全 文 ：武汉植物学研究 2002, 20( 4) : 311～314
Journal of Wuhan Botanical Research
尼日利亚螫毛果( Cnestis f erruginca)中一种具有
清除自由基的活性化合物的分离鉴定
胡丰林1, 2 陆瑞利1 HAMBURGER Mat hias2
( 1.安徽农业大学, 合肥 230036; 2.耶拿大学药学院, 耶拿 07743, 德国)
摘 要: 用二苯基苦基苯肼自由基薄层实验法( DPPH-TLC-ASSAY ) ,从尼日利亚螫毛果 (Cnestis f err uginca)植物
的甲醇提取物中发现了一种具有很强的清除自由基活性的物质;用柱色谱及反相制备柱色谱( RP-LPPLC) ,制备出
了该活性物质的纯品; 用质谱( HR ESI-MS)、核磁共振氢谱( 1H)、碳谱( 13C、DEPT )、紫外光谱及化学方法对该物质
进行了结构鉴定, 鉴定结果为对苯酚基-6-O-反式咖啡酸基--D-吡喃葡萄糖甙。
关键词: 尼日利亚螫毛果; 自由基清除剂; 制备; 结构鉴定
中图分类号: Q946 文献标识码: A 文章编号: 1000-470X ( 2002) 04-0311-04
Isolation and Identif ication of a Free Radical Scavenger
from Cnestis f erruginca
HU Feng-Lin
1, 2, LU Rui-Li
1 , HAMBURGER M athias
2
( 1. A nhui A g ricul tur al Univ ersity , Hefei 230036, China;
2. Insti tut e of P harmacy, F ried eri ch-S chil ler -Univ ersity , J ena 07743, Germany)
Abstract: By means o f 1, 1-dipheny-2-picylhydrazyl ( DPPH) T LC-assay, a st rong free radical
scavenger w as detected from a M eOH ex tract of the leaves of Cnestis f er ruginca. The f ree radical
scavenger w as iso lated by reversed-phase preparat ive chromatog raphy and liquid chromato gra-
phy, and ident ificated as p-hydroxyphenyl-6-O-trans-caf feoy l--D-g lucopyranoside by means of
HR ESI-M S, NMR (
1
H,
13
C, DEPT ) , U V and chamical methods. The bio act iv ities o f this com-
pound were also discussed.
Key words : Cnestis f err uginca; Free radical scavenger; Isolat ion; Ident ificat ion
尼日利亚螫毛果( Cnest is f err uginca) 属于牛栓
藤科 ( Connaraceae) 螫毛果属 ( Cnesti s)。该属植物
在全世界约有 40种,分布于非洲热带、马达加斯加
和亚洲东南部,在我国仅分布一种。该属植物常作药
用,其中尼日利亚螫毛果在尼日利亚的民间被用来
治疗糖尿病。由于糖尿病是目前较难根治的一种疾
病,并且近年来发病率呈上升趋势,因此有关药用植
物的研究十分有意义。有关该植物成分的研究尚未
见报道。
1 材料和方法
1. 1 材料
实验材料 尼日利亚螫毛果( C. f er ruginca)
采自尼日利亚, 由 Oke J. M . 博士 ( Faculty of
Pharmacy , U niversity of IBADAN, Negeria) 采集
和鉴定。
化学药品 二苯基苦基苯肼自由基 ( 1, 1-
dipheny l-2-picryhydrazyl ) 从美国 Aldr ich 公司购
得;氘代二甲基亚砜、咖啡酸、熊果甙、葡萄糖、果糖、
收稿日期: 2002-01-03,修回日期: 2002-04-01。
作者简介: 胡丰林( 1965- ) ,男,硕士,副教授,主要从事天然活性物质研究和教学工作。
甘露糖、鼠李糖、三氟乙酸、氢氧化钠、香草醛等都购
于德国 Merck 公司;用于柱色谱的洗脱液为重蒸馏
回收试剂;用于制备色谱、高效液相色谱及葡聚糖柱
色谱为 HPLC 专用试剂; 所有实验用水都是由
SERAL 纯水系统制取。
设备 薄层色谱: 硅胶 60 F254 高效薄层铝
板 Merck 公司生产。 柱色谱: 4 cm×100 cm,
1. 5 cm×100 cm ,固定相为硅胶 60 ( 40～63 m) ,
M erck公司生产; Sephadex LH20 ( 25～100 m) 瑞
士 Fine Chemical AB公司生产。 反相低压制备色
谱( RP-LPLC )仪, 瑞士 Pharmacia Biotech 公司生
产,配有紫外检测器(德国生产) ;色谱柱为 Lichro-
prep RP-18, 40～ 63 m, 2. 5 cm×31 cm , 德国
Merck 公司生产。!高效液相色谱 ( HPLC ) 为
HP1040系列, 紫外多极阵列检测器,美国惠谱公司
生产,配有 HP 化学工作站, 色谱柱为 Lichr ospher
RP-18, 5 m, 4 mm×125 mm , Merck 公司生产。
∀ 高效液相色谱-质谱联用仪: HPLC为 HP1100系
列, HRESI-M S 为美国 Perkin-Elmer 公司生产, 配
有 PE Biosytems分析系统。#紫外光谱仪为 Beck-
man DU-600 (德国生产) 。∃ 核磁共振光谱仪为
Br ucker AMX 100和 400 ,美国生产。%干燥设备:
真空旋转蒸发器为 LABOROTA 400, Heidolph (德
国生产) ; 冷冻干燥 25-Freeze Mobile, VIRT IS (美
国生产)。
1. 2 方法
取干燥的植物样品 10 g, 粉碎后用 100 mL 甲
醇室温振荡提取 48 h 后真空抽滤,滤液经 45℃真空
脱溶,冷冻干燥后注入氦气于- 70℃冷藏备用。用
DPPH-T LC 试验法测试样品的清除自由基活性;用
柱色谱和低压制备色谱制备活性物质的纯品;用薄
层色谱和高效液相色谱检验纯度; 用 MS、NMR、
UV 以及化学方法分析其分子结构[ 1 3]。
2 结果与分析
2. 1 活性测定
用 DPPH-T LC 试验法。称取前述甲醇提取物
1 mg溶于 1 mL 乙醇中,取 4 L 点样于高效薄层板
上; 同时点同样体积的抗坏血酸溶液( 0. 5 mg/ mL
EtOH ) 作为阳性对照, 同体积的肉桂酸溶液
( 0. 5 mg/ mL EtOH )作为阴性对照。点样完毕后进
行层析(展开剂为:乙酸乙脂甲醇水= 8515 10)。
展开完 毕后喷 DPPH 自由基试剂 ( 1 mg/ mL
EtOH ) , 3 min后放入扫描仪记录下薄层图谱。结果
显示, 图谱上的黄色斑点(黑白图片中为白色)十分
明显, 说明该提取物具有较强的清除自由基活性。
DPPH 为一稳定的自由基, 它能够强烈地吸收
517 nm的光而呈紫色, 当它与自由基清除剂反应
时,其孤电子被配对,此时其吸收光发生蓝移而呈现
黄色[ 1, 3]。
2. 2 活性成分的制备
用 4 cm×100 cm 硅胶柱色谱对提取物进行
初步分离。流动相为 氯仿甲醇水= 75255 ; 上
样量为 800 mg ; 洗脱速度为 3 mL/ m in; 每 10 mL
收积 1管; 隔管抽样进行 DPPH-T LC 试验,合并组
成相似的洗脱液,脱溶后冷冻干燥得到 5个部分。其
中第 2、3、4部分都有清除自由基活性, 但以第 2部
分量大,所以仅将第 2部分用 LH20柱初步纯化(流
动相为 100%的甲醇) , 脱溶后冷冻干燥得黄色粉
83 mg。 用 RP-LPLC 作进一步纯化: 流动相为
40%的甲醇; 洗脱速度为 4 mL/ min ; 进样量为
83 mg进样体积为 5 mL(甲醇溶液) ; 检测波长为
300 nm。制备的结果得到淡黄色粉末 32 mg。 用
高效液相色谱检验纯度: 进样量为 20 L; 样品浓度
为 0. 5 mg / mL;洗脱速度为 1 mL/ m in,采用梯度洗
脱(甲醇/水系统) ; 洗脱时间为 40 min; 检测波长为
230、250、280、330、360 nm。结果显示单 一峰
( 100%) ,且峰前后的紫外光谱一致, 说明制备得到
的为纯品。!活性检验: DPPH-TLC 试验结果显示
单一的黄色斑点, 说明制备得到的是纯净的自由基
清除剂。
2. 3 活性成分结构鉴定
2. 3. 1 质谱(MS)分析
配制浓度为 0. 5 mg / mL 的样品溶液,自动进样
20 L 到 HPLC-HR ESI-MS 联用仪中进行分析。阳
离 子 模 式 ( POS ION M ode ) m/ z ( rel. int ) :
435. 123 8[ M + H ]
+
( 43)、446. 106 4 [ 2M + Na +
H ]
2+
( 25)、454. 097 2 [ 2M + Na + NH4] 2+ ( 60)、
457. 109 1 [ M + Na ]
+ ( 65) 等峰值; 阴离子模式
( NEG ION Mode) m / z ( rel. int ) : 433. 129 6 [ M -
H ]
-
( 100)、867. 253 2 [ 2M -H ] - ( 56) 等峰值。可见
其分子量应为 434. 126 7。经计算可知其可能的分子
式为 C21H22O 10。其不饱和度等于 11。从阳离子模式
( POS ION M ode )的谱图上还可看到 m/ z ( rel.
int ) : 162. 998 1 ( 42 )、181. 009 1 ( 23)、271. 038 0
( 10)、278. 036 1( 100)、325. 066 9( 60)等碎片峰。
2. 3. 2 紫外光谱分析
配制不同浓度的样品水溶液测试其紫外光谱,
通过计算得到: max H2O ( lo g!) : 216. 5 ( 4. 35) ,
312 武 汉 植 物 学 研 究 第 20 卷
243. 5 ( 4. 01) , 294. 0 ( 4. 18) , 324. 5 ( 4. 26)。此光谱
说明了该样品分子中存在有较大的共轭体系。当加
入 0. 1 mol / L NaOH 时最大吸收波长从 324. 5 nm
红移到 378. 0 nm ,表明该化合物中含有酚基。当加
入 AlCl3溶液时,样品的紫外吸收发生明显的红移,
而当加入盐酸溶液时又恢复原样, 说明有邻二酚羟
基存在。
2. 3. 3 核磁共振波谱分析
取样品 10 mg 溶解在 500 L 的氘代二甲基亚
砜中,测试氢谱1H、碳谱13C、无畸变极化转移增益谱
( DEPT 90、DEPT 135) 。图谱的分析结果见表 1。
表 1 碳谱和氢谱的分析数据
Table 1 1H and 13Cdate ( in DMSO-d6)
13C ∀ DEPT 1H ∀ J 13C ∀ DEPT 1H ∀ J
C1 101. 5 CH H1 4. 67 d J12 7. 6 C6 117. 6 CH H6 6. 83 dd Jo 8. 8Jm 2. 1
C2 73. 2 CH H2 3. 2 C1” 125. 3 C
C3 76. 3 CH H3 3. 2 C2” 114. 7 CH H2 7. 05 d Jmeta 1. 9
C4 69. 9 CH H4 3. 1 C3 148. 5 C
C5 73. 6 CH H5 3. 57 ddd 8. 9, 6. 6, 2. 1 C4 145. 6 C
C6 63. 4 CH2
H6A
H6B
4. 16
4. 39
ddJ6AB 11. 8 J56A 6. 6
ddJ6BA 11. 8 J56B 2. 1
C5 115. 7 CH H5 6. 77 d Jortho8. 1
C1 152. 2 C C6 121. 4 CH H6 6. 98 dd Jo8. 1Jm 1. 9
C2 117. 6 CH H2 6. 83 dd Jo 8. 8, Jm 2. 1 C7 145. 2 CH H7 7. 47 d J t rans15. 8
C3 115. 4 CH H3 6. 60 dd Jo8. 8, Jm2. 1 C8 113. 6 CH H8 6. 25 d J t rans15. 8
C4 150. 1 C C9 166. 4 C
C5 115. 4 CH H5 6. 60 dd Jo 8. 8, Jm 2. 1
从表中可看出未知化合物含 6个活泼氢。C1～
C6是一个糖的信号,其中 ∀101. 5是端基碳信号,由
J12= 7. 6可知甙键应为 型。C1～C6是典型的对位
取代苯信号。二者与熊果甙文献值非常一致[ 4, 5]。
C”1～C”9是咖啡酸信号, 由 ∀6. 25和 ∀7. 47两氢的
偶合常数为 15. 8可知是反式咖啡酸,这与文献值非
常一致[ 2, 6, 7]。由于 C6的 2 个氢的位移值( ∀4. 16、
∀4. 39)偏向低场较多,说明连有电负性大于羟基的
基团,此基团可能即咖啡酸基。上述分析结果表明,
该化合物可能为对苯酚基-6-O-反式咖啡酸基--D-
吡喃葡萄糖甙,此结果与MS、UV 谱都相一致。下面
用化学方法进一步证实该结构。
2. 3. 4 化学分析
酸水解:称取0. 5mg 样品,加 114 L 三氟乙酸
和 386 L 水于 110℃水解 1 h, 真空脱溶后加水
500 L溶解,用乙酸乙酯提取 3次,每次 500 L。测
定水溶液中糖的种类, 乙酸乙酯溶液中甙元的种类。
TLC 法测定糖的种类[ 8]。标准糖为葡萄糖、甘露
糖、和半乳糖。流动相为: 正丁醇丙酮0. 1 mol / L
磷酸缓冲液( pH5) = 451。显色剂为硝酸银的水和
丙酮溶液( A 液)及氢氧化钠溶液( B液)。结果显示
待测物中的糖为葡萄糖。 T LC 法测定甙元的种
类。标准物质为熊果甙( Arbit in)和氢化苯醌( Hy-
drochinone)。流动相为:氯仿甲醇水乙酸= 72
24 4 0. 5。显色剂为 Godin试剂( A 液: 1%香草醛
+ 3%高氯酸; B液: 10%硫酸) , 120℃显色。结果显
示待测物的甙元为对苯二酚, 图谱中还可见到未完
全水解的熊果甙(图略)。
碱水解: 称取 0. 5 mg 样品,加 1 ml 0. 5 mol/ L
NaOH 于 100℃水解 1 h, 冷却后用 1 mL 乙醚萃取
2次,水洗醚层 3次,每次 500 L。水层用水饱和的
正丁醇萃取。检验醚层中的咖啡酸和正丁醇层中熊
果甙。 咖啡酸的检验,用 T LC 法。标准物质为咖
啡酸( Caf feic acid) ,固定相和流动相同甙元测定, 不
需显色。结果显示含咖啡酸。 熊果甙的检验, 用
T LC 法。标准物质为熊果甙( Arbitin) , 固定相、流动
相和显色剂同前。结果显示含熊果甙(图略)。
3 结论和讨论
通过上述分析可知, 尼日利亚螫毛果植物的甲
醇提取物中发现的一种具有较强的清除自由基活性
的物质是:对苯酚基-6-O-反式咖啡酸基--D-吡喃
葡萄糖甙 ( 6-O-反式咖啡酸基熊果甙)。通过
CHAPMAN&HALL 天然产物数据库检索, 发现该
化合物为已知化合物, 但分别是从 Vaccinium vitis-
idaea和 Viburnum w rightii 中发现[ 2, 7, 9]。从螫毛果
属植物中发现咖啡酸基熊果甙还是首次。
313 第 4 期 胡丰林等: 尼日利亚螫毛果(Cnestis f er ruginca)中一种具有清除自由基的活性化合物的分离鉴定
从其结构看,咖啡酸基熊果甙的清除自由基活
性显然与酚基有关, 其中邻位酚羟基具有较强的清
除自由基活性[ 1, 3, 10, 11]。该化合物为糖甙类, 同时具
有一定的疏水性和亲水性,这使其在生物体内发挥
最佳作用有较大的潜力 [ 10]。
尼日利亚螫毛果植物在尼日利亚的民间被用来
治疗糖尿病,作为该植物的主要成分——咖啡酸基
熊果甙,是否具有治疗糖尿病作用还有待证实。如果
有作用,可能是通过清除自由基而防止自由基对胰
岛 B 细胞的损伤,及阻止由自由基诱导的有关糖尿
病发生发展的生化反应 [ 12]。
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314 武 汉 植 物 学 研 究 第 20 卷