. 5 kg / 121 m
2
) , 经过 4周的发酵,表层添加 NaCl
的处理与对照相比, pH 值、NDF 含量、玉米烯酮含量
和总的好氧菌数降低, 提高了发酵质量,减少了青贮
损耗。Cai等 [ 9]在高梁小规模青贮时添加 40 g / kg Na-
Cl,结果干物质损失由 14%降到 7%, 并且总的好氧
菌数降低。
苜蓿青贮效果的好坏与作为青贮添加剂的绿汁发
酵液本身乳酸菌数量和营养成分含量有着密切的关
系。但未见到如何提高苜蓿绿汁发酵液的发酵品质, 以
提高其添加应用效果的研究报道。本试验在苜蓿绿汁
发酵液中添加不同比例的葡萄糖和氯化钠, 研究其对
pH 值动态变化, 氨态氮、可溶性碳水化合物、乙酸、丙
酸、丁酸和乳酸含量,以及乳酸杆菌、乳酸球菌数量的
影响。通过试验获得苜蓿绿汁发酵液的适宜葡萄糖和
氯化钠添加水平, 为调制高品质的青贮苜蓿提供一种
有效的天然生物添加剂的制备方法。
1 材料与方法
1. 1 试验设计
试验设 NaCl 0%、0. 5%和 1% 3个添加水平,葡
萄糖 0%、1%、2%和 5% 4个添加水平, 做3×4正交
试验,每组重复 3次。
1. 2 绿汁发酵液的调制
试验于 2003年 5月 17日至 23日在中国农业大
学进行,所用苜蓿为中国农业大学校内实验田种植的
Victor 苜蓿,取样时处于第 1茬初花期。将苜蓿用剪
刀剪碎放入榨汁机,加入与等重量蒸馏水, 粉碎榨汁,
用双层纱布过滤至容器中。按试验设计加入不同比例
的氯化钠和葡萄糖,分装于 20 ml的螺口试管中密封
后, 30℃恒温培养 6天。
1. 3 测定项目与方法
1. 3. 1 pH 值 采用 HORIBA B-212 TW IN 微量
pH 仪,于发酵第0、0. 5、1、1. 5、2、2. 5、3、4、5和6天,
取发酵物 0. 2 ml测定。
1. 3. 2 挥发性有机酸 采用岛津GC-14A 气相色谱
仪测定。取绿汁发酵液用 6000 r / min的高速离心机
离心 10 m in, 取上清液 1 m l, 加入 0. 2 ml 偏磷酸
( 25%)溶液, 两者的体积比为 5∶1, 振荡混合, 通过
Whatman 54滤纸过滤后,取 2 l进样。乙酸、丙酸和
丁酸含量测定条件:色谱柱为 GDX-101玻璃钢填充
柱, 长 2 m 内径3 mm, 载气为氮气, 柱温 180℃,汽化
室200℃,氢焰检测器190℃。乳酸测定样品前处理及
检测条件与其他挥发性有机酸相同。乳酸测定时,柱
温 140℃,汽化室 150℃,氢焰检测器 160℃。取添加
偏磷酸后的绿汁发酵液与等量高碘酸( 100 g/ l )混
合, 进样量 2 l。
1. 3. 3 可溶性碳水化合物采用蒽酮比色法 [ 10]。
1. 3. 4 氨态氮( NH3-N) 采用改良的茚满三酮测定
法[ 11]。
1. 3. 5 微生物 乳酸杆菌培养采用 SL 琼脂培养基,
乳酸球菌培养采用Ell iker 琼脂培养基[ 12]。绿汁发酵
液用灭菌生理盐水稀释 10～109倍, 用平板培养法厌
氧培养, 进行菌落计数,同一稀释度作 3次重复。
1. 4 数据分析
用 SAS 软件对试验结果进行方差分析和 Dun-
can显著性检验。
2 结果与分析
2. 1 氯化钠和葡萄糖添加量对绿汁发酵液 pH值的
影响
由表 1可知,绿汁发酵液中氯化钠和葡萄糖及其
交互作用对 pH 值影响极显著( P< 0. 01)。葡萄糖的
4个添加水平两两之间差异极显著( P< 0. 01)。氯化
钠添加水平 pH 值差异极显著( P< 0. 01) , 其中以 0.
5%水平 pH 值最低, 1%水平最高。氯化钠 0%+ 葡
萄糖 2%、氯化钠 0% + 葡萄糖 5%、氯化钠 0. 5%+
葡萄糖 2%、氯化钠 0. 5%+ 葡萄糖 5% 4 组从第 2
天起 pH 值就低于其余各组, 随时间推移这 4组较其
余各组pH 值下降更为迅速(图 1)。发酵第 6天测定,
这 4组的 pH 值极显著低于其它组( P< 0. 01) ,并且
4组的 pH值都小于或等于 3. 7。
2. 2 氯化钠和葡萄糖添加量对绿汁发酵液可溶性碳
水化合物的影响
氯化钠和葡萄糖水平及其交互作用对可溶性碳
水化合物含量影响极显著( P< 0. 01)。氯化钠添加水
平中以氯化钠 0. 5%水平可溶性碳水化合物含量最
高, 而氯化钠 1%最低(表 1)。各处理组中, 氯化钠
0% + 葡萄糖 5%和氯化钠 0. 5% + 葡萄糖 5%的可
溶性碳水化合物含量极显著高于其它组,在剩余的其
它处理中以氯化钠 0. 5% + 葡萄糖 2%最高。
51第 1期 张 涛等:苜蓿绿汁发酵液发酵条件研究
表 1 氯化钠和葡萄糖添加量对绿汁发酵液 pH 值、可溶性碳水化合物和氨态氮的影响
T able 1 Effect s o f different supplementation lev els of NaCl and g lucose on pH, WSC and NH3-N of GFJ
添加水平
Addin g level
pH 值
pH value
可溶性碳水化合物( mg/ ml )
WSC( m g/ ml)
氨态氮( mg/ ml )
NH3-N( mg/ ml )
NaCl
% ( g/ g)
glucose
% ( g/ g)
平均值±标准差
AV±SD
平均值±标准差
AV±SD
平均±标准
AV±SD
0 0 4. 67±0. 06a 1. 47±0. 28c 0. 51±0. 06a
1 4±0c 1. 83±0. 09c 0. 41±0. 01cd
2 3. 7±0e 4. 61±0. 29c 0. 41±0. 04cd
5 3. 63±0. 06fg 19. 70±2. 50b 0. 48±0. 05ab
0. 5 0 4. 7±0a 1. 58±0. 03c 0. 53±0. 04a
1 3. 9±0d 2. 04±0. 23c 0. 38±0. 02d
2 3. 67±0. 06ef 5. 31±1. 51c 0. 32±0. 02e
5 3. 6±0g 25. 82±8. 57a 0. 39±0. 02cd
1 0 4. 67±0. 06a 1. 65±0. 10c 0. 48±0. 00ab
1 4. 6±0b 1. 25±0. 88c 0. 44±0. 02bc
2 4. 6±0b 2. 33±1. 14c 0. 43±0. 01bcd
5 4. 57±0. 06b 1. 77±0. 20c 0. 51±0. 00a
0 4. 0b 5. 74b 0. 45a
0. 5 3. 97c 8. 69a 0. 39b
1 4. 61a 1. 75c 0. 46a
0 4. 68a 1. 57b 0. 51a
1 4. 17b 1. 70b 0. 41c
2 3. 99c 4. 08b 0. 39c
5 3. 93d 15. 27a 0. 45b
P值 P value
Glu cose < 0. 01 < 0. 01 < 0. 01
NaCl < 0. 01 < 0. 01 < 0. 01
Glu cose * NaCl < 0. 01 < 0. 01 < 0. 05
注:同列中不同字母间差异显著( P < 0. 05) ; Note: Dif ferent let ter s of a, b, c, d, at the end of statis t ic figu res in the same column indicate sig-
nif icant dif f erences
图 1 氯化钠和葡萄糖添加量对绿汁发酵液 pH 值的动态影响
Fig. 1 Dynamic effects of differ ent supplementation
levels o f NaCl and gluco se on pH o f FGJ
2. 3 氯化钠和葡萄糖添加水平对绿汁发酵液氨态氮
的影响
氯化钠和葡萄糖水平及其交互作用对苜蓿绿汁发
酵液中氨态氮含量影响极显著( P< 0. 01) (表 1)。氯化
钠0. 5%添加水平氨态氮含量极显著低于 0%和 1%添
加水平( P< 0. 01)。葡萄糖各添加水平的氨态氮含量极
显著低于对照( P < 0. 01)。各处理组中以氯化钠
0. 5%+ 葡萄糖 2%的氨态氮含量最低( P< 0. 01)。
2. 4 氯化钠和葡萄糖添加量对绿汁发酵液有机酸含
量的影响
氯化钠、葡萄糖及氯化钠和葡萄糖交互作用水平
对乙酸有极显著影响( P< 0. 01) ,对丙酸和丁酸没有
显著影响(表 2)。氯化钠 1%添加水平乙酸极显著高
于其余两个水平。添加葡萄糖对苜蓿绿汁发酵液的乙
酸含量有极显著影响( P< 0. 01) ,对照的乙酸含量极
显著高于各葡萄糖添加水平,而葡萄糖添加水平之间
没有显著差异。葡萄糖添加水平比较,对照的丙酸显
著高于葡萄糖 1%添加水平。试验中丁酸含量极少,
各处理之间没有显著差异。氯化钠对乳酸含量没有显
著影响。5%葡萄糖添加水平乳酸含量极显著低于其
余各组( P< 0. 01)。氯化钠和葡萄糖交互作用的各处
理组存在显著差异,其中氯化钠 0. 5%+ 葡萄糖 2%
和氯化钠 0%+ 葡萄糖 1%乳酸含量最高, 显著高于
氯化钠 0%+ 葡萄糖 5%和氯化钠 0. 5%+ 葡萄糖
5%处理。
52 草 地 学 报 第 15卷
表 2 氯化钠和葡萄糖添加量对绿汁发酵液乙酸、丙酸、丁酸和乳酸的影响
T able 2 Effect s o f different supplementation lev els o f NaCl and g luco se on acet ic acid,
pr opionic acid, but yr ic acid and lact ic acid o f GFJ
添加水平
Addin g level
乙酸(m g/ ml)
Acet icacid( mg/ ml )
丙酸( mg/ ml )
Propionic acid( mg/ ml)
丁酸(m g/ ml)
Bu tyric acid( mg/ ml )
乳酸( mg/ m l)
Lact ic acid( mg /m l)
NaCl
% ( g/ g)
Glucose
% ( g/ g)
平均值±标准差
AV±SD
平均值±标准差
AV±SD
平均值±标准差
AV±SD
平均值±标准差
AV±SD
0 0 5. 09±0. 18a 0. 58±0. 48 0. 00±0. 00 8. 70±1. 97ab
1 3. 78±0. 37b 0. 34±0. 26 0. 01±0. 01 16. 72±4. 58a
2 3. 96±0. 14b 0. 50±0. 15 0. 00±0. 00 12. 13±9. 78ab
5 3. 79±0. 08b 0. 32±0. 28 0. 00±0. 00 2. 51±0. 72b
0. 5 0 5. 06±0. 31a 0. 64±0. 20 0. 00±0. 00 9. 78±5. 70ab
1 3. 98±0. 18b 0. 23±0. 13 0. 00±0. 00 9. 68±8. 62ab
2 4. 00±0. 46b 0. 33±0. 24 0. 00±0. 00 18. 82±6. 47a
5 3. 82±0. 26b 0. 57±0. 12 0. 00±0. 00 1. 91±0. 35b
1 0 4. 95±0. 08a 0. 67±0. 29 0. 01±0. 02 11. 27±4. 85ab
1 5. 14±0. 03a 0. 38±0. 27 0. 00±0. 00 9. 38±3. 49ab
2 5. 22±0. 04a 0. 66±0. 21 0. 00±0. 00 8. 23±4. 54ab
5 5. 12±0. 62a 0. 47±0. 28 0. 00±0. 00 8. 23±4. 18ab
0 4. 16b 0. 44 0. 002 10. 01
0. 5 4. 21b 0. 44 0. 001 10. 05
1 5. 11a 0. 54 0. 000 9. 28
0 5. 03a 0. 67a 0. 002 9. 92a
1 4. 30b 0. 32b 0. 003 11. 93a
2 4. 39b 0. 50ab 0. 000 13. 06a
5 4. 25b 0. 45ab 0. 000 4. 21b
P值 P value
Glucose < 0. 0001 0. 5237 0. 4953 0. 0088
NaCl < 0. 0001 0. 1095 0. 5311 0. 9237
Glucos e * NaCl 0. 0006 0. 7671 0. 2812 0. 0960
注:同列中不同字母间差异显著( P < 0. 05) ; Note: Dif ferent let ter s of a, b, c, d, at the end of statis t ic figu res in the same column indicate sig-
nif icant dif f erences
2. 5 氯化钠和葡萄糖添加量对绿汁发酵液中乳酸杆
菌和乳酸球菌数量的影响
氯化钠水平对苜蓿绿汁发酵液中的乳酸杆菌和
乳酸球菌菌落数没有显著影响, 葡萄糖水平对乳酸杆
菌和乳酸球菌菌落数有极显著影响( P< 0. 01) , 氯化
钠和葡 萄糖交互作 用对乳 酸杆菌 显著影响
( P< 0. 05) ,乳酸球菌极显著( P< 0. 01) (表 3)。
3 讨论与结论
3. 1 氯化钠添加量对绿汁发酵液的影响
本实验中氯化钠添加水平中 0. 5%水平 pH 值最
低, 1%水平的 pH 值最高, 0. 5%添加水平的WSC含
量最高, 而 1%添加水平的 WSC 含量最低, 氯化钠
0. 5%添加水平的氨态氮含量极显著低于其他添加水
平。以上分析结果说明,添加氯化钠的确可以抑制有
害微生物,提高发酵品质。但是高的氯化钠( 1% )添加
量对有害细菌的抑制同时也对乳酸菌菌系也抑制,导
致乳酸产生减少, pH 值终值较高, 有害微生物受到
的抑制作用有限, 导致绿汁发酵液中的WSC 含量减
少, 而氨态氮含量增多。本实验表明,氯化钠添加水平
对苜蓿绿汁发酵液发酵品质有显著影响, 以氯化钠
0. 5%添加水平的绿汁发酵液发酵效果最好。
3. 2 葡萄糖添加量对绿汁发酵液的影响
Ohyama 研究表明[ 13] ,在意大利黑麦草中添加葡
萄糖, 可使发酵得到改善,试验中把葡萄糖按 20 g/ kg
的比例加到含水溶性碳水化合物 41 g/ kg 干物质的意
大利黑麦草中, 结果 pH 值为 3. 69,乳酸含量为 20 g/
kg ,与之相比对照的 pH 值为 5. 71,而且不含乳酸。本
试验中葡萄糖的 4个添加水平比较,葡萄糖 0%添加
水平的 pH 值、氨态氮含量极显著高于 1%、2%和 5%
这 3个葡萄糖添加水平,这说明添加葡萄糖可以提高
促进绿汁发酵液发酵,抑制了有害微生物对蛋白质的
分解作用,提高了苜蓿绿汁发酵液的营养价值,与部分
学者的试验结论相同[ 13～1 5]。
53第 1期 张 涛等:苜蓿绿汁发酵液发酵条件研究
表 3 氯化钠和葡萄糖添加量对绿汁发酵液
乳酸杆菌和乳酸球菌的影响
T able 3 Effects o f different supplement ation lev els of
NaCl and g lucose on the numbers of L actobacilli
and L actococci of GFJ
添加水平
Add ing level
乳杆菌( Log10cfu / ml)
Lactobac ill i
乳球菌( Log10cfu/ ml )
Lactococci
NaCl
% ( g/ g)
Glucose
% ( g/ g)
平均值±标准差
AV±SD
平均值±标准差
AV±SD
0 0 8. 55±0. 09bcd 8. 31±0. 06bc
1 8. 50±0. 02dc 8. 01±0. 08d
2 8. 76±0. 10ab 8. 53±0. 22abc
5 8. 76±0. 09ab 8. 56±0. 21ab
0. 5 0 8. 79±0. 13a 8. 46±0. 13abc
1 8. 38±0. 09d 8. 45±0. 15abc
2 8. 54±0. 24bcd 8. 36±0. 21bc
5 8. 70±0. 14abc 8. 67±0. 07a
1 0 8. 82±0. 05a 8. 27±0. 05c
1 8. 67±0. 08abc 8. 43±0. 13abc
2 8. 59±0. 1abcd 8. 38±0. 03bc
5 8. 76±0. 1ab 8. 54±0. 03abc
0 8. 64 8. 33b
0. 5 8. 62 8. 47a
1 8. 71 8. 40ab
0 8. 72a 8. 35b
1 8. 53b 8. 29b
2 8. 63ab 8. 41b
5 8. 74a 8. 58a
P值 P value
Glucose 0. 0049 0. 0012
NaCl 0. 1894 0. 0747
Glucos e * NaCl 0. 0132 0. 0089
注:同列中不同字母间差异显著( P < 0. 05) ; Note: Different let-
ters of a, b, c, d, at the end of stat is ti c f igures in th e s ame column in di-
cate signif icant dif feren ces
本试验所用苜蓿相同, 其自身附着的微生物也应
相同, 添加葡萄糖后虽然提供了碳源, 增加了产生乙
酸和丙酸的作用底物, 但葡萄糖三个添加水平的乙酸
含量都极显著低于对照,丙酸葡萄糖 1%添加水平显
著低于对照, 说明添加葡萄糖利于乳酸菌的发酵,尤
其是同型发酵乳酸菌的发酵。5%葡萄糖添加水平乳
酸极显著低于其余各组。添加葡萄糖后提供了乳酸产
生的底物,有利于乳酸菌增殖, 而 5% 葡萄糖添加水
平乳酸极显著低于对照和 1%和 2%组,其中原因应
继续研究。
3. 3 氯化钠和葡萄糖添加量交互作用对绿汁发酵液
的影响
氯化钠和葡萄糖添加量的交互作用对绿汁发酵
液的 pH 值,可溶性碳水化合物、氨态氮、乳酸含量都
有显著影响, 综合考虑氯化钠 0. 5%+ 葡萄糖 2%的
苜蓿绿汁发酵液的发酵品质最好。
参考文献:
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(责任编辑 孙洪仁)
54 草 地 学 报 第 15卷