全 文 ：第 15 卷 第 6 期
Vol. 15 No. 6
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2007 年 11 月
Nov. 2007
文章编号: 1007-0435( 2007) 06-0577-05
结缕草属植物种间关系的等位酶研究
周志芳1, 2, 宣继萍2 , 刘建秀2*
( 1. 南京农业大学园艺学院, 南京 210095; 2. 江苏省中科院植物研究所, 南京 210014)
摘要: 分析结缕草属( Zoy s ia Willd. ) 9 种 1 变种共 59 份种源的苹果酸脱氢酶 ( M DH ) , 酯酶 ( EST )及过氧化物酶
( POD)三种等位酶特征,研究其种间亲缘关系,结果表明: ¹ 种内遗传分化大小依次为:沟叶结缕草( Z. matrella
( L . ) Merr . ) > 结缕草(Z. j aponica Steud. ) > 中华结缕草( Z. sinica Hance) > 朝鲜结缕草 (Z. kor eana Mez) ; º
聚类结果显示:结缕草、中华结缕草、长花结缕草 (Z. sinica var. nip p onica Ohw i)、大穗结缕草( Z. macros tachya
Franch. )聚为一类;沟叶结缕草、细叶结缕草(Z. tenuif olia Willd. ex T r in. )先聚为一类, 然后小结缕草( Z. mini-
ma Zoto v)、太平洋结缕草( Z. pacif ica H ot ta ex Kuroki)、大花结缕草(Z. macrantha Desvaux)也聚到这一类; 而朝
鲜结缕草自成一类, 聚类结果与外部性状特征和地理分布位置相统一; » 结缕草属植物为开放式的外繁育系统,
种内各种源间遗传变异大于种间变异。
关键词: 结缕草属; 种间关系; 等位酶
中图分类号: S812 文献类型: A
Isozyme Study on Interspecies Genetic Relationship of Zoysia Willd.
ZHOU Zh-i fang1, 2 , XUAN J-i ping 2 , LIU Jian-x iu2*
( 1. College of H ort icultur e, Nanjin g Agricultural University, Nanjing, Jiangsu Province 210095, China;
2. Zhongshan Arb oretum, Inst itute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of S ciences, Nanjin g, Jiangsu Province 210014, Chin a)
Abstract: T he char acterist ics of three isozyme systems ( MDH , EST , POD) w ere invest igated for 59 acces-
sions o f Zoy sia Willd. belong ing to 9 species and 1 variety to study the genet ic r elat ionship of them. The
results show as fo llow s: the genet ic diversity w as r anked as: Z. matr el la ( L . ) Merr. > Z. j ap onica Steud.
> Z. sinica Hance> Z. kor eana Mez; Z. j aponica, Z. sinica, Z. sinica var. nip ponia Ohw i, and Z. mac-
r ostachya Franch. w ere clustered together; Z. matrella, Z. tenui f ol ia Willd. ex T rin. w ere clustered to
a g roup, then Z. minima Zotov , Z. pacif ica Hotta ex Kuroki, and Z. macrantha Desvaux w ere also clus-
tered to this g roup; Z. koreana was clustered to be a g roup by itself , the clustering result w as consistent
w ith the mo rpholo gical characters and the geography dist ribut ion; Zoy sia Willd. po ssesses the open breed-
ing sy stem, and the int raspecies g enetic div er sity w as higher than interspecies.
Key words: Zoy sia Willd. ; Genetic relat ionship; Iso zyme
结缕草属植物( Zoy sia Willd. )隶属于禾本科
( Gramineae)虎耳草亚科( Chlorido ideae)结缕草族
( Zoy siae) , 为多年生低矮草本, 主要分布于亚洲, 在
非洲和澳洲等温暖地区亦有分布。由于结缕草属植
物既能进行种子繁殖,又能利用匍匐茎、根状茎进行
营养繁殖[ 1] ,并且种间杂交可育,所以形态上存在很
多过渡类型, 对结缕草属植物种的划分比较困难。
结缕草属植物的种间变异广泛, 资源丰富。研究种
间关系可以很好地评价结缕草属种质资源,利用一
些野生资源的优良性状指导杂交育种。
等位酶酶谱的表现差异间接反映了基因型的差
异, 为植物的分类及亲缘关系的研究提供依据。通
过等位酶这种生化标记的差异来研究结缕草属植
物种间亲缘关系的报道较少。翁仁宪 [ 2]用 202 个样
品的结缕草为材料,检验其酯酶同工酶谱。根据计
算的各族群距离发现, 中华结缕草( Z. sinica Hance)
收稿日期: 2006-12-14; 修回日期: 2007-07-28
基金项目: 国家自然基金项目( 30371011)资助
作者简介: 周志芳( 1982-) ,女,硕士研究生,研究方向为草坪草资源多样性, E-mail: zhouzh ifang1982@ 126. com; * 通讯作者 Author for
correspondence, E-m ail: turfunit@ yahoo. com. cn
草 地 学 报 第 15卷
和沟叶结缕草( Z. matrella ( L. ) Merr. )间的距离最
近;细叶结缕草( Z. tenuif ol ia Willd. ex Trin . )和结
缕草( Z. j aponica Steud. )距离最远。但是其所用的
酶位点少,并且所研究的材料也仅限于结缕草属的其
中几个种,每个种所选择的种源数较少。
本研究利用了苹果酸脱氢酶 ( MDH )、酯酶
( EST)以及过氧化物酶( POD) 3 种等位酶系统 13
个位点的遗传变异, 对结缕草属 9种 1变种共 59份
种源的亲缘关系做研究, 为结缕草属植物的利用和
改良提供实验依据。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
共收集结缕草属 9种 1变种 59份种源。
材料种植情况:结缕草、中华结缕草、长花结缕
草( Z. sinica var . nip ponica Ohw i)、沟叶结缕草、
大穗结缕草( Z. macrostachya Franch. )、细叶结缕
草几个种的材料为江苏省中科院植物研究所草业研
究中心所收集的野生的代表性种源,由匍匐茎移栽
而成;朝鲜结缕草( Z. koreana Mez)为/百绿集团0
提供的种子,种植于资源圃保存, 每份材料面积为 1
m
2。大花结缕草( Z. macr antha Desvaux )、小结缕
草( Z. minima Zotov)和太平洋结缕草( Z. pacif i-
ca Hotta ex Kur oki)的材料来自美国,以种子保存。
2004年,从资源圃保存材料中统一取草皮块, 种植
于直径为 30 cm,高度为 35 cm 的花盆中; 同时大花
结缕草、小结缕草和太平洋结缕草的种子播种于同
样花盆中。每个种源种植于一个盆中, 培养至盖度
为 100%。
1. 2 酶液提取
2005年 10月,材料接近枯黄期, 每个花盆内的
多个单株进行混合取样, 每份材料取健康幼嫩叶片
0. 5g ,提取酶液,冰箱中保存备用。
1. 3 电泳
采用垂直板不连续聚丙烯酰胺凝胶法。过氧化
物酶和苹果酸脱氢酶的分离胶和浓缩胶的浓度分别
为 7% 和 4%, 酯酶的分离胶和浓缩胶的浓度为
10%和 3%。上样量为 20~ 25LL/孔, 制胶具体操
作参照何忠效[ 3] 等提出的方法进行。
1. 4 染色 [ 3]
MDH 染色液配方为: 0. 2% NBT : 0. 2% PM S:
0. 01 mo l/ L NAD: 1 mol/ L dl-苹果酸 ( pH7. 0) :
0. 05 mol/ L Tr is-HCl, pH7. 0缓冲液= 5 B 1B 3 B
4B37。EST 染色液配制:称取›-醋酸萘酯 200 mg,
坚牢蓝 200 mg, 分别以少量丙酮溶解, 倒入 200 mL
磷酸缓冲液( 0. 1 mol/ L, pH6. 4)。胶板放入染色液
中 37 e 染色 15 min。POD染色采用联苯胺法。染液
配方为:苯胺: 4% NH4 C1: 5% EDTA : 0. 3% H2O 2 :
双蒸水= 1B1B1B1B8,室温下染色。
1. 5 酶带的记录
对所得酶谱作遗传学解释, 区分位点和等位基
因,并进行记录。按照王中仁[ 4]的基因构成记录法。
1. 6 遗传学计算
数据分析用 POPGENE 软件, 计算以下参
数[ 4 ] : ¹每个种的多态位点数( K) , 即最常见的等位
基因出现的频率小于或等于 0. 99的位点的数目; º
每个种的多态位点的百分数( P ) , 即多态位点所占
的比率; »预期杂合度 ( He) , 即按哈迪- 温伯格定
律预测计算的杂合度; ¼实际杂合度( Ho) , 即取材
群体中实际存在的杂合个体的比率; ½ 固定指数
( F ) ,即内繁育系数的平均值; ¾香农指数( Shannon
index) :检测某个种的遗传分化程度; ¿个体相对于
种的固定指数 ( FIS ) , 个体相对于属的固定指数
( F IT ) , 杂合性基因多样度的比例( F ST ) ; À遗传距离
( D) ; Á遗传一致度( I)。
2 结果与分析
结缕草属植物 MDH 共出现 9 条带, 分成 3个
位点,多态性位点是 3 个(图 1)。EST 酶谱中最多
的个体有 11条带,分成 5 个位点, 多态位点为 3个
(图 2)。POD酶谱最多的个体有 14条带,分成 5个
位点, 多态位点为 5个(图 3)。三种酶系统在种间
或种内均存在多样性。在结缕草属植物中, MDH
的多态性小于 POD以及 EST。沟叶结缕草( 47~ 50
号) ,结缕草( 1~ 25号)、中华结缕草( 26~ 39号)几个
种的个体间存在较大的变异。朝鲜结缕草( 41~ 46
号)个体间变异很小,其中朝鲜结缕草的 MDH, EST
两种酶个体间都没有出现差异。
根据多态位点数、多态位点百分率、预期杂合度、
实际杂合度、香农指数等指标,其种内遗传分化大小
依次为:沟叶结缕草> 结缕草> 中华结缕草> 朝鲜结
缕草(表 2,表中后六个种种质数太少,不参与比较)。
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第 6期 周志芳等:结缕草属植物种间关系的等位酶研究
表 1 材料及种质来源
Table1 Mater ials and sour ce
序号
No.
种 Species 种质编号
Acces sion
来源地
Source
备注
Note
1 结缕草 Z003 福建厦门 Xiamen, Fu jian province
2 Z. j ap onica Steud. Z011 浙江兰溪 Lan xi, Zhejiang pr ovin ce
3 Z016 无锡鼋头渚 Yuan touzhu, Wuxi
4 Z017 山东胶州 Jiaozhou, Shandong province
5 Z020 山东胶州市郊 Jiaozhou subu rb, S handong p rovin ce
6 Z026 山东章丘县 Zh angqiu coun ty, Sh andong province
7 Z030 江苏连云港 Lian yungang, J iangsu provin ce
8 Z037 安徽芜湖 Wuhu, Anhui province
9 Z040 安徽宁国 Ningguo, Anhui province
10 Z042 安徽屯溪平原 Tunxi plain, Anhui province
11 Z045 安徽滁县 Chux ian, Anhu i province
12 Z052 江苏句容 Jur ong, Jiangsu pr ovince
13 Z053 江苏苏州郊区 Suzhou suburb, Jiangsu province
14 Z054 南京江宁 Jiangning count ry, Nanjing
15 Z056 江苏东海机场 Donghai air port, Jiangsu province
16 Z057 江苏连云港 Lian yungang, J iangsu provin ce
17 Z061 南京紫金山 Zi jinshan, Nan jing
18 Z073 日本爱知县 Aichi prefecture, J apan
19 Z101 河南信阳 Xin yang, H enan province
20 Z104 安徽金寨 Jinzhai, Anhui p rovin ce
21 Z108 辽宁大连 Dalian, Liaoning province
22 Z111 辽宁瓦房店 Wafangdian, Liaonin g province
23 Z112 辽宁鞍山 Ansh an, Liaoning provin ce
24 Z121 湖南长沙 Changsha, Hunan province
25 Z132 浙江兰溪 Lan xi, Zhejiang pr ovin ce
原始地理分布: 中国、日
本、朝鲜。种源数: 25
26 中华结缕草 Z001 福州市乌龙江畔 Wulon g riverside, Fujian province
27 Z. sini ca H ance Z002 福建福州 Fuzhou, Fujian province
28 Z005 浙江金华郊区 Jinh ua sub urb, Zh ejiang provin ce
29 Z018 山东胶州市郊 Jiaozhou subu rb, S handong p rovin ce
30 Z021 山东胶州湾 Kiaochow bay, S handong p rovin ce
31 Z036 安徽合肥 H efei, Anhui province
32 Z039 安徽宁国 Ningguo, Anhui province
33 Z050 江苏句容市郊 Jurong sub urb, Jiangsu province
34 Z060 安徽岳西大别山 Dabie sh an, yuexi, Anhui province
35 Z063 安徽屯溪平原 Tunxi plain, Anhui province
36 Z068 安徽南陵县郊 Nan ling subur b, Anhui province
37 Z107 山东烟台 Yantai, Shandong province
38 Z116 山东枣庄 Zaozhu ang, Shandong province
39 Z119 江苏响水县 Xiangshui County, Jiangsu p rovin ce
原始地理分布: 中国、日
本、朝鲜。种源数: 14
40 大穗结缕草 Z010 浙江舟山 Zhoushan, Zh ejiang province
41 Z. macr ostachy a Franch . Z130 江苏连云港 Lian yungang, J iangsu provin ce
原始地理分布: 中国、日
本、朝鲜。种源数: 2
42 沟叶结缕草 Z014 浙江杭州 H angzhou, Zhejian g pr ovin ce
43 Z. mat re lla ( L. ) Merr. Z075 中国台湾 Taiw an, Ch ina
44 Z095 中国台湾 Taiw an, Ch ina
45 Z123 美国引进 Int roduced f rom America
原始地理分布:日本南部、
朝鲜半岛、中国南部、大洋
州热带地区、太平洋沿岸
的热带地区。种源数: 4
46 细叶结缕草 Z160 重庆 Chongqing
47 Z. t enui f ol ia Willd. ex T rin. Z161 南京江浦基地 Jiangpu base, Nan jing
原始地理分布:日本南部、
朝鲜半岛、中国南部、东南
亚。种源数: 2
48
长花结缕草
Z. sinica var. nippon ica Ohw i
Z122 江苏射阳 Sheyan g, Jiangsu p rovin ce 原始地理分布: 中国、日本、朝鲜。种源数: 1
49 朝鲜结缕草 Z. koreana Mez Z153 朝鲜引进 Int roduced f rom Korea
50 Z155 朝鲜引进 Int roduced f rom Korea
51 Z156 朝鲜引进 Int roduced f rom Korea
52 Z157 朝鲜引进 Int roduced f rom Korea
53 Z158 朝鲜引进 Int roduced f rom Korea
54 Z159 朝鲜引进 Int roduced f rom Korea
原始地理分布:朝鲜半岛。
种源数: 6
55 小结缕草 Z. minima Zotov 5185 美国引进 Int roduced f rom America 原始地理分布: 新西兰。种源数: 1
56 大花结缕草 5193 美国引进 Int roduced f rom America
57 Z. macr an tha Desvaux 5310 美国引进 Int roduced f rom America
58 5190 美国引进 Int roduced f rom America
原始地理分布: 澳大利亚
南部。种源数: 3
59
太平洋结缕草
Z. p aci f i ca Hot ta ex Kur ok i
5195 美国引进 Int roduced f rom America 原始地理分布: 太平洋沿岸热带地区。种源数: 1
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草 地 学 报 第 15卷
固定指数 F 值可在+ 1和- 1之间波动。如果
近亲繁殖或自交, 则纯合体多, F 大于 0; 反之如异
交较多,则 F 值为负数。结缕草属植物几个种的 F
值均为负数,说明异交较多(表 2)。
杂合性基因多样性比率 FST为 0. 1764, 表明结
缕草属遗传变异更多存在于种内,即种内不同种源
间的遗传分化大于不同种间的遗传差异(表 3)。
聚类结果表明: 结缕草、中华结缕草、长花结
缕草、大穗结缕草聚为一类; 沟叶结缕草、细叶结
缕草先聚为一类, 然后小结缕草、太平洋结缕草、
大花结缕草也聚到这一类; 而朝鲜结缕草自成一
类(图 4)。
表 2 结缕草属种内遗传分化程度
T able 2 H eredity diversit y deg ree w ithin species o f Zoy sia Willd.
种名
species
多态位点数
K
多态位点百分率
P
预期杂合度
H e
实际杂合度
H o
固定指数
F
香农指数
Shannon index
沟叶结缕草 Z. matre l la 11 84. 62% 0. 4231 0. 6538 - 0. 5912 0. 5281
结缕草 Z. j ap onica 11 84. 62% 0. 3293 0. 5301 - 0. 3824 0. 4677
中华结缕草 Z. sini ca 10 76. 92% 0. 3291 0. 5202 - 0. 4325 0. 4553
朝鲜结缕草 Z. koreana 7 53. 85% 0. 2822 0. 3889 - 0. 1667 0. 3618
大花结缕草 Z. mac rantha 9 69. 23% 0. 4444 0. 7222 - 0. 5769 0. 5151
细叶结缕草 Z. tenui f ol ia 9 69. 23% 0. 4872 0. 6923 - 0. 6667 0. 5131
大穗结缕草 Z. mac rostach ya 9 69. 23% 0. 4231 0. 5769 - 0. 5385 0. 4497
小结缕草 Z. minima 9 69. 23% 0. 7500 0. 7500 - 0. 6154 0. 5199
太平洋结缕草 Z. p aci f ica 9 69. 23% 0. 6923 0. 6923 - 0. 6923 0. 4799
长花结缕草 Z. sini ca var. nipponica 8 61. 54% 0. 6154 0. 6154 - 0. 6154 0. 4266
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第 6期 周志芳等:结缕草属植物种间关系的等位酶研究
表 3 结缕草属植物遗传多样性统计量
Table 3 Statistics of g enet ic diversit y of Zoy sia Willd.
个体相对于
种的固定
指数 F IS
个体相对于
属的固定
指数 F IT
杂合性基因
多样性
比率 FST
- 0. 7774 - 0. 4638 0. 1764
图 4 结缕草属植物各种聚类图
F ig. 4 Species dendrog ram of Zoy sia Willd.
3 讨论与结论
3. 1 中华结缕草、结缕草等几个种由于地理分布范
围较广,选择较多的种源以便更好地代表其种内变
异,而小结缕草等地理分布范围较狭窄,所选择的种
源亦较少。
3. 2 对各个种的种内遗传分化大小进行比较,发现
沟叶结缕草> 结缕草> 中华结缕草> 朝鲜结缕草,
其他几个种由于材料较少, 分析的种内变异大小不
具有代表性,其结果不做考虑。根据实验材料的采
集来源信息:沟叶结缕草的 4 份材料分别来源于浙
江杭州、中国台湾, 还有一份为美国引进, 来源较分
散,各种源为适应不同的生境,变异较大。结缕草采
集于中国的福建、浙江、江苏、山东、安徽、河南、辽
宁、湖南几个省的野生环境,另有一份种源来自日本
爱知县; 中华结缕草来源于福建、浙江、山东、安徽、
江苏等省的野生环境。这两个种的采集地点纬度跨
度大, 资源遗传变异亦较广泛。两者的采集地点有
一定的重叠,种内变异的程度较接近。朝鲜结缕草
的原始地理分布范围较狭窄, 种内变异较小。
3. 3 根据固定指数的计算结果,结缕草属植物几个
种的 F 值均为负数, 说明异交较多。根据郭海林对
结缕草属四个种植物开花习性的观察, 其自交结实
率为 0~ 54% ,平均为 16. 15%, 说明结缕草属植物
自交结实率较低 [ 5]。另外据一些报道 [ 6, 7] ,结缕草属
植物不同种间杂交可育。结缕草属植物各个种之间
异交较多,是一种外繁育系统。本实验的结果与这
些报道一致。
3. 4 结缕草属的这种开放式的外繁育系统,使得种
内变异较大, Anderson [ 8] 发现结缕草属植物形态上
存在渐变群,一些种源的形态特征位于两个种之间,
通过核 DNA 的 RFLP 分析证实了结缕草和太平洋
结缕草之间、结缕草和大穗结缕草之间、沟叶结缕草
和中华结缕草之间存在杂交。结缕草属植物种内各
种源间的变异大于不同种间的遗传变异正是由于结
缕草属植物的这种外繁育系统所致。
3. 5 根据聚类分析的结果发现: 结缕草、中华结缕
草、长花结缕草、大穗结缕草聚为一类;沟叶结缕草、
细叶结缕草先聚为一类,然后小结缕草、太平洋结缕
草、大花结缕草也聚到这一类;而朝鲜结缕草自成一
类。聚为一类的草种亲缘关系较近,反之较远。结
合地理分布分析发现, 结缕草、中华结缕草、长花结
缕草、大穗结缕草大都分布于中国、日本、朝鲜等东
亚地区;而大花结缕草、小结缕草、太平洋结缕草大
多分布于澳大利亚,新西兰等地,原始地理分布相近
的草种由于基因流等原因, 之间的遗传一致度较大。
另外,外部形态特征显示,结缕草、中华结缕草、长花
结缕草、大穗结缕草多为叶片较宽且粗糙,植株较高
大的草种,而沟叶结缕草、细叶结缕草、小结缕草、太
平洋结缕草都为较细小的草种。本实验的聚类结果
与外部性状特征和地理分布位置相统一, 揭示出结
缕草属植物的种间亲缘关系,有利于以后结缕草育
种工作的发展。
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(责任编辑 张蕴薇)
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