全 文 ：第２０卷　第１期
　Ｖｏｌ．２０　 Ｎｏ．１
草　地　学　报
ＡＣＴＡ　ＡＧＲＥＳＴＩＡ　ＳＩＮＩＣＡ
　　　２０１２年　 １月
　 Ｊａｎ．　　２０１２
苜蓿种质资源遗传关系的ＩＳＳＲ分析
李　红１，李　波２，赵洪波２，杨蔚然２，杨　曌１
（１．黑龙江省畜牧研究所，黑龙江 齐齐哈尔　１６１０００；
２．齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔　１６１００６）
摘要：利用ＩＳＳＲ分子标记技术研究了来自国内外的３０份苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　Ｌ．）材料的遗传多样性，为其遗传改良和
分子标记辅助育种提供依据。结果表明：１０个ＩＳＳＲ引物共扩增出１１２条带，其中５９条带是多态性谱带，多态性比
率平均值为７４．５％，平均每个引物扩增出１１．２条带。用ＰＯＰＥＧＥＮＥ　３２软件分析多态性指数和有效等位基因数
的平均值分别为０．３７２７和１．４２８０，遗传多样性水平较高。利用扩增结果进行遗传距离分析，构建了分子树状图，
可以把３０份材料划分为３个类群，第１类包括准格尔、敖汉、肇东等１９份种质材料；金达苜蓿单独划分为１类；第
３类包括和平、德宝等１０份种质材料。
关键词：苜蓿；种质资源；ＩＳＳＲ
中图分类号：Ｓ５４１．９；Ｑ９４３　　　　文献标识码：Ａ　　　　　文章编号：１００７－０４３５（２０１２）０１－００９６－０６
ＩＳＳＲ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ａｌｆａｌｆａ　Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ
ＬＩ　Ｈｏｎｇ１，ＬＩ　Ｂｏ２，ＺＨＡＯ　Ｈｏｎｇ－ｂｏ２，ＹＡＮＧ　Ｗｅｉ－ｒａｎ２，ＹＡＮＧ　Ｚｈａｏ１
（１．Ｆａｒｍｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ，Ｑｉｑｉｈａｒ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　１６１００６，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｑｉｑｉｈａｒ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｉｑｉｈａｒ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　１６１００６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ（ＩＳＳＲ）ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　３０
ｂｒｏｍｅ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ　ｃｏｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｃｈｉｎａ　ａｎｄ　ａｂｒｏａｄ．Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｉｍ－
ｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　Ｌ．）．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ａ　ｔｏｔａｌ
ｏｆ　１１２ｂａｎｄｓ　ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　１０ＩＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ，ｉｎ　ｗｈｉｃｈ　５９ｂａｎｄｓ　ｗｅｒｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ．Ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｐｅｒ－
ｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｂａｎｄｓ　ｗａｓ　７４．５％．Ｅａｃｈ　ｐｒｉｍｅｒ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　１１．２ＤＮＡ　ｂａｎｄｓ　ｏｎ　ａｖｅｒａｇｅ．Ｍｅａｎ　ｖａｌ－
ｕｅｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｉｎｄｅｘ　ａｎｄ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ａｌｅｌｅｓ　ｗｅｒｅ　０．３７２７ａｎｄ　１．４２８０ｂｙ　ＰＯＰＥＧＥＮＥ　３２ｓｏｆｔｗａｒｅ　ａｎａｌｙ－
ｓｉｓ．Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ，ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ａｎｄ　ａ　ｔｒｅｅ　ｄｉａｇｒａｍ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃ－
ｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ＳＰＳＳ　１７．０ａｌｇｏｒｉｔｈｍ．Ｔｈｅ　３０ａｌａｆａｌｆａ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ　ｗｅｒｅ　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎｔｏ　３ｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｇｒｏｕｐ
ｉｎｃｌｕｄｅｄ　Ｚｈｕｎｇｅｅｒ，Ａｏｈａｎ，Ｚｈａｏｄｏｎｇ　ａｎｄ　１９ｏｔｈｅｒ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ，ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄ　ｇｒｏｕｐ　ｉｎｃｌｕｄｅｄ　Ｊｉｎｄａ　ａｎｄ　ｔｈｅ
ｔｈｉｒｄ　ｇｒｏｕｐ　ｉｎｃｌｕｄｅｄ　Ｈｅｐｉｎｇ，Ｄｅｂａｏ　ａｎｄ　１０ｏｔｈｅｒ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｌｆａｌｆａ；Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ；ＩＳＳＲ
　　苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　Ｌ．）是世界上最重要的豆科牧
草，抗逆性强，适应范围广，能生长在多种类型的气
候、土壤环境下，其茎叶中富含蛋白质、矿物质，以及
多种维生素［１］。
苜蓿遗传资源是苜蓿育种和遗传改良的基础。
分子标记是以ＤＮＡ多态性为基础的遗传标记，已
经成为苜蓿遗传育种研究和种质资源评价的有力工
具。１９９５年傅骏骅［２］通过１７个引物的扩增谱带来
识别不同的苜蓿品种，魏臻武［４］于２００４年利用分子
标记检测苜蓿品种（系）的ＤＮＡ分子标记多态性，
构建苜蓿品种的 ＤＮＡ 指纹图谱，筛选出３６个
ＲＡＰＤ引物，８个ＳＳＲ引物和１２个ＩＳＳＲ随机引
物［２～５］。
ＩＳＳＲ为随机引物，引物长度在２０ｂｐ左右，采
用与常规ＰＣＲ相同的条件，其稳定性比ＲＡＰＤ好，
ＩＳＳＲ标记为显性标记，可以揭示整个基因组的一些
特征，符合孟德尔遗传规律，具有稳定性好，多态性
高，试验操作简单、快速、用时少等优点，因此该技术
收稿日期：２０１１－０７－２５；修回日期：２０１１－１０－１７
基金项目：“十二五”国家科技支撑项目（２０１１ＢＡＤ１７Ｂ０１）；黑龙江省重大科技攻关项目（ＧＡ０９Ｂ３０１－１）；黑龙江省科技攻关项目
（ＧＡ０９Ｂ１０９－１）资助
作者简介：李红（１９６０－），女，山东莱芜人，研究员，主要从事牧草与饲料作物育种与栽培研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｌｊｌｉｈｏｎｇ＠１６３．ｃｏｍ
第１期 李红等：苜蓿种质资源遗传关系的ＩＳＳＲ分析
被广泛用作研究种质资源遗传多样性及亲缘关系的
有效手段［６～９］。本研究采用ＩＳＳＲ分子标记技术对
３０份苜蓿遗传差异性进行分析比较，旨在鉴定苜蓿
的遗传多样性，为苜蓿新品种培育和种质资源开发
利用提供理论依据。
１　材料与方法
１．１　材料
供试材料共计３０份苜蓿种质资源，其中我国地
方品种６份，育成品种１０份，国外种质１２份，野生
材料１份，未知材料１份。３０份苜蓿材料种植于黑
龙江省畜牧研究所实验基地（表１），采集新鲜材料
的叶片置于－８０℃冰箱里保存，用于本试验指标的
测定。
１．２　方法
１．２．１　基因组ＤＮＡ的提取及检测　采用改良的
ＣＴＡＢ法［１１］提取苜蓿叶片总ＤＮＡ，用０．８％的琼脂
糖凝胶电泳检测质量，用Ｇｅｎｅ　Ｓｐｅｃ核酸检测仪检测
ＤＮＡ浓度，并将ＤＮＡ浓度稀释为１０ｎｇ·μＬ
－１。
１．２．２　扩增反应体系及程序　ＩＳＳＲ引物序列参照
加拿大哥伦比亚大学（ＵＢＣ）公布的第９套ＩＳＳＲ引
物序列，引物编号与ＵＢＣ大学公布的相同［１１］，引物
由上海生工合成，共４０条，对３０份苜蓿材料的基因
组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增。
ＩＳＳＲ扩增反应体积为２０μＬ，其中包括：１０×
ｂｕｆｆｅｒ　２．０μＬ，Ｍｇ
２＋（２．０ｍｍｏｌ·Ｌ－１）１．６μＬ，引
物（０．２ｍｍｏｌ·Ｌ－１）０．２μＬ，ｄＮＴＰ（０．４ｍｍｏｌ·Ｌ
－１）
０．８μＬ，ＤＮＡ（稀释 ２０ 倍）２．５μＬ，Ｔａｑ酶 （５
Ｕ·Ｌ－１）０．３μＬ，ｄｄＨ２Ｏ　１２．６μＬ。
表１　参试苜蓿种质材料
Ｔａｂｌｅ　１　Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａ
编号
Ｎｏ．
品种（系）
Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ（Ｓｔｒａｉｎ）
拉丁名
Ｓｐｅｃｉｅｓ　ｎａｍｅ
类型
Ｔｙｐｅ
１ 润布勒 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｖａｒｉａ　Ｍａｒｔｉｎ．‘Ｒａｍｂｌｅｒ’ 引进
２ 标准 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘Ｂｉａｏｚｈｕｎ’ 地方
３ ＦＤ２　 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘ＦＤ２’ 引进
４ 草原１号 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｖａｒｉａ　Ｍａｒｔｉｎ．‘Ｃａｏｙｕａｎ　Ｎｏ．１’ 育成
５ 草原２号 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｖａｒｉａ　Ｍａｒｔｉｎ．‘Ｃａｏｙｕａｎ　Ｎｏ．２’ 育成
６ 草原３号 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｖａｒｉａ　Ｍａｒｔｉｎ．‘Ｃａｏｙｕａｎ　Ｎｏ．３’ 育成
７ 新牧１号 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｖａｒｉａ　Ｍａｒｔｉｎ．‘Ｘｉｎｍｕ　Ｎｏ．１’ 育成
８ 新牧２号 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｖａｒｉａ　Ｍａｒｔｉｎ．‘Ｘｉｎｍｕ　Ｎｏ．２’ 育成
９ 公农１号 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘Ｇｏｎｇｎｏｎｇ　Ｎｏ．１’ 育成
１０ 公农２号 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘Ｇｏｎｇｎｏｎｇ　Ｎｏ．２’ 育成
１１ 民途 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘Ｍｉｎｔｕ’ 地方
１２ 苜蓿王 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘Ｋｉｎｇ’ 引进
１３ 准格尔 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘Ｎｅｉｍｅｎｇ　Ｚｈｕｎｇｅｅｒ’ 地方
１４ 美国苜蓿 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘Ａｍｅｒｉｃａ’ 引进
１５ 野生黄花 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｆａｌｃａｔａ　Ｌ． 野生
１６ Ｍｙａｒｉｌ杂花 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｖａｒｉａ　Ｍａｒｔｉｎ．‘Ｍｙａｒｉｌ’ 未知
１７ 敖汉 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘Ａｏｈａｎ’ 地方
１８ 肇东 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘Ｚｈａｏｄｏｎｇ’ 地方
１９ 蔚县 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘Ｙｕｘｉａｎ’ 地方
２０ 阿尔冈金 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｖａｒｉａ　Ｍａｒｔｉｎ．‘Ａｌｇｏｎｑｕｉｎ’ 引进
２１ 中苜１号 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘Ｚｈｏｎｇｍｕ　Ｎｏ．１’ 育成
２２ ＷＬ３２４　 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘ＷＬ３２４’ 引进
２３ 和平 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘Ｈｅｐｉｎｇ’ 引进
２４ 皇后 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘Ｅｍｐｒｅｓｓ’ 引进
２５ 特高（Ⅰ） Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘ＵｌｔｒａⅠ’ 育成
２６ 特高（Ⅱ） Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘ＵｌｔｒａⅡ’ 育成
２７ 俄罗斯苜蓿 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｖａｒｉａ　Ｌ．‘Ｒｕｓｓｉａ’ 引进
２８ 德宝 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘Ｄｅｒｂｙ’ 引进
２９ 赛特 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘Ｓｉｔｅｌ’ 引进
３０ 金达 Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．‘Ｊｉｎｄａ’ 引进
７９
草　地　学　报 第２０卷
　　ＰＣＲ 扩增反应程序为：９４℃预变性４ｍｉｎ，
９４℃变性１ｍｉｎ，４５～５３℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１
ｍｉｎ，４０个循环，于７２℃延伸７ｍｉｎ。４℃保存。
１．２．３　产物检测　ＰＣＲ扩增完成后，取１５μＬ扩
增产物点样于１．４％的琼脂糖凝胶上，在０．５×ＴＢＥ
缓冲液中电泳约１．５ｈ，ＵＶＰ紫外凝胶成像系统中
观察拍照。
１．２．４　数据分析　ＩＳＳＲ扩增产物以“０”，“１”，“９”
统计建立ＩＳＳＲ数据库。每个可辨带代表一个变
异，在相同迁移位置，有带记为“１”，无带记为“０”，扩
增失败或缺失记为“９”。用ＳＰＳＳ　１７．０分析软件的
Ｊａｃｃａｒｄ方法计算品种间遗传相似系数（ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｉｍ－
ｉｌａｒｉｔｙ，ＧＳ），根据Ｎｅｉ－Ｌｉ相似系数法求得品种ｉ和ｊ
之间的相似系数Ｓｉｊ＝２　Ｎｉｊ／（Ｎｉ＋Ｎｊ），其中Ｎｉ 表
示品种ｉ的条带数目，Ｎｊ 表示品种ｊ的条带数目，
Ｎｉｊ表示品种ｉ和ｊ共有的条带数目，然后用 Ｗｉｔｈ－
ｉｎ－ｇｒｏｕｐ　ｌｉｎｋａｇｅ聚类分析，建立样品间的亲缘关系
树状图；用ＰＯＰＥＧＥＮＥ　３２计算ＩＳＳＲ扩增产物的
多态性指数（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ，
ＰＩＣ），其中ＰＩＣ＝１－∑ｐｉ２，ｐｉ为产物条带的表型；
标记系统的有效等位基因数（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｍｕｍｂｅｒ　ｏｆ
ａｌｅｌｅｓ，ＮＥ），按公式ＮＥ＝１／∑ｐｉ２来计算。
２　结果与分析
２．１　ＤＮＡ扩增结果
从４０条引物中筛选出２２条能扩增出条带的引
物。由于ＩＳＳＲ引物的退火温度不同，对扩增结果
的影响也很大，本研究利用润布勒、标准、ＦＤ２、草原
１号４个材料对２２个引物进行了筛选，退火温度从
４５～５３℃，筛选出了１０条引物，得到每条引物的最
佳退火温度（表２）。用筛选的１０条引物对３０份种
质材料进行ＰＣＲ扩增，得到３０份种质的ＰＣＲ产物
图（图１）。
表２　苜蓿ＩＳＳＲ扩增反应的引物序列、退火温度、扩增条带数、多态性条带数
Ｔａｂｌｅ　２　ＩＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒ，ｐｒｉｍｅｒ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂａｎｄ　ｎｕｍｂｅｒｓ，ａｎｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｂａｎｄ　ｎｕｍｂｅｒｓ
序号 引物序列 退火温度／℃ 扩增条带数／条 多态性条带／条 多态性比率／％
Ｎｏ． Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　 Ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　 Ｎｏ．ｏｆ　ｂａｎｄｓ　 Ｎｏ．ｏｆ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｂａｎｄｓ　 Ｐｅｒｃｅｎｔ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
８２８ （ＴＧ）８Ａ ４９　 １２　 ９　 ７５
８２９ （ＴＧ）８Ｃ ４９　 １０　 ８　 ８０
８３０ （ＴＧ）８Ｇ ５０　 １８ － －
８４１ （ＧＡ）８ＹＣ　 ５２　 ９　 ７　 ７８
８４４ （ＣＴ）８ＲＣ　 ５２　 １０　 ７　 ７０
８４５ （ＣＴ）８ＲＧ　 ５１　 ７　 ５　 ７１
８５２ （ＴＣ）８ＲＡ　 ５３　 １５ － －
８５４ （ＴＣ）８ＲＧ　 ５３　 １０　 ８　 ８０
８５９ （ＴＧ）８ＲＣ　 ５３　 ９　 ６　 ６７
８６０ （ＴＧ）８ＲＡ　 ５５　 １２　 ９　 ７５
总数 Ｔｏｔａｌ　 １１２　 ５９　 ７４．５
多态性指数（ＰＩＣ） ０．３７２７
有效等位基因数（ＮＥ） １．４２８０
扩增条带分子量 ２５０～１６００ｂｐ之间
　　注：Ｙ＝Ｃ，Ｔ；Ｒ＝Ａ，Ｇ。“－”表示因加ＤＮＡ标准分子量而缺失的ＤＮＡ条带
Ｎｏｔｅ：Ｙ＝Ｃ，Ｔ；Ｒ＝Ａ，Ｇ．“－”ｍｉｓｓｉｎｇ　ｂａｎｄｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ
图１　引物８２８ＩＳＳＲ扩增图谱
Ｆｉｇ．１　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｍａｐ　ｏｆ　８２８ＩＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ
８９
第１期 李红等：苜蓿种质资源遗传关系的ＩＳＳＲ分析
　　所选用的引物对各种植材料均能扩增出特异性
条带，１０个ＩＳＳＲ引物共扩增出１１２条带，平均每个
引物扩增出１１．２条带，扩增片段大小全部在２５０～
１６００ｂｐ之间。其中引物８２８和８６０扩增的特异性
条带最多，为９条，多态性比率平均值为７４．５％，而
８３０和８５２号引物扩增出的ＤＮＡ片段没有多态性，
用ＳＰＳＳ　１７．０和ＰＯＰＧＥＮＥ　３２软件分析的结果如
表２所示。由此可见，ＩＳＳＲ分析能扩增出较多的条
带，多态性条带率较高，更能揭示不同种质材料间的
遗传多样性。多态性指数和有效等位基因数的平均
值为０．３７２７和１．４２８０。
２．２　遗传相似性系数分析
基于ＩＳＳＲ扩增所产生的１１２条扩增带，计算
每２份苜蓿材料间的遗传相似性系数（ＧＳ），获得了
３０份苜蓿的Ｊａｃｃａｒｄ相似系数矩阵（表３）。各材料
间的遗传相似性系数在０．２８～０．９３之间，其中阿尔
冈金和蔚县间的遗传相似性最大为０．９３，说明它们
在品种来源上是来自同一品系。德宝和 ＷＬ３２４间
的相似性系数最小为０．２８，说明它们在亲缘关系上
离得最远。整体来看，３０份苜蓿材料间存在着较丰
富的遗传多样性，因此，在遗传育种上应选择亲缘关
系远的品种杂交，充分利用基因型遗传差异，有利于
基因的互补性。
表３　苜蓿种质的Ｊａｃｃａｒｄ相似系数矩阵
Ｔａｂｌｅ　３　Ｊａｃｃａｒｄ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｍａｔｒｉｘ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ
１　 ２　 ３　 ４　 ５　 ６　 ７　 ８　 ９　 １０　 １１　 １２　 １３　 １４　 １５　 １６　 １７　 １８　 １９　 ２０　 ２１　 ２２　 ２３　 ２４　 ２５　 ２６　 ２７　 ２８　 ２９　 ３０
１　 １
２ ．７６　 １
３ ．７８ ．８６　 １
４ ．７８ ．７３ ．８２　 １
５ ．７９ ．７４ ．７７ ．８０　 １
６ ．７２ ．７７ ．７９ ．７１ ．８７　 １
７ ．７３ ．７５ ．７１ ．７７ ．７９ ．８９　 １
８ ．７８ ．７６ ．６９ ．７３ ．７７ ．７９ ．８６　 １
９ ．７６ ．７９ ．５４ ．３９ ．４６ ．７７ ．７４ ．７０　 １
１０ ．７８ ．７４ ．７９ ．６３ ．６９ ．７２ ．７４ ．７７ ．７２　 １
１１ ．５８ ．６４ ．７２ ．７９ ．６９ ．７１ ．７８ ．６７ ．７１ ．７８　 １
１２ ．７９ ．７７ ．７３ ．７５ ．８９ ．８３ ．６７ ．５９ ．７０ ．７２ ．７９　 １
１３ ．７６ ．７９ ．６４ ．５９ ．７０ ．７４ ．７６ ．７５ ．８２ ．６７ ．７３ ．７７　 １
１４ ．６７ ．７２ ．７８ ．７５ ．８０ ．８１ ．６８ ．７６ ．８４ ．７７ ．７９ ．７４ ．８６　 １
１５ ．７８ ．７２ ．７７ ．７４ ．７５ ．８３ ．８６ ．８１ ．７９ ．７３ ．７５ ．８３ ．６４ ．８９　 １
１６ ．７５ ．７８ ．７６ ．７４ ．７９ ．８２ ．８７ ．８９ ．７３ ．７８ ．７１ ．７０ ．７０ ．８２ ．９０　 １
１７ ．８１ ．７６ ．７９ ．７４ ．８６ ．８４ ．７９ ．７５ ．７７ ．７１ ．８３ ．８４ ．７６ ．７９ ．７４ ．８４　 １
１８ ．８１ ．７３ ．８３ ．７４ ．７０ ．６８ ．７１ ．８３ ．７８ ．７２ ．７７ ．８６ ．７１ ．７０ ．８７ ．７０ ．９１　 １
１９ ．７４ ．７３ ．７８ ．７５ ．７９ ．７３ ．６４ ．６８ ．７１ ．７０ ．８４ ．８５ ．７７ ．８６ ．８３ ．７０ ．８６ ．９０　 １
２０ ．７３ ．７７ ．７４ ．７６ ．８３ ．８５ ．７６ ．７０ ．７７ ．８２ ．８６ ．８９ ．８４ ．８５ ．７６ ．７９ ．７４ ．７２ ．９３　 １
２１ ．７３ ．７５ ．７５ ．７６ ．８３ ．７５ ．７１ ．６２ ．６８ ．７８ ．７２ ．８２ ．８４ ．８４ ．７１ ．８６ ．８５ ．８３ ．８４ ．８９　 １
２２ ．７２ ．７８ ．７５ ．７３ ．７７ ．７９ ．７４ ．７０ ．７１ ．７７ ．７３ ．８６ ．８３ ．８７ ．７０ ．７１ ．７７ ．７３ ．８２ ．８５ ．７５　 １
２３ ．６１ ．４５ ．６５ ．８６ ．８４ ．７８ ．６３ ．６５ ．７８ ．３７ ．４５ ．６８ ．８６ ．７７ ．５９ ．４３ ．６３ ．８５ ．３９ ．６６ ．７４ ．７８　 １
２４ ．７０ ．７６ ．７９ ．８１ ．８２ ．７３ ．８４ ．８２ ．７０ ．６５ ．７４ ．７８ ．８７ ．８１ ．８９ ．３７ ．４８ ．８６ ．７５ ．７７ ．７３ ．７１ ．７０　 １
２５ ．６２ ．７３ ．６５ ．６１ ．６５ ．７０ ．７７ ．７８ ．８５ ．４９ ．５０ ．７２ ．７１ ．７９ ．７６ ．８１ ．７６ ．７１ ．７２ ．８０ ．７０ ．５８ ．８５ ．７７　 １
２６ ．７３ ．７３ ．７９ ．６０ ．７４ ．３１ ．６５ ．７２ ．７５ ．７３ ．３０ ．５０ ．８４ ．８４ ．８６ ．８５ ．９０ ．７６ ．７３ ．８９ ．６７ ．８９ ．８４ ．７１ ．７５　 １
２７ ．６７ ．６０ ．７０ ．６７ ．６０ ．５４ ．６２ ．６４ ．６３ ．５８ ．６８ ．６７ ．７１ ．７７ ．８３ ．７７ ．７３ ．７０ ．６４ ．７７ ．７６ ．６７ ．７９ ．８３ ．５４ ．７９　 １
２８ ．４１ ．３９ ．５１ ．４４ ．３７ ．３０ ．３８ ．３６ ．４６ ．４３ ．４１ ．３８ ．３１ ．３６ ．４３ ．４１ ．４１ ．３８ ．４５ ．３９ ．４０ ．２８ ．３９ ．３６ ．３８ ．４０ ．３９　 １
２９ ．４０ ．５４ ．４９ ．４７ ．５３ ．４８ ．５２ ．４０ ．５７ ．３８ ．５２ ．３８ ．４２ ．４３ ．４２ ．４４ ．４７ ．４０ ．３８ ．４８ ．４３ ．３４ ．３３ ．５７ ．５０ ．４４ ．５２ ．３９　 １
３０ ．４３ ．３６ ．４７ ．４５ ．４７ ．４６ ．４８ ．４７ ．４６ ．４１ ．４２ ．４０ ．４２ ．４２ ．４０ ．４３ ．５８ ．４４ ．５６ ．４５ ．４２ ．４３ ．４１ ．２９ ．５０ ．３２ ．２９ ．５０ ．５２　１
　　注：因页面排版，故省去了表格内容中小数点前的“０”
Ｎｏｔｅ：Ｆｏｒ　ｐａｇｅ　ｌａｙｏｕｔ，ｄａｔａ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔａｂｌｅ　ｗｅｒｅ　ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ“０”ｂｅｆｏｒｅ　ｄｅｃｉｍａｌ　ｐｏｉｎｔ
２．３　ＩＳＳＲ聚类分析
根据遗传相似性系数，利用ＳＰＳＳ　１７．０软件进
行聚类分析，结果如图３所示。当取不同阈值时聚
成不同类，若取２０时，３０份苜蓿可以明显的划分为
３大类，第１类共１９份材料，包括润布勒、标准、
ＦＤ２、草原１号、草原２号、草原３号、新牧１号、新牧
２号、公农１号、公农２号、民途、苜蓿王、准格尔、美
国苜蓿、野生黄花、Ｍｙａｒｉｌｅ杂花、敖汉、肇东和赛特
９９
草　地　学　报 第２０卷
（这１９份材料又可以分为３类，公农２号、民途、苜
蓿王、准格尔、美国苜蓿、野生黄花、ｍｙａｒｉｌｅ杂花、敖
汉、肇东这９个品种为１类，说明它们的亲缘关系最
近；润布勒、ＦＤ２、标准划为１类；草原１号、草原２
号、草原３号、新牧１号、新牧２号、公农１号为１
类）；金达苜蓿单独划分为第２类；第３类包括１０个
品种：蔚县、阿尔冈金、中苜１号、ＷＬ３２４、和平、皇
后、特高（Ⅰ）、特高（Ⅱ）、俄罗斯和德宝。聚类划分
突出了３０分苜蓿材料间的差异性，由此可见，ＩＳＳＲ
可用于苜蓿遗传多样性和聚类分析的研究。
图２　苜蓿种质资源的聚类分析树状图
Ｆｉｇ．２　Ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ　ｏｆ　３０ａｌｆａｌｆａ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ
３　讨论
分子标记从ＤＮＡ水平揭示品种间的差异性和
相关性［１２］，本研究采用ＩＳＳＲ分子标记和聚类分析
方法，对３０份苜蓿的遗传多样性进行了分析，根据
判定的苜蓿品种亲缘关系，反映出我国苜蓿地方品
种间的遗传关系以及国外引进品种与我国地方品种
的遗传距离。聚类结果表明，国内品种包括标准、敖
汉、肇东等，这些国内品种亲缘关系较近，都聚为一
大类，但彼此之间又可以划分为３类，说明中国地方
品种之间产生了较大的差异，我国苜蓿地方品种遗
传基础广阔，表现出较强的地域性。民途和美国苜
蓿亲缘关系较近，公农２号和苜蓿王亲缘关系也较
近，说明这些国内品种是从国外品种选育而来。和
平、蔚县、中苜１号这些国内品种和其他国外品种，
如阿尔冈金、ＷＬ３２４、皇后、特高（Ⅰ）、特高（Ⅱ）、俄
罗斯和德宝划分为第３类。在这些国外品种中，赛
特和德宝间的遗传距离最小，是因为二者均引自荷
兰，遗传变异较小，同样，ＷＬ３２４和皇后苜蓿均引自
美国，所以其遗传距离较小，遗传变异也较小。孙其
信［１０］在研究小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ）遗传多样性
时也得到了相似的结论，即来自不同地区的品种（品
系），大部分可按地理来源分为一类。
植物杂种优势的产生在一定程度上取决于亲本
间的遗传差异，遗传差异大说明其亲缘关系较远，杂
交后代的杂种优势较大［１３］。从ＤＮＡ分子水平上，
查明亲本及其杂种间的遗传差异大小，对选配亲本
杂交组合及其杂种优势利用评价有重要的理论指导
价值。本研究中单独划分一类的金达苜蓿在遗传距
离上和绝大多数的国内品种较接近，而和其他国外
品种遗传距离较远，因此用它与其他国外品种杂交
可能会产生较大的杂种优势。俄罗斯品种与其他品
种间的遗传距离也较远，这可能与其引自俄罗斯有
关。因此，俄罗斯与其他品种之间杂交，也可能会产
生较大的杂种优势。ＩＳＳＲ可以较好地确定苜蓿种
质资源的遗传多样性和亲缘关系，能够为杂交育种
亲本选择组配提供有价值的分子水平上的信息。
本研究采用ＩＳＳＲ标记，揭示基因组中随机基
因位点的多态性，以便研究苜蓿各品种间的亲缘关
系，由于反应体系很小，所以对试验精确程度的要求
很高，对各成分浓度要求十分严格［１４，１５］。试验操作
中，在各模板浓度一致的前提下，各反应成分的混合
００１
第１期 李红等：苜蓿种质资源遗传关系的ＩＳＳＲ分析
成为关键。在初步接触ＩＳＳＲ技术时，需反复摸索
反应条件和确定反应体系，但随着对该项技术的熟
练掌握和对试验条件的严格控制，ＩＳＳＲ技术能够获
得较好的重复结果。
４　结论
４．１　本试验筛选出１０条ＩＳＳＲ引物并对其退火温
度进行了筛选，在该体系基础上找到了最适宜的退
火温度。运用１０个引物在３０个材料间共扩增出
１１２条带，其中多态性条带５９条，多态位点百分率
为７４．５％，说明绝大多数位点产生了变异。
４．２　通过聚类分析，揭示了３０个苜蓿种质的亲缘
关系，可划分为３大类，第１类包括润布勒、标准、
ＦＤ２、草原１号、草原２号、草原３号、新牧１号、新牧
２号、公农１号、公农２号、民途、苜蓿王、准格尔、美
国苜蓿、野生黄花、ｍｙａｒｉｌｅ杂花、敖汉、肇东和赛特
共１９个；金达苜蓿单独划分为第２类；第３类包括
蔚县、阿尔冈金、中苜１号、ＷＬ３２４、和平、皇后苜
蓿、特高（Ⅰ）、特高（Ⅱ）、俄罗斯和德宝共１０个。
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（责任编辑　李美娟）
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