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Vol.23 No.6
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ACTA AGRESTIA SINICA
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Nov. 2015
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犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪犻狀犛犺犪犪狀狓犻犘狉狅狏犻狀犮犲
LIHongjian1,LIFanghong1,SHIJian2,HuTianming1,
ChengJiming1,QIANYonghua1,JIAOFeng1
(1.ColegeofAnimalScienceandTechnology,NorthWestAgricultureandForestryUniversity,Yangling,Shaanxi
Province712100,China;2.AnimalhealthinspectionofXipocountry,Binxian,ShaanxiProvince713500,China)
犃犫狊狋狉犪犮狋:犘犺狅犿犪Leafspotisaseriousleafdiseaseinalfalfa,whichhashappenedinShaanxiProvincein
recently.Inordertofindoutthepathogenofthisdiseaseexactly,thediseasedleaftypicalsymptomwas
thatsomesepiaspotstogetherexpandlikea"annulation"scab,andtheconidiawerehyaline,cylindrical,
amerosporeandunicelular,andthesizewas7×1.25μm.Thephylogenetictreeofthepathogennucleo
tidesequenceofinternaltranscribedspacer(ITS)shared99%similaritywiththatof犘犺狅犿犪犿犲犱犻犮犪犵犻狀犻狊
狏犪狉.犕犲犱犻犮犪犵犻狀犻狊(DQ109960)inNeighbourJoining(NJ)tree,or98%similarityusingunweightedpair
groupmethodinarithmeticmeans(UPGMA)tree.Theinoculationofexcisedleaftissueverifiedthatthe
pathogenhadpathogenicity.Theresultsindicatedthatitwascausedby犘犺狅犿犪犿犲犱犻犮犪犵犻狀犻狊狏犪狉.犕犲犱犻
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Authorforcorrespondence,Email:qyh@nwsuaf.edu.cn;fjiao@nwsuaf.edu.cn
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Fig.3 Thesequenceof犘犺狅犿犪犿犲犱犻犮犪犵犻狀犻狊ofleafspotpathogen
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Table1 ThestrainsofsimilarsequencesbyNCBIBlast
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犘犺狅犿犪犿犲犱犻犮犪犵犻狀犻狊狏犪狉. P3 DQ109960.1 99%
犘犺狅犿犪犺犲狉犫犻犮狅犾犪 CBS629.97 GU237898.1 98%
犇犻犱狔犿犲犾犾犪狆犺犪犮犪犲 CBS184.55 EU167570.1 98%
犘犺狅犿犪犿犪犮狉狅狊狋狅犿犪 DAOM DQ474091.1 98%
犃狊犮狅犮犺狔狋犪狉犪犫犻犲犻 CBS237.37 EU167600.1 98%
犃狊犮狅犮犺狔狋犪狆犻狊犻狏犪狉.狆犻狊犻 CBS108.26 EU167557.1 97%
犃狊犮狅犮犺狔狋犪狏犻犮犻犪犲狆犪狀狀狅狀犻犮犪犲 CBS254.92 EU167559.1 97%
犕犻犮狉狅狊狆犺犪犲狉狅狆狊犻狊狅犾犻狏犪犮犲犪 CBS303.68 JX681101.1 97%
犕犻犮狉狅狊狆犺犪犲狉狅狆狊犻狊狆狉狅狋犲犪犲 CPC1423 JN712495.1 97%
犘犺狅犿犪犮狉狔狊狋犪犾犾犻犳犲狉犪 CanS65 JF817335.1 97%
犇狅狋犺犻狅狉犲犾犾犪犵狉犲犵犪狉犻犪 CanS66 JF817336.1 97%
犃狊犮狅犮犺狔狋犪狏犻犮犻犪犲狏犻犾犾狅狊犪犲 CBS255.92 EU167560.1 97%
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[[1] ä³Õ,>%,È*=.=>UV[M]./V:=>4ªSC
K
,1995:114130
[2] [å.=>z{A(!ø"):ìÞãwRÜ!、³RÜ
!
[M]./V:<)SCK,2003
[3] @,?E,æ\%,¡.|Óÿ`¿çY¶Yq{Go
[J].{),2009,28(6):765768
[4] HÊ,ì¨Ú,,¡.犘犺狅犿犪e犘犺狔犾犾狅狊狋犻犮狋犪 e!x1lD
E»«
[J].\,4ª()),1995,17(4):102107
[5] AkamatsuH O,ChilversMI,PeeverTL.Firstreportof
SpringblackstemandleafspotofAlfalfainWashingtonstate
causedby犘犺狅犿犪犿犲犱犻犮犪犵犻狀犻狊[J].PlantDisease,2008,92(5):
833
[6] öÚb,Ú2.DNAÂuòlDE»«[J].ÇG)ë.
)»«
,2004,32(3):7678
[7] =å.YDEò[M]./V:=>4ªSCK,1998:
122125
[8] úW,ÁÉc,ÁQ,¡.ñJz{DNAÂuòlod
[J].=>4),2009,25(8):6264
[9] GuoLD,HydeKD,LiewECY.Identificationof犲狀犱狅狆犺狔狋
犻犮犳狌狀犵犻from犔犻狏犻狊狋狅狀犪犮犺犻狀犲狀狊犻狊basedonmorphologyand
rDNAsequences[J].NewPhytologist,2000,147(2):617630
[10]ÐÀ7,ä<<,Dç,,¡.Ø;WYloÓ³oyJ®]
DE
[J].¡É4ª<),2012(10):79
[11]BoeremaGH,GruyterJD,NoordeloosME,犲狋犪犾.犘犺狅犿犪I
dentificationManual[M].Walingford:CABIPublishing,2004
[12]ûýà,Fï³,æ-.o)1
¿`?5`Yóq¶U
V7ÜYíú
[J].`ª<),1999,16(6):4345
[13]aW&,+Òe.wRܳTYhWî`ݺeßxlém
[J].`ª<),2014,31(4):689696
[14]ïè.`qåæ)—5`Y@)x}[M]./V:=>4ªS
CK
,2001
[15]ï*7,Z>e,.>9,¡.ìÞãz{DNAGCpº¶
x1)®¯
[J].{IJ,1998,17(3):278282
[16]ZhangAW,RiccioniL,PedersenWL,犲狋犪犾.Moleculariden
tificationandphylogeneticgroupingof犇犻犪狆狅狉狋犺犲狆犺犪狊犲狅犾狅狉狌犿
and犘犺狅犿狅狆狊犻狊犾狅狀犵犻犮狅犾犾犪isolatesfromsoybean[J].Phytopa
thology,1998,88(12):13061314
[17]ä>2,ÜC,èà/.RAPDx£AITSÎx£Pw
RÜx1Goln¢
[J].{IJ,2002,21(1):3946
[18]PrattRC.Screeningforresistanceto犛犮犾犲狉狅狋犻狀犻犪狋狉犻犳狅犾犻狅狉狌犿
inalfalfabyinoculationofexcisedleaftissue[J].Phytopathol
ogy,1996,86(3):923928
[19]HC³,¨2,+î.UVETYloÓ³yJDE[J].`
?)
,2001,9(1):2124
[20]$â,$GS.¥¦UVTRYlzDE[J].`?),
2010,18(3):372377
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