全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2007) 03-0278-05
PCR方法筛选布氏田鼠小片断插入微卫星文库
王 登, 施大钊*
(中国农业大学, 北京 100094)
摘要: 为了研究布氏田鼠( L as iop odomy s brand tii)不同地理种群的遗传差异,克隆其微卫星位点。将布氏田鼠基因
组DNA 用限制性内切酶消化后的小片段与 Pbluescript SK ( + )连接,用含有CT 重复序列的寡聚核苷酸和质粒上
的T3 序列作为引物进行PCR扩增, 筛选阳性克隆, 对质粒上插入位置和片段大小合适的外源DNA 序列进行测序。
共获得116 个阳性克隆, 测序结果显示37 个包含布氏田鼠微卫星DNA 序列, 28个具完整的侧翼序列。
关键词: 布氏田鼠; 小片断插入文库; PCR 筛选
中图分类号: S 812. 6 文献标识码: A
Screening of Small-insert Genomic DNA Libraries for Brandt’s voles by PCR
WANG Deng , SHI Da-zhao
*
( Chin a Agricu ltural Univer sity, Beijing 100094, China)
Abstract: In order to assess the genet ic diversity of the differ ent geogr aphical populations of Brandt’s v oles
( L asiop odomy s br andt ii ) , w e iso lated the polymorphic m icrosatellite loci and const ructed small-insert
genomic DNA libraries for Brandt’s vo les. Genome DNA was dig ested w ith Sau3AI to produce 100-750 bp
fr agments, then ligated into the BamHI site of pBluescript KS( + ) and pr imer s T 3 and ( CT) 7were used for
PCR amplif icat ion. Posit ive colonies w er e screened and plasmids w ere sequenced. A total of 116 posit ive
co lonies w ere obtained, the sequence testing indicated that 37 of those colonies contained a micr osatellite
inser t and 28 contained full f lanking sequence.
Key words : L asiop odomy s brandtii ; Small-insert g enom ic DNA libraries; PCR screen
布氏田鼠( L asiop odomy s brandtii )是典型草原
害鼠,分布于俄罗斯外贝加尔、蒙古国中部以及我国
内蒙古[ 1]。对其种群结构的差异、交配系统、亲本分
析及不同社群间相互关系的了解可以为阐明种群的
发展动态,进而制定合理的管理方案奠定良好的基
础。传统的宏观生态学为这些目的提供了一定的方
法[ 2～ 6] ,但这些方法需要大量的实践经验,同时需花
费大量的时间进行跟踪观察,其客观性、便捷性和重
复性都受到一定的限制。现代分子生物学技术在生
态研究特别是在种群生态研究中的应用, 为种群的
研究提供了客观性好、重复性强的各种分子标记手
段。在研究种群问题时,不同的分子标记手段优劣各
异, 综合考虑RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SNP 等技
术在同一种动物种群遗传差异研究中的优劣[ 7～15] ,
微卫星目前仍被看作是进行大规模野外种群分子标
记研究的首选方法。
微卫星应用的核心问题是多态性位点的获得,
其基本途径有两条, 一是从基因文库中克隆筛选, 另
一个途径是借助于近缘关系的异种引物扩增微卫星
位点[ 16 ]。微卫星位点在紧密相关的物种间具有位置
保守性,但在多大程度上具有保守性,这种保守性在
不同的目、科和属间是否存在差异,这些保守位点在
不同的目、科和属间的多态性是否一致有待进一步
研究。Dayanandan 等[ 17]实验得出植物微卫星引物
序列的保守性只存在于同族不同属间。动物间跨种
使用的近缘程度以及获得的位点的多态性在扩大的
收稿日期: 2006-11-21; 修回日期: 2007-01-26
基金项目:国家自然科学基金( 30571229)、农业部专项资金( 2005BA 529A 05)
作者简介: 王登 ( 1976-) , 男,博士研究生,研究方向为啮齿动物种群遗传, E-mail: w . deng2001@ 163. com; * 通讯作者 Author for
corresponden ce, E-mail : s hidazhao@ cau. edu . cn
第15卷 第 3期
Vo l. 15 No . 3
草 地 学 报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
2007 年 5 月
May 2007
样本中的稳定性也未见报道。对布氏田鼠同属的其
他种的数据库搜索结果表明,同属种微卫星位点的
开发未见报道,不同科的常见鼠微卫星引物对布氏
田鼠基因组扩增结果显示,其多态性与特异性效率
都非常低,故利用建立布氏田鼠部分基因文库的方
法获得其多态性微卫星位点。
1 材料与方法
1. 1 布氏田鼠部分基因组小片断文库的构建
1. 1. 1 布氏田鼠基因组的酶切回收 布氏田鼠部
分基因组小片断文库的构建参考 Elaine et al . 方
案[ 18 ] ,取布氏田鼠肌肉组织,按照《分子克隆实验指
南》(第二版) [ 19]的方法用酚仿法提取基因组DNA。
用2个单位的Sau3AI 酶按1×, 3×, 9×, 27×, 81×
的稀释梯度酶切约10 g DNA 20 m in后检测, 取最
适浓度的酶酶切10 g DNA 30 min,酚仿抽提后溶
于20 L TE, 用0. 8%的低熔点琼脂糖电泳,纯化回
收100～250 bp和250～750 bp 的DNA 片段。
1. 1. 2 回收片断的连接转化 将回收的片段与用
BamHI内切酶酶切纯化的Pbluescript SK( + )质粒
连接后,用DH-5E. coli 感受态细胞进行转化培养。
然后涂布于20个含100 L/ mL X-gal和100 L/ mL
氨苄的LB 培养基上, 于37℃过夜培养。挑出2000个
阳性菌落(白斑)接种于含50 L/ mL 氨苄的LB培养
基的培养皿上按顺序编号, 37℃过夜培养, 4℃保存。
1. 2 微卫星位点的PCR方法筛选
1. 2. 1 引物 PCR条件的优化 参考Gussow and
Clackson( 1989)
[ 20] 的方法, 设计合成引物 T3: 5′-
AT TAACCCTCACTAAAGGGA-3′和 STR: 5′-
CTCT CT CTCT CTCT -3′。提取 500个阳性菌质粒
混合物作模板,混合约20 ng 质粒, 1×PCR buf fer,
0. 4 M 的引物, 1. 0～4. 0 mM (梯次增加0. 5 mM )
的 7个浓度MgCl2, 各 0. 2 mM 的dN TP, 0. 5 U 的
Taq 酶( M BI ) , 加灭菌去离子水至 20 L, 按 94℃
5 min, 94℃ 40 s, 40～55℃ 40 s, 72℃ 40 s, 72℃
10 min, 35个循环的程序于PTC200梯度PCR 仪上
扩增, 得到该对引物的最适扩增条件。
1. 2. 2 含微卫星序列阳性克隆的挑选 将所挑的阳
性菌13个一组接种于培养基上,于37℃过夜培养,用
0. 85%的灭菌NaCl溶液收集菌体后,提取质粒。配制
成20 L 体系,取约20 ng 质粒, 1×PCR buffer, 0. 4
M 的引物, 3. 0 mM 的MgCl 2,各0. 2 mM 的dNTP,
0. 5 U 的MBI T aq酶, 加灭菌去离子水至20 L,按
94℃ 5 min, 94℃ 40 s, 50. 9℃ 40 s 72℃ 40 s,
72℃ 10 m in, 35个循环的程序于AB9700 PCR仪上
扩增,挑出含阳性产物的组,提单菌质粒,再按上述条
件扩增, 挑出阳性克隆菌,测序(上海生物工程服务有
限公司)后, 得到含布氏田鼠微卫星位点的DNA 序列。
2 结果与分析
2. 1 布氏田鼠部分基因组小片断文库的构建
文库构建中布氏田鼠DNA的Sau3AI梯度酶切
检测, BamHI 内切酶酶切纯化的 Pbluescript SK
( + )质粒检测和基因组酶切回收后片断大小检测
1%琼脂糖凝胶电泳,从所建的小片断基因文库中共
挑出 2000 个含插入片断的克隆, 其中, 含 100～
250 bp和250～750 bp片断的各1000个。
2. 2 PCR方法筛选文库的结果
2. 2. 1 筛选引物对扩增条件优化结果 用引物对
T 3 和 ST R 按 Mg 2+ 1. 0～4. 0 mM (梯次增加 0. 5
mM )的7个浓度梯度和40～55℃间设定的12个退火
温度梯度进行扩增, 电泳结果显示, 3. 0 mM 的MgCl 2
浓度, 50. 9℃的退火温度为最适扩增条件(图1)。
2. 2. 2 含微卫星序列阳性克隆的筛选 按优化的
PCR条件, 通过分组(每组 13个菌)筛选,凡有扩增
产物的为阳性克隆组(图2a)。将阳性克隆组中的13
个单菌质粒在同样条件下筛选,部分结果如图2b 所
示。共获得116个阳性克隆,筛选效率为5. 8% ;对其
进行测序, 37个含5个以上序列重复,占阳性克隆数
的31. 8%; 28个具完整的侧翼序列。两个不同片断
大小的文库克隆效率比较结果为: 100～250 bp 片
断文库,获得35个阳性克隆,筛选效率为3. 5% , 8个
含5个以上序列重复, 占阳性克隆数的22. 8%; 81个
阳性克隆来源于250～750 bp 片断文库, 筛选效率
为8. 1% , 29个含5个以上序列重复,占阳性克隆数
的35. 8%。
2. 3 测序及引物设计, PCR 条件优化结果
对28个具有完整侧翼序列的微卫星片断中的
15个设计引物并且优化PCR 条件, 10个克隆的测
279第 3期 王登等: PCR 方法筛选布氏田鼠小片断插入微卫星文库
序结果、引物设计结果和设计引物的扩增条件优化
结果见表1。在PCR 条件优化过程中, 5对引物的扩
增产物电泳结果不整齐、不清晰, 需继续优化扩增
条件。
图1 T3 和STR2引物在 3. 0mM Mg2+浓度不同退火温度和 50. 9℃退火温度不同Mg2+ 浓度扩增产物比较
Fig. 1 Compar ion o f the PCR am plificat ions at 40～55℃ ( including 12 temperat ur e g radients) w it h 3. 0 mM Mg 2+
and the PCR amplificat ions annealing at 50. 9℃ w ith 2. 5, 3. 0 and 3. 5 mM M g2+
M: 分子量标记 Marker ( DL 2000 ) , a) 1～ 12泳道为 3. 0 mM Mg2+ ,退火温度分别为 40℃, 40. 4℃, 41. 3℃, 42. 5℃, 44. 2℃, 46. 4℃,
48. 9℃, 50. 9℃, 52. 7℃和 53. 8℃的扩增结果; b) 50. 9℃退火温度,不同Mg2+浓度的扩增产物, 1、2泳道为 2. 5 mM, 3、4泳道为 3. 0 mM, 5～8
泳道为 3. 5 mM ( 1%的琼脂糖凝胶电泳)
M : The DL-2000 molecular size marker, a) . lanes 1～12 is the PCR ampl if ication result s at anneal ing temper ature of 40℃, 40. 4℃,
41. 3℃, 42. 5℃, 44. 2℃, 46. 4℃, 48. 9℃, 50. 9℃, 52. 7℃ and 53. 8℃, respect ively and react ion mixtures contained 1. 5 mM Mg2+ ; b ) . The
PCR amplif icat ion result s at annealin g temperature of 50. 9℃an d react ion mix tu res contained dif ferent Mg2+ concen trat ions: lanes 1, 2: 2. 5
mM; lanes 3, 4: 3. 0mM ; lanes 5-8: 3. 5 mM ( 1% agarose gel elect roph oret ic analysis )
图 2 13个一组质粒组及单菌质粒PCR 产物部分电泳检测
Fig. 2 Electropho ret ic ana ly sis of PCR product s o f a gr oup of 13 plasmids and each plasmid of the positive g roups
M:分子量标记Marker ( DL 2000) , a)条带为阳性克隆组; b ) 条带为阳性克隆单菌质粒( 1%的琼脂糖凝胶电泳)
M : Th e DL-2000 molecular siz e marker ; a) T he visual ized bands are posit ive grou ps; b) T he visual ized bands are pos it ive colonies ( 1%
ag aros e gel elect rophoretic analysis )
3 讨 论
传统的从基因文库中筛选目的片断的方法是使
用Southern 杂交的方法, 虽然现在非放射性探针标
记被广泛应用,但其高昂的价格,尤其是对于短重复
序列探针的标记效率极低,使得其应用受到很大的
限制。而放射性同位素标记虽然价格便宜, 效率较
高,但对实验设备和操作要求极高。使用PCR 方法
筛选部分小插入片断文库得到微卫星位点, 虽然效
率较低, 但对于除基因联结图谱构建外的大部分生
态学研究中所需的位点已经足够。PCR 筛选为大部
分希望克隆微卫星位点的研究者提供了简便易行的
方法,有利于微卫星标记在种群研究中的推广。
微卫星的重复类型有单核苷酸重复如A/ T、C/
G, 4种二核苷酸重复AT / T A、AC/ T G、AG/ T C 和
CG/ GC 以及三、四核苷酸重复类型等,但研究发现
较多的为AC/ T G,约占57%, 其他的类型较少[ 16]。各
种类型的微卫星核心序列中, 关于何种类型的微卫
星序列筛选出多态性微卫星标记的可能性较大, 一
280 草 地 学 报 第 15卷
直以来众说纷纭。一般3碱基和4碱基为基本重复序
列的微卫星进行标记筛选, 多态性效率较高。
实验中, 由于所得微卫星序列中主要形式为2
碱基重复序列,所以主要选取了2碱基和3碱基为基
本重复单位的微卫星序列进行引物筛选。CA 重复
类型在整个基因组中1～6个核心序列各重复类型
中所占比例最高, GA 重复次之 [ 21]。但5′-GT GT G-
TGT GT GTGT -3′引物比5′-CTCT CT CTCT CTCT -
3′易与Pbluescr ipt SK( + )质粒的通用引物序列T 3:
5′-AT TAACCCTCA CT AAAGGGA-3′形成引物
二聚体,从而降低扩增效率。为了避免在扩增中微卫
星序列出现较多的二级结构而造成PCR 效率下降,
以及在电泳分离中造成较大误差, 尽量避免选择
( AT ) n 为核心重复单位的微卫星序列用于引物
设计。
表1 10 个克隆的测序引物设计结果和扩增条件优化结果
T able 1 The primers o f 10 m icro satellit es loci for Brandt’s vo les and the opt imization of PCR conditions
位点编号
Locus No.
重复单元
Repeat m ot if
引物( 5′-3′)
Primer
最适退火
温度T a℃
Mg 2+
浓度( mM )
克隆的等位基因大小
Cloned allele s ize range
29-7 ( GA ) 17GT( GA) 24 5’AAGACA GGCT CCAAAGCAACAG 3’ 61 2. 5 249
5’CCAGGCT GTCATCT T GGT AAC 3’
25-38 ( AG) 21 5’GCCAACATT CCAT AAAGAGG 3’ 60 1. 5 199
5’GACAGGCT TCAAA GCT ACAG 3’
36-51 ( CT ) 5T T ( CT) 7( CAT A) 2( CA) 4 5’GCT T TGGAAGATACGGATG 3’ 60 2. 0 189
5’CAAAAGAGT T AAACTT ACT TGAT GA 3’
16-27 ( GA ) 34G( GA) 5AA( GA) 3G( GA) 7 5’CTGAGGCATCT AAAGAAAGG 3’ 64 3. 0 257
5’GAAGAGAAGAACCAAGAGAGC 3’
32-38 ( GA ) 24( GAAA) 20 5’GAGAAACT CCT GCCTGAA 3’ 53 1. 5 253
5’CCTCACTGT TGCAAAT ACT TC 3’
36-16 ( GT ) 2GC( GT) 9( GA) 32 5’CACT AAAGGGAACAAAAGC 3’ 53 1. 0 213
5’CTT GAAGAT T GGAACT AACC 3’
38-9 ( A) 39( GA) 10(A ) 5 5’TGT GAGT TCAAGACCAGCAG 3’ 58 3. 0 194
5’TCT T AATCACGGT TCT GTT G 3’
25-13 ( A) 9( GGAAA) 2( GA) 35 5’GGACAGGCTCCAAAGCTACA 3’ 61 1. 0 251
5’GCACAACAGAGT GACAGGAAT G 3’
6-47 ( GA ) 2T A( GA) 7 5’GCAAAA CAAATGCT CT TCG 3’ 60 1. 5 153
5’GCCTAAACCCTGGCT AATC 3’
40-50 ( GA ) 8( CAGAGA) 2 5’GGT GGAGAAGGAAGAT GC 3’ 56 1. 5 174
5’CTT T GGT AGT GGT GATGGC 3’
由于影响PCR 产物的各种要素中, M g2+ 浓度
和退火温度是影响特异性条带扩增的关键因素[ 22] ,
故对其进行优化增大筛选效率。
相对于大插入片段文库,小插入片段文库尽管便
于后续微卫星结构的研究,但克隆比率较低[ 23]。本研
究中同为小插入片段文库的两个插入片断大小不一
样的文库,其筛选效率也不一样, 250～750bp 片断文
库, 阳性克隆筛选效率, 含5个以上序列重复的克隆
占阳性克隆数分别是100～250bp片断文库的2. 3倍
和3. 6倍。测序结果显示,所得的37个含5个以上序
列重复的阳性克隆中, 29个为含GA 重复的微卫星序
列, 占78. 4%。表1中所列出的全为与CT 引物互补的
GA微卫星序列, 表明用PCR 方法筛选小片断插入微
卫星文库的方法是有效和可靠的。
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(责任编辑 李玉芹)
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