全 文 ：第20卷 第3期
Vol.20 No.3
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2012年 5月
May. 2012
不同性别野牛草同工酶酶谱分析
李永祥1,王显国2,丛丽丽1,杨春华1*
(1.四川农业大学草业科学系,四川 雅安 625014;2.中国农业大学草业科学系,北京 100193)
摘要:利用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳技术对3种性别野牛草(Buchloedactyloides)的幼叶和幼穗的过氧化物酶
(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和多酚氧化酶(PPO)同工酶酶谱进行分析,以期通过酶谱的差异表达对野牛草进
行早期性别鉴定。结果表明:雄株野牛草幼穗的POD和PPO同工酶各有1条特异条带Rf0.12和Rf0.15;雌雄同
株的幼穗PPO同工酶酶谱中有1条特异条带Rf0.12;雌株的叶片PPO同工酶酶谱有Rf0.12的特异性条带。通
过分析上述3种同工酶的酶谱发现,叶片的POD和PPO同工酶酶谱可以用来对野牛草进行早期性别鉴定。
关键词:野牛草;性别鉴定;同工酶
中图分类号:Q949;S543.9 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2012)03-0530-06
ZymogramAnalysisofDifferentSexualBuchloedactyloides
LIYong-xiang1,WANGXian-guo2,CONGLi-li1,YANGChun-hua1*
(1.DepartmentofGrasslandScience,AnimalScienceandTechnologyColege,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an,
SichuanProvince625014,China;2.InstituteofGrasslandScience,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China)
Abstract:Superoxidedismutase(SOD),peroxidase(POD)andpolyphenoloxidase(PPO)isozymesof
leavesandspikesfromdifferentsexualBuchloedactyloides(male,femaleormonoecious)specimenswere
analyzedusingpolyacrylamidegelelectrophoresis.ResultsshowedthatthePODandPPOzymogramof
spikesfrommaleplantshaddistinctbands,Rf0.12andRf0.15,respectively;thePPOzymogramofboth
leavesfromfemaleplantsandspikesfrommonoeciousplanthadaspecialband,Rf0.12.Therefore,foliarPOD
andPPOzymogramcanbeusedforsexdeterminationduringearlygrowthstagesofBuchloedactyloides.
Keywords:Buchloedactyloides;Determinationofsex;Isoenzyme
野牛草(Buchloedactyloides)是禾本科画眉草
亚科野牛草属植物,又名水牛草,原产于北美中部半
干旱温带和亚热带地区,是北美干草原的原有植
物[1]。由于原产地气候干燥,因此其具有很好的抗
旱性。与其他草坪草相比,野牛草需要较少的灌溉、
施肥和修剪以及病虫害管理[2-3]。因其建植草坪养
护成本低,而在我国西北、华北以及东北大部分地区
得到推广。
野牛草具有雄、雌以及雌雄同株3种性别。野
牛草的雄株进入花期后,花轴高于株丛,花粉成熟后
草坪呈明显的黄色,雌株花位于冠层以下且颜色与
叶片接近,不影响草坪的美观,因此人们一般选择雌
株建植草坪[4],但野牛草在幼苗期不同性别间株型
差异不大,很难通过形态来区分。如果能够对野牛
草进行早期性别鉴定,对其草坪的建植和育种亲本
的筛选都具有一定的实践指导意义。
依据分子酶学“一个基因一个同工酶亚基”的理
论,同工酶是分子水平的标记,是基因表达的次级反
应[5-6],同工酶的差异表达反映了不同性别植株间基
因结构和表达水平的差异,因此通过同工酶表达差
异探索植物性别的决定和分化机制是可行的[7-9]。
目前国内外尚没有关于不同性别野牛草同工酶酶谱
的报道,在垂柳(Salixbabylonica)[10]、银杏(Gink-
goliloba)[11]和构树(Broussonetiapapyrifera)[12]
的研究中发现性别差异与过氧化物酶等同工酶条带
的数目有关。本试验通过对不同性别野牛草幼叶及
幼穗的 过 氧 化 物 酶 (POD)、超 氧 化 物 歧 化 酶
(SOD)和多酚氧化酶(PPO)同工酶酶谱进行分析,
收稿日期:2011-10-25;修回日期:2011-12-22
基金项目:国家自然科学基金项目(30800799)资助
作者简介:李永祥(1985-),男,山东济南人,硕士研究生,主要从事野牛草性别鉴定的研究,E-mail:493871113@163.com;*通信作者 Au-
thorofcorrespondence,E-mail:ychh@sicu.edu.cn
第3期 李永祥等:不同性别野牛草同工酶酶谱分析
以期在蛋白水平上为野牛草幼苗早期性别鉴定提供
理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料是购自美国的普通野牛草草种,2010
年8月种子发芽,后选取生长一致的幼苗在温室育
苗,2011年4月移植到试验田后,给予相同的管理。
分别取10株生长状态一致的雄株、雌株和雌雄同株
的幼穗和幼叶,用于酶液的提取。
1.2 酶液提取
将采集的材料分别剪碎混匀后秤取0.2g,放入
研钵中,加入1mL提取液和少许石英砂,冰浴研
磨,12000r·min-1,4℃离心10min,取上清液,置
于-20℃冰箱保存备用。
提取液配方[13]:0.5g蔗糖、0.75gKCl溶于
100mLpH7.2的磷酸缓冲液。
1.3 电泳
采用垂直板不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,
根据预试验电泳条件的优化,浓缩胶和分离胶分别
采用5%和8%。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘
氨酸缓冲液(0.25mol·L-1),上样缓冲液2×蛋白
质电泳上样缓冲液(购自天跟公司)。上样量35
μL,浓缩胶电流15mA,分离胶电流40mA,在4℃
冰箱中稳流电泳4~5h,当指示剂到达距离底部1
cm时结束[14]。
1.4 染色
POD同工酶采用醋酸联苯胺法染色,SOD同
工酶采用罗广华[15]的染色方法,PPO同工酶染色方
法:1% 邻苯二酚、0.05 mol·L-1磷酸缓冲液
(pH6.8)和0.06%对苯二胺以3∶1∶1的比例混
合配成染液,然后将胶取下在此染液中染色,出现清
晰谱带后用蒸馏水冲净染料,拍照。
1.5 条带命名
酶谱条带采用相对迁移率命名法命名[16-17]。用
坐标纸测出指示剂的迁移距离(X1)和凝胶中酶带
的迁移距离(X2),计算相对迁移率(relativemobili-
ty,Rf),Rf=X2/X1。
1.6 不同性别植株的遗传距离计算
利用酶谱间相似系数[17-18]的大小表示类群的亲
缘关系。将酶谱不相似系数和Xi填入表1和表2,
绘制各个酶谱在X轴上距离。
2 结果与分析
2.1 过氧化物酶同工酶
由图1可知,野牛草3种性别植株的幼穗和幼
叶的过氧化物酶同工酶条带的迁移率都很小。幼穗
和幼叶的酶带类型类似,但幼叶酶谱中有Rf0.06的
特异性条带。不同性别的幼穗之间和幼叶之间差异
主要有:①条带数不同,幼穗酶谱的条带数分别为雄
株4条,雌株3条,雌雄同株2条。幼叶酶谱的条带
数分别是雄株5条,雌株5条,雌雄同株2条。②带
的强弱不同,雄株幼穗的Rf0.09条带比雌株、雌雄
同株的带的颜色深;Rf0.12条带的强度则为雄株幼
穗>雌株幼穗>雌雄同株幼穗;而在植株幼叶中条
带Rf0.09和Rf0.17的强弱则为雌株>雄株>雌雄
同株的。③特异性酶带不同,雄株幼穗特异性条带
是Rf0.09条带;Rf0.24条带是雌株和雄株幼穗的
共有条带;Rf0.06,Rf0.12和Rf0.24条带是雄株和
雌株幼叶的共有条带。
2.2 超氧化物歧化酶同工酶
SOD是植物体内防御氧毒害的关键酶,通过分
析酶谱发现3种性别的野牛草酶谱没有差异。这3
种性别野牛草的酶谱中主带明显,幼穗和幼叶都只
有1条酶带Rf0.13。雌株幼穗和幼叶的条带较雄
株和雌雄同株的亮一些。
2.3 多酚氧化酶同工酶
通过分析PPO酶谱(图3),发现野牛草的PPO
同工酶的条带迁移率均较小(Rf≤0.18)。野牛草
幼穗和幼叶酶谱的主要差异是雄性植株的幼叶有
Rf0.15的特异条带。在幼穗的酶谱中,各个材料的
条带数分别是雄株和雌雄同株都是2条,雌株为3
条,雄株和雌雄同株各有一条特异条带Rf0.15和
Rf0.12;在幼叶的酶谱中,雄株和雌雄同株的幼叶
都是 2 条酶带,雌株的幼叶有 3 条酶带,并有
Rf0.12的特异条带。
2.4 遗传距离计算
利用POD和PPO同工酶酶谱的相似值计算不
同性别野牛草之间的亲缘关系。
135
草 地 学 报 第20卷
图1 野牛草不同性别的植株幼叶、幼穗的POD同工酶酶谱
Fig.1 PODisozymezymogramofleavesandspikesfromdifferentsexualBuchloedactyloides
注:1:雄株幼穗;2:雌株幼穗;3:雌雄同株幼穗;4:雄株幼叶;5:雌株幼叶;6:雌雄同株幼叶;下同
Note:1:malespike;2:femalespike;3:monoecismspike;4:maleleaf;5:femaleleaf;6:monoecismleaf;thesameasbelow
图2 不同性别野牛草的植株幼穗和幼叶的SOD同工酶酶谱
Fig.2 SODisozymezymogramofleafandspikefromdifferentsexualBuchloedactyloides
图3 3种性别野牛草植株幼叶的PPO同工酶酶谱
Fig.3 PPOisozymezymogramofleafandspikefromdifferentsexualBuchloedactyloides
235
第3期 李永祥等:不同性别野牛草同工酶酶谱分析
表1 过氧化物同工酶酶谱的不相似值和Xi
Table1 DissimilaritycoefficientandXiofPODzymogram
幼穗Spike 幼叶Leaf
雄株
Male
雌株
Female
雌雄同株
Monoecism
∑ Xi
雄株
Male
雌株
Female
雌雄同株
Monoecism
∑ Xi
雄株 Male 14.3 33.3 47.6 100 0 42.9 42.9 100
雌株Female 14.3 20 34.3 19.6 0 42.9 42.9 100
雌雄同株 Monoecism 33.3 20 53.3 0 42.9 42.9 85.8 0
根据野牛草幼穗过氧化物同工酶酶谱绘制 X
轴(图4),从图中可以看出,雌雄同株和雌株的幼穗
亲缘关系比较近,而与雄株的幼穗亲缘关系比较远,
雌雄同株与雌株的幼穗之间亲缘关系比雌株与雄株
的幼穗之间亲缘关系要更近一些。
根据表1中野牛草幼叶过氧化物同工酶酶谱的
Xi值可以看出,雌株和雄株的亲缘关系非常近,两
者与雌雄同株的亲缘关系比较远(图5)。
图4 3种性别野牛草幼穗的POD同工酶酶谱在X轴上的位置
Fig.4 PODzymogramordinationofspikesfromdifferentsexualBuchloedactyloidesontheXaxis
图5 3种性别野牛草幼叶的POD酶谱在X轴上的位置
Fig.5 PODzymogramordinationofleavesfromdifferentsexualBuchloedactyloidesontheXaxis
表2 PPO同工酶酶谱不相似值和Xi
Table2 DissimilaritycoefficientandXiofPPOzymogram
幼穗Spike 幼叶Leaf
雄株
Male
雌株
Female
雌雄同株
Monoecism
∑ Xi
雄株
Male
雌株
Female
雌雄同株
Monoecism
∑ Xi
雄株 Male 50 60 110 0 20 0 20 100
雌株Female 50 20 70 67.3 20 20 40 0
雌雄同株 Monoecism 60 20 80 100 0 20 20 100
根据表2中野牛草幼穗PPO同工酶的Xi绘制
X轴(图6),从图中可以看出,雌株与雌雄同株的幼
穗之间亲缘关系比较近,与雄株幼穗的亲缘关系比
较远,雌雄同株与雌株幼穗间的亲缘关系比雌株与
雄株幼穗间的亲缘关系要更近一些。
图6 3种性别野牛草幼穗的PPO同工酶酶谱在X轴上的位置
Fig.6 PPOzymogramordinationofspikesfromdifferent
sexualBuchloedactyloidesontheXaxis
根据表2中野牛草幼叶PPO同工酶酶谱的Xi
值(图7),雄株和雌雄同株的亲缘关系非常近,两者
与雌株的亲缘关系比较远,这与过氧化物同工酶的
结果不同。
图7 3种性别野牛草幼叶的PPO同工酶
酶谱在X轴上的位置
Fig.7 PPOzymogramordinationofleavesfromdifferent
sexualBuchloedactyloidesontheXaxis
3 讨论
同工酶是生物体基因表达的产物,体现了基因
表达的差异,目前已作为分子标记用于动植物遗传
多样性、生物进化和种系发生等方面的研究[20]。
Penel[21]在分析菠菜(Spinaciaoreracea)的同工酶
谱时发现酶谱与其性别存在相关性,林伯年[22]把同
工酶酶谱的差异在杨梅(Myricarubra)性别鉴定中
作为了依据。
335
草 地 学 报 第20卷
POD是目前作为性别鉴定依据的一种同工酶。
在葡萄[23](Vitisvinifera)POD同工酶研究中,发
现在同一个种内雌株和雄株的酶带不同,雄株的酶
带数多于雌株。张雪明[24]等在杨梅雌雄株POD同
工酶图谱分析中也发现雌株有特异性酶带。本试验
通过对野牛草幼穗和叶片POD酶谱的分析发现,雄
株幼穗有1条特异条带,雌雄同株幼叶缺少3条酶
带。范双喜等[24]发现石刁柏(Asparagusofficina-
lis)性别差异与POD同工酶条带的数目有关,并认
为POD同工酶谱的差异可以作为性别鉴定的指标。
本试验的结果与范双喜等[24]的研究基本一致,由此
认为野牛草过氧化物同工酶酶谱可以作为鉴定性别
的依据。SOD同工酶是一类保护植物免受超氧负
离子毒害的酶。艾辛[25]在研究黄瓜(Cucumissati-
vus)的SOD同工酶酶谱时发现酶带的差异大多与
雌性或雌雄性别紧密相关,经检验可以作为黄瓜雌
性株早期鉴定的依据,但是本试验发现超氧化物酶
的表达没有差异,不能作为鉴定性别的依据。PPO
同工酶和POD同工酶类似,也已经成为性别鉴定的
依据。李慧敏等[26]在研究罗汉果(Corsvenormo-
mordica)的PPO同工酶酶谱时发现,其雌株和雄株
都有各自的特异条带;同时陈中海[27]在研究番木瓜
(Caricapapaya)的性别鉴定时也把PPO同工酶酶
谱作为一个依据。本试验中通过分析野牛草幼穗和
幼叶的PPO同工酶酶谱发现雄株幼穗有1条特异
条带Rf0.15,雌雄同株幼穗的特异条带是Rf0.12,
雌株幼叶也有1条为Rf0.15特异条带,这与李慧敏
和陈中海的研究一致,因此认为野牛草PPO同工酶
酶谱可以作为性别鉴定的依据。
虽然幼穗的鉴定结果比较好,但是由于幼穗出
现时已经可以从外部形态上对野牛草进行性别鉴
定,因此幼穗的同工酶酶谱对于早期鉴定的实践指
导意义不是很大,故本试验结果认为叶片同工酶酶
谱作为性别早期鉴定比较合适。
利用酶谱的不相似值计算材料间的遗传距离在
八角属(Dysosma)[18-19]植物中已经验证是可行的,
然而在野牛草的性别表现型中雌雄同株又可分为偏
雌、偏雄和雌雄比例接近之分[28-30]。本试验中雌雄
同株的样本可能代表着偏雌的雌雄同株,并不能完
全代表雌雄同株,因此3种材料间的遗传距离有待
进一步的验证和探究。
4 结论
叶片的POD同工酶酶谱中雌雄同株缺少3条
酶带,故可以在早期鉴定出雌雄同株。叶片的PPO
同工酶酶谱中雌株有一条特异性条带Rf0.12,故可
以鉴定出雌株。总结上述2点,可以利用野牛草叶
片的POD同工酶和PPO同工酶酶谱对野牛草的性
别进行早期鉴定。
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(责任编辑 李美娟
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