全 文 ：第 19 卷 第 2 期
Vol. 19 No. 2
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2011 年 3 月
M ar. 2011
不同品种苜蓿细胞生产蛋白质研究初探
陈 莉1, 赵红洋2 , 申晓蓉1
( 1.西北民族大学生命科学与工程学院, 甘肃 兰州 730030; 2.甘肃农业大学草业学院, 甘肃 兰州 730070)
摘要 : 通过对 5 种苜蓿( Medicago sativa L . )细胞培养物和细胞系的建立, 探讨亲缘关系较远的 5 种苜蓿细胞在培
养过程中,蛋白质和生物量的变化以及在不同氮源和不同蔗糖量为碳源的环境中蛋白质和生物量的变化, 为大规
模培养苜蓿细胞和细胞株的筛选提供一定的基础。结果表明: 5 种苜蓿细胞在培养过程中均在第 18 d 达到最大蛋
白质含量,而生物量则在第 9~ 12 d 达到最大,此时 5 种苜蓿细胞的最大蛋白质含量不同, 分别是苜蓿王> 阿尔冈
金> 德宝> 三德利> 安格;由于 NH +4 / NO-3 比例不同,使 5 种苜蓿细胞在生长过程中对氮的代谢反应表现出不同
的适应性。苜蓿王、安格和德宝的细胞对氮源的适应性比阿尔冈金和三德利的细胞范围广; 2% ~ 3%的蔗糖含量
基本满足 5种苜蓿细胞的生长并能维持渗透压的稳定, 但不同品种苜蓿细胞对蔗糖浓度的选择稍有不同, 如三德
利和安格更适合于 3%的蔗糖浓度。
关键词:苜蓿细胞; 蛋白质含量;生物量; 培养过程
中图分类号: Q813. 11 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2011) 02-0277-06
Exploration of Protein Products from Diverse of Alfalfa Cells
CHEN Li
1
, ZHAO Hong-yang
2
, SHEN Xiao-rong
1
( 1. Northw est University for Nat ionalit ies, C ol lege of Life S cien ce and E ngineering, Lan zhou, Gansu Province 730030, Chin a;
2. Gansu Agricult ral University, College of Grassland, Lanzhou, Gansu Province 730030, China)
Abstract: Five kinds o f alfalfa cell culture lines are established to explo re differ ent genet ic cells and their
culture methods to pr oduce dif ferent protein contents and biomass. Result show ed that fiv e types of alfalfa
cells produced the highest pr otein content at the 18
th
day and the highest biomass at 9
th
to 12
th
day. The
highest pro tein content of different alfalfa cultivars ranked as A lfalfa King> Algonquin> Debao> DeliIII>
Eng lhard. They show a range of nit ro gen metabolism r eactions due to NH
+
4 / NO
-
3 and may be ranked as
Alfalfa King> Eng lhard, Debao > A lgonquin and DeliIII. The opt imum carbon content for alfalfa cells
grow th and osmot ic pressur e is 2%- 3% sucr ose. DeliIII and Eng lhard cells show best g row th in 3% su-
crose content . This art icle provides a database for further study of a large-scale production o f protein in
cultured alfalfa cel ls.
Key words: Alfalfa cell; P rotein content; Biomass; Culture procedur e
多年来植物天然产物的开发一直是人们研究的
热点[ 1] 。二十世纪九十年代以后, 利用植物细胞培
养技术生产的次生代谢产物被人类广泛应用, 一些
天然成分如紫杉醇、紫草宁、迷迭香酸和人参皂苷等
已进入工业化生产阶段[ 3]。利用植物细胞培养技术
生产次生代谢产物近年来取得很大进展, 但如何增
加目的产物的产量是该技术实现工业化生产亟待解
决的难题[ 2]
苜蓿( Med icago sativa L. )作为/ 牧草之王0,
以其拥有高含量的蛋白质而著称。近几年利用苜蓿
叶生产叶蛋白( LPC)已实现了产业化[ 4]。但由于苜
蓿叶蛋白( ALPC)的生产需要以大规模的苜蓿种植
量为基础,经常受到材料来源紧缺的限制。开发利
用苜蓿细胞大规模生产蛋白,不仅可以解决土地占
用和季节限制问题, 并且在苜蓿细胞蛋白提纯和纯
化方面可以节约大量的成本。
本文选用亲缘关系较远的 5种苜蓿做为材料建
立细胞培养物,目的就是选择出具有高蛋白质产量
的细胞系, 并对细胞培养条件做进一步的探索性
研究。
收稿日期: 2010-06-09;修回日期: 2010- 11-26
基金项目:全球环境基金项目( GS- A-091) ;甘肃省自然基金项目( 3ZS051-A25- 072)资助
作者简介:陈莉( 1970- ) ,女,江苏南京人,博士,副教授,主要从事植物生物工程和技术的研究, E-mail: cz2019@ xbm u. edu. cn
草 地 学 报 第 19卷
1 材料和方法
1. 1 植物材料
植物材料来源见表 1。
1. 2 培养基
1. 2. 1 愈伤组织培养基
苜蓿愈伤组织培养基选用 MB 培养基, 即采用
MS
[ 5] 培养基的大量和微量无机营养成分, 及 B5[ 5]
有机营养成分,并添加 3%的蔗糖和 0. 7%的琼脂共
同组成[ 6] 。
1. 2. 2 细胞悬浮培养基
悬浮细胞培养基采用与愈伤组织相同的培养基
成分,不添加琼脂 [ 7]。
表 1 材料来源
T able 1 Source o f materia ls
序号
No.
英文名称
English name
播种日期
Sow ing date
原产地
Producing ar ea
接种日期
Vaccin at ion Date
1 阿尔冈金 Algonquin 08. 9. 3 加拿大 Canada 08. 12. 23
2 德宝 Derby 08. 9. 3 澳大利亚 Aus t ralia 08. 12. 23
3 安格 Engelhard 08. 9. 3 英国 England 08. 12. 23
4 三德利 S andit i 08. 9. 3 荷兰 H olland 08. 12. 23
5 苜蓿王 WL215 08. 9. 3 加拿大 Canada 08. 12. 23
1. 3 试验方法
1. 3. 1 外植体的处理
选取 5个品种的叶片为外植体( 5 g ) , 用自来水
冲洗 20 m in, 75%酒精消毒 20 s, 0. 1%升汞消毒 6
min, 再用无菌水冲洗 4~ 5次,获得无菌体备用[ 8]。
1. 3. 2 愈伤组织诱导
将无菌的 5 个品种叶片分别剪成 3 mm @ 4
mm, 接种在 MB 培养基上。选取 2, 4-二氯苯氧乙
酸( 2, 4-D) , 6-苄基氨基嘌呤( 6-BA ) 2种植物生长调
节剂。利用完全试验法设计试验,每个水平做 3 个
平行试验, 培养 30 d , 观察各外植体的愈伤组织诱
导率,计算平均诱导率, 将该值作为数据比较 [ 9, 10] ,
并选择最适合愈伤组织诱导的激素水平。
诱导率= 产生愈伤组织的外植体块数/总接种
块数 @ 100%
平均诱导率= 诱导率总数/次数@ 100%
1. 4 愈伤组织和悬浮细胞生物量及蛋白质含量
测定
利用最佳诱导率的培养基培养 5种苜蓿愈伤组
织( 25 mg ) , 25 e , 12 h, 光照 900 lx 条件下培养
21 d[ 11] ,每 3 d测定其干重、湿重和蛋白质含量。
1. 4. 1 用蛋白质含量最高时的愈伤组织为材料进
行苜蓿细胞的悬浮培养并测定干重、湿重和蛋白质
含量
将愈伤组织接种在相同激素水平的液体培养基
中,每 150 mL 的三角瓶中加入液体培养基 40 mL,
摇床转速为 150 r # min- 1 , 温度 25 e , 300 lx [ 12]。
每 3 d测定一次细胞的干重、湿重和蛋白质含量。
1. 4. 2 不同氮源培养基中苜蓿细胞的培养
利用蛋白含量最高的愈伤组织为材料, 在其他
条件不变的情况下, 对不同氮源培养基中的 5种苜
蓿细胞在 18 d时测定其干重、湿重和蛋白质含量。
1. 4. 3 不同百分含量的蔗糖培养基中培养苜蓿
细胞
利用蛋白含量最高的愈伤组织为材料, 在其他
条件不变的情况下, 置于不同百分含量的蔗糖液体
培养基中,培养细胞至 18 d时,测定其干重、湿重和
蛋白质含量。
1. 4. 4 苜蓿细胞蛋白质含量、湿重和干重的测定
摇床培养,每隔 3 d分别从 5个品种的苜蓿悬
浮细胞液中取 2 mL, 通过抽虑, 测其细胞湿重; 在
60 e 干燥至恒重后, 在电子天平上测其干重[ 13] , 采
用双缩脲法测定蛋白质 [ 14]。
1. 5 数据分析 运用 M icrosof t Excel 5. 0 软件的
数值分析插件和 Mathemat ica 5. 0软件进行处理。
2 结果与分析
2. 1 5种苜蓿最优诱导率培养基的筛选
由表 2可知, 5 种苜蓿叶外植体在不同培养基
上有不同的诱导率, 阿尔冈金的最佳诱导率培养基
是 MB9和 MB6,德宝、安格都可以在 MB6 和 MB3
培养基上获得理想的诱导率, 苜蓿王在 MB1, MB5
和 MB9上获得一定的诱导率。三德利的最优诱导
率培养基是 MB3和 MB4, 不同品种苜蓿培养愈伤
278
第 2期 陈莉等:不同品种苜蓿细胞生产蛋白质研究初探
组织启动的时间快慢不同。5 种苜蓿分别在 MB9,
MB6和 MB3上接种培养的愈伤组织生长最旺盛,
细胞鲜重增长快, 结构疏松, 颜色乳白透明,表现出
旺盛的生长势。
表 2 五种苜蓿不同培养基上的愈伤组织诱导率
T able 2 Callus induction rat es o f five alfalfas in different media
培养基
Culture m edia
愈伤组织诱导率 Callu s induct ion rates
阿尔冈金 Algonquin 德宝 Derby 安格 Engelhard 三德利 S andit i 苜蓿王 WL215
M B1 , ﹢﹢ ﹢ ﹢ ﹢﹢
M B2 ﹢ , , ﹢ ,
M B3 , ﹢﹢ ﹢﹢ ﹢﹢ ,
M B4 , , , ﹢﹢ ,
M B5 , ﹢﹢ ﹢ ﹢ ﹢﹢
M B6 ﹢﹢ ﹢﹢﹢ ﹢﹢﹢ ﹢ ﹢
M B7 , ﹢﹢ ﹢ , ,
M B8 , ﹢﹢ , , ﹢
M B9 ﹢﹢ , ﹢ ﹢ ﹢﹢
注: + + + 诱导率为 90~ 100% ; + + 诱导率为 75~ 85% ; + 诱导率为 50~ 70% ; ,诱导率为 50%以下
Note: + + + Hig h( 90~ 100%) ; + + M edium( 75~ 85% ) ; + Low ( 50~ 70% ) ; ,Non ( < 50% )
利用完全试验法对 5种苜蓿愈伤组织在不同激
素浓度下生长状况的观察, 分别得到适合 5个苜蓿
品种愈伤组织增殖的激素配比, 阿尔冈金、安格、三
德利、德宝、苜蓿王最适合的激素配比( 2, 4-D mg #
L- 1 / 6-BA mg # L- 1 )水平分别为: ( 1. 5/ 0. 2)、( 1.
5/ 0. 5)、( 2. 0/ 0. 1)、( 2. 0/ 0. 2)、( 1. 5/ 0. 1)。并且将
生长质地较疏松且生长迅速的愈伤组织作为接下来
进行细胞悬浮培养的首选。
2. 2 在各自最优诱导培养基上, 5种苜蓿愈伤组织
最优蛋白含量的选择
5种苜蓿愈伤组织在各自最优激素水平培养基
图 1 5 种苜蓿细胞蛋白质含量与生物量之间的比较
F ig . 1 Five alfalfas. cell pr otein contents and biomass compar ison
279
草 地 学 报 第 19卷
上培养,每隔 3 d测定其蛋白质含量和干物质含量
等,每次设 3个重复。结果表明,安格和三德利的愈
伤组织在培养到第 9 d 时干物质量最大, 阿尔冈金
则在第 12 d时达最大值,德宝和苜蓿王的愈伤组织
在第 9 d达最大并持续到第 12 d。5种苜蓿愈伤组
织培养中蛋白质含量的最大值均出现在第18 d。因
此,用培养到第 18 d的 5种苜蓿细胞作为研究不同
氮源和不同量碳源的研究材料。
2. 3 5种苜蓿细胞悬浮培养过程中最大蛋白质含
量与生物量的选择
由表 3可知,安格和三德利的干物质含量在第
9 d达到最大,阿尔冈金在第 12 d达到最大, 德宝和
苜蓿王在第 9 d就达到最大并持续到第 12 d。但 5
种苜蓿愈伤组织培养中蛋白质含量均在第 18 d达
到最大值且苜蓿王> 阿尔冈金> 德宝> 三德利>
安格。
表 3 5 种苜蓿细胞在培养过程中最大蛋白质积累量和最大生物量出现的时间
Table 3 Per iod of cell cultured wit h the highest pro tein content and biomass
品种 最大蛋白质量出现时间
Cultured p eriod with the h ighes t
pr otein content , d
蛋白质积累量
Protein content
Lg# mg- 1
最大生物量出现时间
Cultu red period w ith th e
highest b iomas s, d
生物量
Biomass
Lg # m g- 1
阿尔冈金 Algonquin 18 31. 1aA 12 287cB
德宝 Derby 18 30. 9bB 9~ 12 366aA
安格 Engelhard 18 29. 5cC 9 232eC
三德利 Deli Ó 18 30. 3bB 9 255dC
苜蓿王 WL215 18 31. 8aA 9~ 12 307bB
注:同列中,标有不同小写字母者差异显著( P < 0. 05) ,标有不同大写字母者差异极显著( P < 0. 01) ,标有相同字母者差异不显著
Note: Dif feren t sm all let ters in th e s ame column m ean signif icant dif feren ces at th e 0. 05 level. Dif feren t capital let ters mean signif icant
di ff erences at the 0. 01 level; the same as below
2. 4 5种苜蓿细胞在不同氮源培养基上蛋白质含
量和干物质量的变化
同理,在保持 2%的蔗糖浓度和氮源总浓度为
60 mM 的条件下,培养到第 18 d时, 5 种苜蓿细胞
在各自的最优激素水平培养基上其蛋白质含量达最
大。因此, 以培养至第 18 d的 5种苜蓿细胞在不同
氮源培养基上的蛋白质含量和生物量来分析不同品
种苜蓿细胞生长过程中氮的代谢。
由图 2可知, 对于培养了 18 d的苜蓿细胞来
说,除了酵母( Yeast paste)浸出物外, 5 种苜蓿细胞
均可以良好生长。由于这几种氮源中存在的 NH +4
和 NO-3 的比例不同,使 5种苜蓿细胞表现出不同的
适应性。酪蛋白水解物( Casein hydro lysate)可有
效的促进阿尔冈金、安格、德宝和苜蓿王细胞蛋白含
量的积累,但阿尔冈金只适合酪蛋白水解物; 而安格
和德宝适宜酪蛋白水解物和尿素 ( Urea) ; 牛肉膏
( Cow meat ex tr act)对三德利苜蓿细胞的蛋白含量
有明显的促进作用; 苜蓿王的适应范围较广, 除酵母
浸出物和 NH 4 Cl+ KNO 3为氮源的培养基外, 都有
利于组织细胞蛋白质的积累。5种苜蓿细胞中, 三
德利在牛肉膏培养基上的蛋白质含量达最大时生物
量则较低,其他 4种苜蓿细胞的生物量都有与蛋白
质含量相似的积累模式。蛋白质合成动态变化与细
胞生长、发育是一致的,细胞生长发育初期需要大量
的蛋白质合成, 对培养到第 18 d的 5 种苜蓿来说,
在相同培养条件下蛋白质含量达到最大, 但在不同
氮源的培养基上则有不同的蛋白质积累量。说明不
同氮源中氮的存在形式不同,直接影响了细胞在蛋
白质合成时对氮的利用程度。
2. 5 不同碳源总量对 5 种苜蓿细胞生长和蛋白含
量的影响
不同种类、生长状态的植物细胞对蔗糖的需求
有较大差别,不同蔗糖浓度对细胞次级代谢产物合
成的影响也是显著的。蔗糖同时也调节培养基中的
渗透压,对细胞生长起着重要作用[ 18]。本文研究了
培养基中一定浓度范围( 1% ~ 6%)的蔗糖对苜蓿细
胞生长到第 18 d的蛋白质合成的影响。
由图 3可知, 对于培养 18 d的苜蓿细胞在不同
蔗糖浓度的培养基中均有不同的生物量和蛋白质含
量变化。在 2%的碳源培养条件下除三德利,其他 4
种苜蓿细胞均可获得较高的蛋白质积累。而此时苜
蓿细胞的生物量和蛋白质积累没有直接的相关性。
在 2%的碳源含量培养基中阿尔冈金、三德利、德宝
和苜蓿王的生物量均可达到最大, 而安格的生物量
则在 3%的碳源含量培养基中达最大。在低糖浓度
下,细胞生长随着糖的耗尽而停止;而在高糖培养基
中,由于高渗透压环境使得细胞对培养基中其他营
养成分的吸收有一定抑制作用。因此, 2% ~ 3%的
蔗糖浓度更有利于苜蓿细胞的悬浮培养。
280
第 2期 陈莉等:不同品种苜蓿细胞生产蛋白质研究初探
图 2 不同氮源对 5 种苜蓿细胞生物量和蛋白质含量的影响
F ig . 2 Compar ison of biomass and protein content betw een different nitr og en sources for fiv e alfalfa cells
3 讨论
从理论上来说,无论采用哪部分组织和器官培
养都应具有相同的代谢合成能力。研究者 Roller
在长春花( Catharanthus roseus )植物生产蛇根碱的
试验中发现,蛇根碱的产量高低与原植物中的含量
没有一致关系。而目前的研究结果却发现, 采用目
的代谢物含量高的外植体进行诱导培养, 其培养细
胞中的目的代谢物含量也高 [ 15]。因此有学者提出,
从不同遗传来源的材料建立细胞培养系, 有利于从
中选择出天然代谢物质高的细胞系。苜蓿品种繁
多,本文选用产地不同的 5种苜蓿的相同生长期的
叶细胞为培养材料, 研究其生长、及不同氮源和不同
蔗糖含量对生长的影响。深入研究还可以选用不同
部位如根和茎的细胞为培养材料进行, 以及细胞生
长过程中对氨态氮和硝态氮的吸收和调节; 蔗糖对
细胞生长中的能量和渗透压的调节等。
4 结论
4. 1 由 5种亲缘关系较远的苜蓿叶诱导生成愈伤
组织,选择蛋白含量最高的愈伤组织建立细胞培养
系。
4. 2 在对 5 种苜蓿细胞培养过程中, 获知第 18 d
时 5种苜蓿细胞的蛋白质含量达最大, 按由大到小
的顺序列为:苜蓿王> 阿尔冈金> 德宝> 三德利>
安格。
4. 3 5种苜蓿细胞在不同氮源培养基上培养时,苜
蓿王有较大的适应范围,其次是安格和德宝,阿尔冈
金和三德利的氮源适应范围最窄。
4. 4 在不同百分含量的蔗糖培养基上, 5种苜蓿细
胞的蛋白质含量和生物量在相同培养时间和培养条
件下均有一定的变化。2%的蔗糖可以使阿尔冈金、
三德利、德宝和苜蓿王的细胞获得较高的生物量,也
可以使阿尔冈金、安格、德宝和苜蓿王细胞获得较高
的蛋白质含量。三德利和安格分别在 3%蔗糖浓度
的碳源培养基上获得最大的蛋白质含量和最大的生
物量。
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(责任编辑 刘云霞)
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