全 文 ：第 17 卷
第 3 期

Vol. 17
No . 3
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2009 年
5 月

May

2009
中间偃麦草、长穗偃麦草及其杂种 F1 代同工酶研究
撒多文 , 米福贵* , 刘玉良
(内蒙古农业大学生态环境学院, 呼和浩特
010019)
摘要 :通过对过氧化物酶( POD)、酯酶( EST )、超氧化物歧化酶( SOD)和多酚氧化酶( PPO)同工酶谱的分析,探讨中
间偃麦草(Ely tr igia elong ata ( H ost) Nevski)、长穗偃麦草 (E. intermed ia ( H ost) Nev ski)及其杂种 F1 代的酶谱
特征和亲缘关系。结果表明:亲本同工酶酶带数目、迁移率、着色程度等差异不大,二者亲缘关系较近。与亲本相
比,杂种 F 1 代存在 POD、SOD、PPO 酶带丢失现象,但正、反交植株中均产生了一些亲本没有的新生带。杂种 F 1 代
EST 酶谱与亲本基本相同,仅着色程度略有差异。杂种 F1 代植株的 POD、PPO 酶谱特征有偏向中间偃麦草的倾
向,而 SOD酶谱特征倾向于长穗偃麦草。杂种 F 1 代同工酶具有多态性, 可作为遗传标记用于杂种鉴定和后代株
系目标性状的选择。
关键词:中间偃麦草; 长穗偃麦草;同工酶
中图分类号: S311, S812




文献标识码: A




文章编号: 1007
0435( 2009) 03
0349
05
Isozyme Studies of Elytrigia Hybrids (E. elongate
E. intermedia) and Their Parents
SA Duo
wen, M I Fu
gui* , L IU Yu
liang
( College of Ecology and Environmental S cience, Inner Mongolia Agricul tural University, Hohhot , Inner Mongolia Autonomous Region 010019, China)
Abstract: Through the analysis of isozyme zymograms of perox idase ( POD) , esterase ( EST ) , superox ide
dismutase ( SOD) , and polyphenol ox idase ( PPO ) , the zymogr am char acterist ics and relat ionship of
Ely tr igia hybrids, E. elong ate
E . intermedia, and their parents w ere studied. T he r esults ar e as fo l

low s: the band number, mig ration rate, and pigmentat ion degr ee of isoenzymes betw een parents had slight
dif ferences and their g enetic relat ionship could be clo se. F1 hybrids lacked of some bands of POD, SOD,
and PPO isoenzyme as compared to their parents, but had some new bands in descendant of r eciprocal
cro ss; EST bands o f hybr id F 1 were almost the same as the parents except the pigmentat ion degree. The
character ist ic of isozyme bands of POD and PPO of hybrid F 1 had the tendency to E. elongata, and the
SOD iso zyme band to E. intermedia. Isozyme Po lymorphisms ex isted in hybrid F1 which could be used as
the genet ic marker to ident ify hybrids and determine the plants w ith target characterist ics in descendant
st rains.
Key words: Ely tr igia elongata ( Ho st ) N ev ski; E. intermedia ( Host) Nevski; Isoenzyme


同工酶是基因的直接产物,具有明显的种属、组
织和发育阶段特异性[ 1] , 而同工酶谱则是基因表达
后的一种表现型,可作为物种鉴定、植物分类、进化、
遗传与变异等研究的重要指标。在植物遗传育种研
究中,同工酶从分子水平上鉴别外部形态难以得出
的遗传差异,为研究遗传多样性提供重要的依据 [ 2]。
在诸多同工酶中,过氧化物酶( POD)、酯酶( EST)被
较广泛地应用于植物亲缘关系的研究, 而超氧化物
歧化酶( SOD)、多酚氧化酶( PPO)在植物组织系统
内保护机制及抗病性研究中应用较多 [ 3, 4]。
偃麦草属 ( Ely tr igia Desv . )植物为多年生丛
生禾草,分布于温带, 全世界约有 40种, 我国有 1
种,引进 5种 [ 5]。本属植物一直是小麦育种的野生
优良基因库, 也是重要的优良牧草种质资源。本试
验对长穗偃麦草( Ely tr ig ia elongata ( Host ) Nevs

ki)、中间偃麦草( E. interm edia ( H ost ) Nevski)及
其杂种 F 1代进行比较研究,探讨亲本与杂种在同工
酶水平上的差异性与相似性,为今后中间偃麦草、长穗
收稿日期: 2008
12
30;修回日期: 2009
03
27
基金项目:国家
十一五
科技支撑计划( 2008BADB3B00)
作者简介:撒多文( 1980
) ,男,汉,陕西宝鸡人,硕士研究生, 研究方向为牧草遗传育种与生物技术, E
m ail : saduow en0225@ 163. com ; *
通讯作者 Author for correspondence,E
mail: mfgui@ yahoo. com. cn
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报 第 17卷
偃麦草杂交育种研究提供理论依据。
1
材料与方法
1. 1
试验材料
试验材料为中间偃麦草、长穗偃麦草及其杂种
F1 代植株, 杂种 F 1 代的组配情况及每种供试材料
的来源见表 1。
1. 2
试验方法
1. 2. 1
酶液提取
每种材料取分蘖期叶片 0. 5 g,
清水洗净后加入 10%的甘油溶液, 在冰浴中研磨成
匀浆, 10000 r/ m in离心 15 min 后取上清液置 0

以下冰箱内备用。
表 1
供试材料
T able 1
Mat er ials tested
材料
M aterial
学名
Scientific name
编号
No
来源
Source
中间偃麦草 Ely tr igia. intermedia ( Ho st) Nevski F 莫斯科植物园 Moscow Bo tanical Garden
长穗偃麦草 Ely tr igia elong ata ( Ho st) Nevski E 莫斯科植物园 Moscow Bo tanical Garden
杂种 F1 E. intermedia
E. elongata Z1、Z2 莫斯科植物园 Moscow Bo tanical Garden
杂种 F1 E. elongata
E. intermedia Z3、Z4 莫斯科植物园 Moscow Bo tanical Garden
1. 2. 2
电泳
采用不连续垂直板聚丙烯酰胺凝胶
电泳法。分离胶缓冲系统为 T ris
H Cl 缓冲液( pH
8. 9) ,浓度 9% ; 浓缩胶缓冲系统为 Tr is
HCl 缓冲
液( pH 6. 8) ,浓度 3. 5%。电极缓冲液用pH 8. 3的
Tris
甘氨酸缓冲液。每槽进样 20
l,溴酚蓝作前沿
指示剂。浓缩胶电压强度 100 V, 分离胶电压强度
250 V,用 DYY

2稳压稳流电泳仪稳流电泳 6 h,
溴酚蓝指示剂线距前沿 2 cm 时,停止电泳。
1. 2. 3
染色
1. 2. 3. 1
过氧化物酶( POD)染色方法
取联苯胺
( 0. 2 g 联苯胺+ 1. 5 mL 冰醋酸+ 8. 5 mL 蒸馏水)
10 mL、5% EDTA 溶液 10 mL、4%氯化铵溶液 10
mL 和 0. 3% H 2O 2 溶液 10 mL, 反应 10 m in 显带
后,迅速倒掉多余的染液,用去离子水冲洗掉剩余染
液。根据染色的酶谱计算相对迁移率 Rf 值( Rf =
酶带迁移距离/前沿指示剂距离) ,照相并绘制酶带
模式图,标定酶带位置(下同)。
1. 2. 3. 2
酯酶( EST)染色方法
坚固蓝 RR 盐 30
mg 溶于 30 mL pH 6. 4 的 0. 1 mol/ L 磷酸缓冲液
中,加 2 mL 1%

醋酸萘酯、1 mL 2%

醋酸萘酯,
混匀。
1. 2. 3. 3
超氧化物歧化酶多酚氧化酶( SOD)染色
方法
电泳完毕的凝胶片依次浸入下列溶液中:

在 A液( 2. 45
10- 3 mo l/ L NBT 溶液)中于黑暗下
浸泡 30 m in;
在 B 液 ( 取核黄素 10. 5 mg,
TEMED 0. 419 mL, 用 3. 6
10- 2M、pH 7. 8 的磷
酸缓冲液稀释至 100 mL)中于黑暗下浸泡 15 m in;

在 C 液(取 EDTA5. 845 mg, 溶于 200 mL 5. 0

10- 2M 磷酸缓冲液)中浸泡并于 40W 日光灯下光
照 30 m in, 在蓝色本底的胶片上出现清晰透明的
SOD同工酶谱带。
1. 2. 3. 4
多酚氧化酶( PPO)染色方法
称取邻苯
二酚 2. 2022 g 和对苯二胺 0. 1 g,溶于100 mL 蒸馏
水中,溶解后过滤即为染色液。为了稳定颜色并除
去杂色, 用 1 mM 抗坏血酸冲洗 5 min,泡在水里过
夜,呈现清晰酶带。
2
结果与分析
2. 1
亲本及杂种 F1 过氧化物酶同工酶酶谱特征
图 1与表 2为过氧化物酶聚丙烯酰胺凝胶电泳
结果、模式图及 Rf值。可以看出, 中间偃麦草 F 与
长穗偃麦草 E 有相同的 5 个位点( POD
1、POD
3、
POD
4、POD
9、POD
10) ,为亲本共有的基本酶带,
Rf值分别为 0. 05、0. 09、0. 12、0. 32、0. 36, 基本酶
带约占亲本的 77%, 说明两亲本之间亲缘关系较
近。但长穗偃麦草 E有 5条酶带,中间偃麦草 F 有
8条酶带, 酶带数目、迁移率、着色程度(活性)各不
相同,说明两亲本种间存在一定的差异性。
正交(中间偃麦草
长穗偃麦草) F 1 代的过氧
化物酶酶带数为 5- 6条, 反交(长穗偃麦草
中间
偃麦草) F1 代的酶带数也为 5- 6 条,二者继承了亲
本的 4个位点,但与亲本相比均存在着较大的差异
性。正交 F1 代互补了中间偃麦草的两条酶带( Rf
0. 14 0. 19) , 丢失了中间偃麦草 1 条酶带 ( Rf
0. 07) ,产生了 1条新生带( Rf 0. 14) ,即杂交带。反
350
第 3期 撒多文等:中间偃麦草、长穗偃麦草及其杂种 F1 代同工酶研究
交 F1 代与正交 F1 代产生的杂交带都在 POD
5 位
点上;在 POD
1位点上, 正、反交 F 1 代和亲本均为
着色较深的深色带,酶含量丰富, 活性强;在 POD
7
位点上,反交 F1 代 Z3产生 1条杂交带( Rf 0. 17) ;
在 POD
9位点上,正交 F 1 代 Z1、Z2继承了中间偃
麦草的酶谱特征, 反交 F1 代 Z3、Z4酶带丢失。总
体看,杂种 F 1 代酶谱偏向于中间偃麦草。
图 1
过氧化物酶酶谱模式图
F ig . 1
Iso zyme zymog ram pattern of POD
注: Z1、Z2:中间偃麦草
长穗偃麦草( F1) ; Z3、Z4:长穗偃麦草

中间偃麦草( F1 ) ; E. 长穗偃麦草; F中间偃麦草; (下同)
Notes: Z1, Z2: E. int ermedia
E. e long ate ( F1 ) ; Z3, Z4: E.
e long ate
E . int ermedia( F1) ; E: E. elon gate; F: E. int er media;
sam e as follow s
2. 2
亲本及杂种 F1 酯酶同工酶酶谱特征
从图 2与表 3可知,中间偃麦草 EST 同工酶酶
带数为 5 条, 有 2 条特征酶带, Rf 值分别为 0. 46、
0. 85;长穗偃麦草为 5条酶带, 有 2条特征带, Rf值
分别为 0. 51、0. 53(图 3,图 4, 表 3)。长穗偃麦草与
中间偃麦草共有的酶带为 3 条, Rf 值分别为 0. 79、
0. 82、0. 87, 约占亲本的 60%, 表明中间偃麦草与长
穗偃麦草亲缘关系较近。
图 2
酯酶谱模式图
F ig . 2
Iso zyme zymog ram pattern of EST
正交 F1 代继承了中间偃麦草 EST
1 酶带, 丢
失了 EST
6酶带, 酶活性比中间偃麦草有所降低,
Z1的 4条酶带均为活性弱的浅带, 在 EST
4、EST

5位点上 Z2为较浅窄带。反交 F 1 代继承了长穗偃
表 2
供试材料过氧化物酶酶谱 Rf值
Table 2
POD isozyme zymogram Rf value o f tested mater ials
编号
Material cod e
酶带数
Band No.
POD
1 POD
2 POD
3 POD
4 POD
5 POD
6 POD
7 POD
8 POD
9 POD
10
A 7 0. 05
0. 09 0. 12 0. 14

0. 19 0. 32 0. 36
B 6 0. 05
0. 09 0. 12


0. 19 0. 32 0. 36
C 6 0. 05
0. 09 0. 12 0. 14
0. 17

0. 36
D 5 0. 05
0. 09 0. 12 0. 14



0. 36
E 5 0. 05
0. 09 0. 12



0. 32 0. 36
F 8 0. 05 0. 07 0. 09 0. 12
0. 16
0. 19 0. 32 0. 36
表 3
供试材料酯酶酶谱 Rf值
Table. 3
EST iso zyme zymog ram Rf value of tested mater ials
编号
Material cod e
酶带数
Band No.
EST
1 EST
2 EST
3 EST
4 EST
5 E ST
6 E ST
7
A 4 0. 46

0. 79 0. 82
0. 87
B 4 0. 46

0. 79 0. 82
0. 87
C 4
0. 51
0. 79 0. 82
0. 87
D 4
0. 51
0. 79 0. 82
0. 87
E 5
0. 51 0. 53 0. 79 0. 82
0. 87
F 5 0. 46

0. 79 0. 82 0. 85 0. 87
351
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麦草 EST
2酶带,丢失了 EST
3酶带。正、反交 F 1
代均未产生杂交带, 酶谱特征与亲本基本相同,酶带
着色程度(活性)介于中间偃麦草与长穗偃麦草之间。
2. 3
亲本及杂种 F1 超氧化物歧化酶酶谱特征
中间偃麦草和长穗偃麦草超氧化物歧化酶酶带
均为 3条。中间偃麦草有 1条特征酶带 SOD
5, Rf
值为 0. 75; 长穗偃麦草有 2 条特征酶带 SOD
2、
SOD
3, Rf值分别为 0. 66、0. 67(图 3, 表 4)。双亲
共有的基酶带为 2条,约占亲本酶带的 66. 7% , 表
明两亲本的亲缘关系较近。
杂种 F 1 代超氧化物酶谱与亲本差异性较大。
中间偃麦草 3条酶带均为活性弱的浅带, 长穗偃麦
草的 3条酶带中, SOD
3为活性较强的深色带。在
正交 F1 代中, Z1 丢失了中间偃麦草两条酶带( Rf
0. 73、0. 75)和长穗偃麦草一条酶带( Rf 0. 75)。在
反交 F 1代中, Z3酶带丢失程度与 Z1相同。正、交
F1 代都产生了 1 条差异带 SOD
1 ( Rf 0. 44)。在
SOD
3位点上,正、反交 F1 代继承了长穗偃麦草的
酶带特征,着色程度增强;在 SOD
4位点上,正交F 1
代 Z1和反交 F1 代 Z3 酶带丢失, 而 Z2、Z4 酶带均
为活性较强的较深带。正、反交 F1 代超氧化物歧化
酶酶带特征偏向于长穗偃麦草。
图 3
超氧化物歧化酶酶谱模式图
Fig . 3
Isozyme zymog ram pattern o f SOD
表 4
供试材料超氧化物歧化酶酶谱 Rf值
Table . 4
SOD isozyme zymogram Rf value of tested materials
编号
Material code
酶带数
Band No.
SOD
1 SOD
2 SOD
3 SOD
4 SOD
5
A 3 0. 44 0. 66 0. 67


B 4 0. 44 0. 66 0. 67 0. 73

C 3 0. 44 0. 66 0. 67


D 5 0. 44 0. 66 0. 67 0. 73 0. 75
E 3
0. 66 0. 67 0. 73

F 3

0. 67 0. 73 0. 75
2. 4
亲本及杂种 F1多酚氧化酶同工酶酶谱特征
在多酚氧化酶酶谱中, 中间偃麦草有 7条酶带,
有 1条特征酶带 PPO
2, Rf值为 0. 06;长穗偃麦草
有 5条酶带, 1条特征酶带 PPO
1, Rf值为 0. 05,酶
带着色深、含量丰富。中间偃麦草与长穗偃麦草共
有的基本酶带有 5 条, Rf 值分别为 0. 05、0. 09、
0. 13、0. 48、0. 65, 占二者的 71% (图 4, 表 5)。表明
两亲本的亲缘关系较近。
正、反交 F 1代酶带数相同, 均为 7 条酶带。在
PPO
1位点上, 反交 F 1代 Z3酶带着色程度增强,含
量增加;中间偃麦草 PPO
2( Rf 0. 06)酶带在正反交
F 1代植株均丢失;在 PPO
4位点上,正交F1代Z2酶
带着色程度增强,含量增加; 在 PPO
5位点上, 正、
反交 F1 代都产生了同一条新生带 PPO
5( Rf 0. 17) ,
Z3的新生带为较深窄带,活性较强, Z1、Z2、Z3的新
生带均为浅带,活性较弱。杂种 F 1代酶谱特征与亲
本基本相同,但有偏向中间偃麦草的趋向。
图 4
多酚氧化酶模式图
F ig. 4
Iso zyme zymog ram pattern of PPO
3.
讨论
3. 1
同工酶的合成受遗传基因控制,具有一定的稳
定性[ 6, 7]杂种。F1 代植株的过氧化物酶、超氧化物
歧化酶、多酚氧化酶同工酶均产生了杂交带,分别为
POD
5、POD
7、SOD
1、PPO
5、PPO
8、PPO
10, 酯
酶没有产生新生带。这说明杂交 F 1 代出现变异,可
能是基因突变的产物, 也可能是父母本同工酶亚单
位重组产生的 [ 8]。杂种 F 1代过氧化物酶、超氧化物
歧化酶同工酶谱主要表现为双亲酶带的互补类型。
可能是同工酶亚单位单一基因座中多等位基因的显
性表达,即一种等位基因不会因为另一种的存在而
被掩蔽掉产生的[ 9] 。杨太兴等在分析玉米单交种及
亲本自交系同工酶后,发现杂种优势较强的杂交种
352
第 3期 撒多文等:中间偃麦草、长穗偃麦草及其杂种 F1 代同工酶研究
表 5
供试材料多酚氧化酶谱 Rf值
Table. 5
PPO isozyme zymog rams Rf of tested mater ials
编号
Material cod e
酶带数
Band no.
PPO
1 PPO
2 PPO
3 PPO
4 PPO
5 PPO
6 PPO
7 PPO
8 PPO
9 PPO
10
A 7 0. 05
0. 09 0. 13 0. 17 0. 28
0. 51
0. 71
B 7 0. 05
0. 09 0. 13 0. 17 0. 28
0. 51
0. 71
C 7 0. 05
0. 09 0. 13 0. 17 0. 28
0. 51
0. 71
D 7 0. 05
0. 09 0. 13 0. 17 0. 28
0. 51
0. 71
E 5 0. 05
0. 09 0. 13

0. 48
0. 65

F 7 0. 05 0. 06 0. 09 0. 13
0. 28 0. 48
0. 65

并不出现
杂交带
而是出现互补酶带或不表达双亲
共有的酶带。因此, 杂种 F 1 代植株可能在形态性
状、生长势、生物产量、抗性等方面具有较大的杂种
优势[ 10] 。此外,还发现亲本的部分酶带没有在杂种
F1 代中得到表达,如 POD
2、POD
6、PPO
2酶带在
正、反交 F1 代中均丢失, 说明亲本在亲缘关系存在
一定的差异性, 杂种 F 1 代在遗传上、代谢上不平衡,
可能抑制了基因表达 [ 10, 11]。
3. 2
正、反交 F1 代的过氧化物酶、酯酶、超氧化物
歧化酶、多酚氧化酶同工酶谱表型与亲本相比均存
在差异性。同工酶结构差异主要来源于基因的差
异,另外, 部分同工酶在多肽链合成或翻译后其结构
也能发生改变。另外, 正、反交 F1 代同工酶谱中存
在多态性位点的特征酶带[ 12]。生物体携带着多种
基因,每种基因为酶的一种亚单位编码,酶的多态性
成因可分为两大类: 一类是遗传成因或原发性成因,
另一类是翻译后成因或继发性成因,相同的酶亚单
位经过不同的化学修饰, 会从单一基因编码的同一
亚单位变为一群不同的亚单位[ 13] 。因此, 杂种 F 1
代同工酶酶谱在酶带数目、着色程度、迁移率等方面
的差异与多态性位点特征酶带, 可作为杂种鉴定和
目标性状植株选育的依据 [ 14]。
4
结论
4. 1
中间偃麦草和长穗偃麦草的过氧化物酶、酯
酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶同工酶基酶酶带数
的比率达 60%~ 77% ,它们的亲缘关系较近。
4. 2
杂种 F 1 代的过氧化物酶、超氧化物歧化酶、多
酚氧化酶同工酶谱主要表现为双亲酶带的互补类
型,亲本的部分酶带在杂种 F 1 代有丢失现象, 正反
交 F1 代均产生 1 条新生带。杂种 F1 代过氧化物
酶、多酚氧化酶同工酶谱倾向于中间偃麦草, 而超氧
化物歧化酶酶谱倾向于长穗偃麦草。
4. 3
杂种 F 1 代的酯酶同工酶谱与亲本的酶谱基本
相同,只是个别酶带的着色深浅存在差异,所以酯酶
不能作为鉴别杂种 F1 代和亲本的依据。
4. 4
正交 F1 代与反交 F 1 代的过氧化物酶、超氧化
物歧化酶、多酚氧化酶同工酶谱表型均存在差异性,
可作为遗传标记用于杂种鉴定和后代株系目标性状
的选择。
参考文献
[ 1]
孟学平. 14个品种冬小麦过氧化物酶( POD)同工酶研究 [ J ] .
哲里木畜牧学院学报, 1999, 9: 16
18
[ 2]
胡能书,万贤国.同工酶技术极其应用[ M ] .长沙湖南科学技术
出版社, 1985. 70
74
[ 3]
王维平,刘伊强.小麦对赤霉病抗性不同品种的 SOD 活性[ J ] .
植物生理学报, 1993, 19( 4) : 353
358
[ 4]
黄丽华,吴兆苏.抽穗期小麦抗赤霉病与酚类物质的关系初探
[ J] .安徽农业科学, 1998, 26( 3) : 250
251
[ 5]
吉万全,薛秀庄,王秋英,等.中间偃麦草的 GISH 分析[ J] . 西
北植物学报, 2001, 21(3) : 401
405
[ 6]
周立,王曼玲,朱虹琳,等.莲藕多酚氧化酶同工酶的比较分析
[ J] .氨基酸和生物资源. 2005, 27( 2) : 11
13
[ 7]
区炳庆,任吉君,何丽烂,等. 不同品种南瓜 POD 及 PPO同工
酶的比较研究[ J] .武汉植物学研究, 2003, 21( 1) : 77
80
[ 8]
李阳春,谢可军.早熟禾属 10种植物酯酶同工酶分析[ J] .草地
学报, 2003, 11( 3) : 214
219
[ 9]
谢可军,李阳春,吴天德. 10种早熟禾属植物的过氧化物酶同
工酶分析[ J] .中国草地, 2003, 25( 2) : 30
33
[ 10] 杜维俊,杨万仓.薏苡、川谷及其 F1 过氧化物酶同工酶分析
[ J] .西北农业大学学报, 2002, 22( 2) : 113
115
[ 11] 谢莉,曾艳华,李冬郁,等. 3个高粱品种及其 F1的过氧化物酶
同工酶分析[ J] .西农业科学, 2007, 38( 6) , 618
620
[ 12] 李造哲,云锦凤,马青枝,等. 披碱草和野大麦及其杂种 F1 与
BC1酯酶同工酶分析[ J ] .草地学报, 2000, 8( 30) : 233
236
[ 13] 赖德 C C,泰勒 C B.同工酶[ M ] .范培昌译.北京:科学出版社,
1987: 3
[ 14] 于卓,云锦凤.小麦族内几种远缘禾草及其杂交种过氧化物酶
同工酶分析[ J] .中国草地, 1999, 2: 4
7
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