全 文 ：植物科学学报 ２０１４ꎬ ３２(２): １３９ ~ １４７
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ＤＯＩ:１０ ３７２４ / ＳＰ Ｊ １１４２ ２０１４ ２０１３９
‘光叶蔷薇’器官间接再生体系的建立及
ＧＵＳ基因转化的初步研究
吕经娟１ꎬ２ꎬ３ꎬ 李淑斌２ꎬ３ꎬ 周宁宁２ꎬ３ꎬ 蹇洪英２ꎬ３ꎬ 王其刚２ꎬ３ꎬ 张 颢２ꎬ３ꎬ 唐开学１ꎬ２ꎬ３∗
(１ 华中农业大学园艺林学学院ꎬ 武汉 ４３００７０ꎻ ２ 云南省农业科学院花卉研究所ꎬ 昆明 ６５０２０５ꎻ
３ 云南省花卉育种重点实验室ꎬ 昆明 ６５０２０５)
摘 要: 以‘光叶蔷薇’(Ｒｏｓａ ｗｉｃｈｕｒｉａｎａ ‘Ｂａｓｙｅｓ ｔｈｏｒｎｌｅｓｓ’)无菌苗的顶生幼嫩小叶为外植体ꎬ 探讨了其愈伤
组织诱导及植株再生的方法ꎮ 结果表明ꎬ 高浓度的生长素 ＮＡＡ 能诱导外植体产生愈伤组织ꎻ 由 ＮＡＡ 诱导的愈
伤组织在附加 ＴＤＺ的 ＭＳ培养基上ꎬ 先暗培养再进行光照培养可直接分化出不定芽ꎮ 诱导愈伤组织的最佳 ＮＡＡ
浓度是 ７ ０ ｍｇ / Ｌ、 暗培养时间为 １０ ｄꎬ 而最佳分化培养基是 ＭＳ ＋ ５ ０ ｍｇ / Ｌ ＴＤＺ ＋ ３０ ｇ / Ｌ葡萄糖 ＋ ２ ５ ｇ / Ｌ
ＧＥＬꎬ 分化率达 １８ ３４％ꎮ 以诱导产生的愈伤组织为侵染受体ꎬ 初步建立了‘光叶蔷薇’ＧＵＳ 基因转化体系ꎮ 农
杆菌菌液浓度 ＯＤ６００值为 ０ ５、 侵染 ３０ ｍｉｎ、 共培养 ２ ｄ、 乙酰丁香酮的浓度为 ５０ μｍｏｌ / Ｌ是‘光叶蔷薇’愈伤组
织转基因的最优条件ꎮ
关键词: ‘光叶蔷薇’ꎻ 愈伤组织诱导ꎻ 植株再生ꎻ ＧＵＳ基因转化
中图分类号: Ｑ９４３ １ 文献标识码: Ａ 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１４)０２￣０１３９￣０９
收稿日期: ２０１４￣０２￣２０ꎬ 修回日期: ２０１４￣０３￣１１ꎮ
基金项目: 国家自然科学基金项目(３１１６０４０２)ꎮ
作者简介: 吕经娟(１９８７－)ꎬ 女ꎬ 硕士研究生ꎬ 主要从事月季栽培养护研究(Ｅ￣ｍａｉｌ: ｌｊｉｎｇｊｕａｎ＠ １６３ ｃｏｍ)ꎮ
∗ 通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ): 唐开学ꎬ 博士ꎬ 研究员ꎬ 研究生导师ꎬ 主要从事月季育种研究(Ｅ￣ｍａｉｌ: ｋｘｔａｎｇ＠ｈｏｔｍａｉｌ ｃｏｍ)ꎮ
Ｃａｌｌｕｓ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｓａ
ｗｉｃｈｕｒａｉａｎａ ‘Ｂａｓｙｅｓ ｔｈｏｒｎｌｅｓｓ’
ＬＵ
. .
Ｊｉｎｇ￣Ｊｕａｎ１ꎬ２ꎬ３ꎬ ＬＩ Ｓｈｕ￣Ｂｉｎ２ꎬ３ꎬ ＺＨＯＵ Ｎｉｎｇ￣Ｎｉｎｇ２ꎬ３ꎬ ＪＩＡＮ Ｈｏｎｇ￣Ｙｉｎｇ２ꎬ３ꎬ
ＷＡＮＧ Ｑｉ￣Ｇａｎｇ２ꎬ３ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｈａｏ２ꎬ３ꎬ ＴＡＮＧ Ｋａｉ￣Ｘｕｅ１ꎬ２ꎬ３∗
(１ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００７０ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ
２ Ｆｌｏｗｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅꎬ Ｙｕｎｎａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２０５ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ
３ Ｙｕｎｎａｎ Ｆｌｏｗｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２０５ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｓａ ｗｉｃｈｕｒａｉａｎａ ‘Ｂａｓｙｅｓ
ｔｈｏｒｎｌｅｓｓ’ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｒｏｗｎ ｙｏｕｎｇ ｌｅａｆｌｅｔｓ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔ ｃａｌｌｉ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｎ ＭＳ ｗｉｔｈ ａ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｘｉｎ (ＮＡＡ)ꎬ ｗｉｔｈ ｃａｌｌｉ ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ
ｄｉｒｅｃｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｎ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＴＤＺ ｕｎｄｅｒ ｄａｒｋ
ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｇｈｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｘｉｎ (ＮＡＡ) ｆｏｒ ｃａｌｌｉ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒ
ｗｉｃｈｕｒａｉａｎａ ｗａｓ ７ ０ ｍｇ / Ｌꎬ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄａｒｋ ｆｏｒ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｗａｓ １０ ｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ＭＳ ＋ ５ ０ ｍｇ/ Ｌ ＴＤＺ ＋ ３０ ｇ / Ｌ
ｇｌｕｃｏｓｅ ＋ ２ ５ ｇ / Ｌ ＧＥＬ (ｐＨ ５ ８－６ ０) . Ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｒａｔｅ ｏｆ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ
１８ ３４％ Ｗｅ ｕｓｅｄ ｔｈｅ ｃａｌｌｉ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ ＧＵＳ
ｇｅｎｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｗｅ ａｌｓｏ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ａ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ￣
ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｒ ｗｉｃｈｕｒａｉａｎａ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒ ｗｉｃｈｕｒａｉａｎａ ｗａｓ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ (ＯＤ６００) ｏｆ ０ ５ꎬ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ ｏｆ ３０ ｍｉｎꎬ ｃｏ￣ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ２ ｄꎬ ａｎｄ ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ５０ μｍｏｌ / Ｌ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｒｏｓａ ｗｉｃｈｕｒａｉａｎａ ‘Ｂａｓｙｅｓ ｔｈｏｒｎｌｅｓｓ’ꎻ Ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎꎻ Ｐｌａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎꎻ
ＧＵＳ ｇｅｎｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ
庭院月季品种‘光叶蔷薇’ (Ｒｏｓａ ｗｉｃｈｕｒｉａｎａ
‘Ｂａｓｙｅｓ ｔｈｏｒｎｌｅｓｓ’)是通过光叶蔷薇原种(Ｒｏｓａ
ｗｉｃｈｕｒａｎａ Ｃｒｅｐ)培育的园艺杂交品种ꎬ 因其植株
平卧ꎬ 有长匍枝ꎬ 叶片光亮ꎬ 花朵稠密ꎬ 花期较长
且有香气等特点ꎬ 被很多园艺学家视为重要的育种
材料ꎮ 由‘光叶蔷薇’已繁育出很多园艺品种并被
广泛栽培ꎬ 主要用于覆盖棚架、 石坡和墙垣等[１]ꎮ
此外ꎬ ‘光叶蔷薇’具有一年一次开花ꎬ 花白色、
单瓣ꎬ 茎匍匐等特性ꎬ 是利用基因工程技术进行
遗传改良的良好候选材料ꎮ 但是迄今尚未对其建立
高效的再生体系ꎬ 进一步的转基因研究工作也未见
报道ꎮ
一般而言ꎬ 植株再生可通过体细胞胚发生途径
(ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ)和器官发生途径(ｏｒｇａ￣
ｎｏｇｅｎｅｓｉｓ)来完成ꎮ 依据是否经历愈伤组织阶段
可将器官发生途径进一步分为ꎬ 器官直接发生途径
和器官间接发生途径 ２种ꎮ 以叶片、 茎段、 花瓣和
花丝等为外植体ꎬ 通过直接或间接的器官发生途径
和体细胞胚发生途径ꎬ 已成功获得了许多月季品种
的植株再生体系[２￣６]ꎮ Ｌｌｏｙｄ等以 Ｒ ｐｅｒｓｉｃａ × ｘａｎ￣
ｔｈｉｎａ的节间为材料诱导愈伤组织ꎬ 再将愈伤组织
转接至含有 ＢＡ 和 ＮＡＡ的培养基上诱导出不定芽ꎻ
其中不具有再生能力的愈伤组织淀粉含量较高ꎬ 而
可以再生的愈伤组织中淀粉含量相对较少ꎬ 且这种
具有器官发生能力的愈伤组织(ｏｒｇａｎｏｇｅｎｉｃ ｃａｌ￣
ｌｕｓ)继代培养次数超过 ３ 次后便会失去再生能
力[７]ꎮ Ｂｕｒｇｅｒ等以 ４ 个杂交组合产生的未成熟胚
为外植体诱导产生子叶愈伤组织后ꎬ 再在含 ＢＡ和
ＮＡＡ的培养基上诱导发生不定芽ꎬ 研究结果表明ꎬ
授粉 ２７ ｄ后胚轴刚形成时的胚再生率最高ꎬ 可达
到 ５３％[８]ꎮ Ｒｏｓｕ等以膨大的侧芽为外植体在含有
ＴＤＺ和 ＮＡＡ的培养基上进行反复的继代培养诱导
产生愈伤组织ꎬ 得到了不定芽ꎬ 这可能是侧芽对侧
芽附近的细胞产生了影响ꎬ 使其再分化从而产生不
定芽ꎻ 通过该方法以一少刺嵌合体切花品种为材料
进行分离还得到了无刺植株[９]ꎮ 林毅雁以‘月月
粉’(Ｒ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ‘Ｏｌｄ Ｂｌｕｓｈ’)无菌带柄叶片为
外植体ꎬ 前期采用 ６￣ＢＡ 和 ＮＡＡ 激素组合诱导愈
伤组织分化ꎬ 后期添加 Ａｄｓꎬ 但所有的实验处理组
合均无不定芽发生ꎬ 因此筛选出的培养基仅适用于
愈伤组织的生长与增殖ꎬ 维持愈伤组织的生活力ꎮ
林毅雁认为 Ａｄｓ 对愈伤组织的生长与增殖有明显
的促进作用ꎬ 所培养的愈伤组织较为疏松、 有活
力[１０]ꎮ 陈雪等发现月季愈伤组织诱导和分化培养
过程中ꎬ 材料的基因型、 外植体的类型、 培养基及
培养条件对其影响较大[１１]ꎮ
虽然已有很多关于月季愈伤组织诱导及植株再
生的报道ꎬ 但尚无一种较为普遍且可以获得良好愈
伤组织的方法ꎮ Ｄｏｈｍ 等报道的一种适用于 ５０ 多
种月季基因型的胚性愈伤诱导及植株再生的方法ꎬ
是目前报道中适用范围最广的愈伤组织诱导及植株
再生的方法[１２]ꎮ 但关于‘光叶蔷薇’ 再生及转化体
系的研究还未见报道ꎬ 故本实验拟通过组织培养诱
导建立‘光叶蔷薇’相对稳定高效的再生体系ꎬ 并
以‘光叶蔷薇’的愈伤组织为受体进行遗传转化体
系的初步研究ꎬ 为优良基因的转化和‘光叶蔷薇’
的遗传改良与育种奠定基础ꎮ
目前ꎬ 已有很多关于报告基因 ＧＵＳ和 ＧＦＰ的
成功报道[１３￣１５]ꎬ 也有部分其它基因的成功案例ꎮ
Ｓｏｕｑ等以 Ｍａｄａｍｅ Ｇ 的胚性愈伤组织为转化受
体ꎬ 根癌农杆菌介导转化查尔酮反义基因和 ＲｏｌＣ
基因ꎬ 导入 ＲｏｌＣ基因的植株在主茎干基部的分枝
明显增多ꎬ 且植株高度与非转基因植株相比较矮ꎻ
月季查尔酮反义基因的导入使花的红色减淡ꎬ 但未
见到白花或白色斑纹[１６]ꎮ Ｌｉ 等以月季‘Ｃａｒｅｆｒｅｅ
Ｂｅａｕｔｙ’的胚性愈伤组织为材料进行转基因研究ꎬ
结果表明ꎬ 目的基因 Ａｃｅ￣ＡＭＰ１ 的成功导入使植
株对白粉病的抗性大为提高[１７]ꎮ 高莉萍等通过农
杆菌介导的转化方法将 ＡＣＣ 氧化酶反义基因导入
月季‘Ｓａｍａｎｔｈａ’ꎬ 利用反义 ＲＮＡ 技术抑制月季
切花的乙烯合成ꎬ 获得了 ＡＣＣ 氧化酶反义基因稳
定转化的愈伤组织[１８]ꎮ Ｙｕｋｉｈｉｓａ 等通过根癌农杆
菌介导法转入类黄酮生物合成途径中飞燕草色素相
关基因获得了蓝色月季[１９]ꎮ
０４１ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷
建立再生体系是遗传转化的基础与前提ꎬ 本研
究以‘光叶蔷薇’为研究对象ꎬ 在建立其间接再生
体系的基础上ꎬ 以根癌农杆菌侵染的方法转化
ＧＵＳ报告基因于‘光叶蔷薇’的愈伤组织中ꎬ 研究
影响其转化的各种因素ꎬ 为月季转基因体系的建
立、 遗传改良与育种研究提供依据ꎮ
１ 材料与方法
１ １ 材料
２０１１年 ８月上旬ꎬ 从露地栽培的‘光叶蔷薇’
植株上剪取带有饱满腋芽的当年生枝条ꎬ 除去叶片
后ꎬ 先用低浓度的洗衣粉溶液洗去枝条表面的附着
物ꎬ 再用流水冲洗 ６０ ｍｉｎꎬ 最后剪成单芽的茎段ꎬ
放入广口瓶中ꎻ 在超净工作台上ꎬ 将带芽茎段用
０ １％的升汞处理 ８ ｍｉｎꎬ 无菌水冲洗 ４~５ 次ꎬ 接
种到扩繁培养基上光照培养ꎻ １周后ꎬ 腋芽开始萌
发ꎬ 芽体开始膨大、 伸长和展叶ꎻ 将萌发的新芽切
下置于增殖培养基 (ｐＨ ＝ ６ ０)ＭＳ ＋ １ ０ ｍｇ / Ｌ
６￣ＢＡ ＋ ０ １ ｍｇ/ Ｌ ＮＡＡ ＋ ３０ ｇ / Ｌ蔗糖 ＋ ６ ５ ｇ / Ｌ琼
脂上ꎬ 每 ４周接种至新的相同的增殖培养基继代培
养 １次ꎻ 以无菌苗的叶片为外植体进行愈伤组织诱
导和植株再生试验ꎮ
以诱导获得的愈伤组织为转化受体ꎬ 研究
ＧＵＳ 基因转化效果ꎮ 试验采用根癌农杆菌
(Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ)菌株 ＧＶ３１０１ꎬ 它
含有 ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１质粒ꎬ 该质粒携带 ＨＰＴ(潮霉
素磷酸转移酶)选择基因和 ＧＵＳ(β￣葡糖醛酸酶)报
告基因ꎬ ＧＵＳ 报告基因中含有一个内含子ꎬ 以此
来确保 ＧＵＳ基因不在农杆菌中表达而只在植物细
胞中表达ꎮ 质粒中 Ｔ￣ＤＮＡ区域的结构如图 １ꎮ
１ ２ 方法
１ ２ １ ‘光叶蔷薇’愈伤组织的诱导及植株再生
１ ２ １ １ 愈伤组织的诱导
预实验结果表明ꎬ 在‘光叶蔷薇’诱导培养基
中添加生长素 ＮＡＡ 比使用 ２ꎬ４￣Ｄ 诱导得到的愈伤
组织更易于分化ꎻ 黑暗条件下愈伤组织生长较快且
生活力强ꎬ 故本研究诱导培养基附加的植物生长调
节剂为 ＮＡＡꎬ 愈伤组织诱导阶段选择暗培养ꎮ
在超净工作台上ꎬ 自小叶柄处将其切成带有小
叶柄的单叶ꎬ 叶背朝下接种到添加不同 ＮＡＡ 浓度
(０、 １ ０、 ３ ０、 ５ ０、 ７ ０、 ９ ０、 １１ ０、 １３ ０ ｍｇ/ Ｌ)
的 ＭＳ 培养基上诱导愈伤组织ꎬ 暗培养 ２５ ｄ 后观
察愈伤组织诱导情况ꎮ 愈伤组织诱导率 ＝(产生愈
伤组织外植体数 /接种外植体数) × １００％ꎮ
１ ２ １ ２ 愈伤组织的继代培养
诱导培养 ３周后ꎬ 将愈伤组织转接至相同的新
培养基上继续暗培养ꎮ
１ ２ １ ３ 愈伤组织的分化
将能够在继代培养基上正常生长的愈伤组织接
种到愈伤组织分化培养基上ꎬ 分化培养基是附加不
同 ＴＤＺ浓度(１ ０、 ２ ０、 ３ ０、 ４ ０、 ５ ０、 ６ ０ ｍｇ/ Ｌ)
的 ＭＳ基本培养基ꎮ 将转接至分化培养基的愈伤组
织分别暗培养 ８、 ９、 １０、 １１、 １２ ｄ 后再正常光照
培养ꎬ ２５ ｄ后观察愈伤组织的分化情况并统计其
分化率ꎮ 愈伤组织分化率＝(产生不定芽的愈伤组
织数 /接种愈伤组织数) × １００％ꎮ
在愈伤组织的诱导及植株再生试验中ꎬ 若没有
特别说明均使用 ＭＳ基本培养基ꎬ 根据需要添加不
同的植物生长调节剂ꎬ 添加 ３０ ｇ / Ｌ 葡萄糖ꎬ 采用
２ ５ ｇ / Ｌ Ｇｅｌｒｉｔｅ使其凝固ꎮ ｐＨ 值调至 ５ ８ ~６ ０ꎬ
１２１℃ 高温灭菌 ２０ ｍｉｎꎮ 其中植物激素 ＴＤＺ、 ＧＡ３
进行过滤灭菌ꎬ 待培养基灭菌后冷却至 ５５ ~６５℃
时加入ꎬ 以避免其失活ꎮ 培养条件为: 光强 ２０００ ｌｘꎬ
光照培养(１４ ｈ / ｄ)时培养温度 ２５±１℃ꎬ 黑暗培养
时温度 ２４±１℃ꎮ 每处理设 ５ 个重复ꎬ 每个重复至
少 ２０个外植体ꎮ
１ ２ ２ ＧＵＳ基因转化
１ ２ ２ １ 工程菌液的制备
工程菌液的制备在参照毕玲等[２０]报道的方法
上略作调整ꎮ 首先ꎬ 用无菌的解剖针挑取农杆菌的
单菌落ꎬ 接种到 ＬＢ液体培养基中ꎬ 该液体培养基
含有 ５０ ｍｇ / Ｌ Ｋａｎꎬ ２８℃条件下ꎬ 以 １８０ ｒ / ｍｉｎ的
35S T- hpt (R) 35S P- 35S P- gus NOS T-
LB RBintron
图 １ 质粒 ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１的 Ｔ￣ＤＮＡ区结构
Ｆｉｇ １ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ￣ＤＮＡ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１
１４１ 第 ２期 吕经娟等: ‘光叶蔷薇’器官间接再生体系的建立及 ＧＵＳ基因转化的初步研究
转速在摇床上过夜培养ꎬ 将菌液按每管 ０ ８５ ｍＬ
分装于灭过菌的小离心管中ꎬ 同时加入 ０ １５ ｍＬ
灭菌甘油ꎬ 混合均匀后可长期保存在－７０℃的超低
温冰箱中ꎮ 在进行转化前ꎬ 拿一小管菌液ꎬ 用灭过
菌的接种针刮拭培养物ꎬ 在 ＹＥＢ 固体培养基上划
线ꎬ 其中 ＹＥＢ固体培养基所加抗生素类型和浓度
分别为 １００ ｍｇ / Ｌ Ｒｉｆ 和 １００ ｍｇ / Ｌ Ｋａｎꎬ ２８℃ 条
件下倒置培养ꎬ 使菌种复苏ꎬ 形成单菌落ꎬ 此盘
可作菌种盘ꎮ 从菌种盘中挑取单菌落接种到 ＹＥＢ
液体培养基中ꎬ 该液体培养基中附加的抗生素类
型和浓度分别为 １００ ｍｇ / Ｌ Ｒｉｆ和 １００ ｍｇ / Ｌ Ｋａｎꎬ
然后 ２８℃条件下ꎬ 以 １８０ ｒ / ｍｉｎ 的转速在摇床上
过夜培养ꎬ 将过夜活化的农杆菌按照１ ∶ ５０的比
例ꎬ 重新接种在新的相同的 ＹＥＢ 液体培养基中ꎬ
然后继续培养至对数期ꎮ 最后进行菌体的收集ꎬ
即以 ５０００ ｒ / ｍｉｎ 的转速离心 ５ ｍｉｎꎬ 将收集到的
菌体重悬ꎬ 至 ＯＤ６００为 ０ ４~０ ６ 即可用于侵染实
验ꎬ 重悬液选用 １ / ２ ＭＳ 液体培养基ꎮ
１ ２ ２ ２ 农杆菌培养基
ＬＢ液体培养基: 胰蛋白胨 １０ ｇ / Ｌꎬ 酵母粉
５ ｇ / Ｌꎬ ＮａＣｌ １０ ｇ / Ｌꎬ Ｋａｎ ５０ ｍｇ / Ｌꎻ ＹＥＢ 固体
培养基: 蛋白胨 ５ ｇ / Ｌꎬ 酵母提取物 １ ｇ / Ｌꎬ 牛肉
浸膏５ ｇ / Ｌꎬ ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ ０ ５ ｇ / Ｌꎬ 琼脂 １５ ｇ / Ｌꎬ
蔗糖 ５ ｇ / Ｌꎬ Ｋａｎ １００ ｍｇ / Ｌꎬ Ｒｉｆ １００ ｍｇ / Ｌꎻ ＹＥＢ
液体培养基: 蛋白胨５ ｇ/ Ｌꎬ 酵母提取物 １ ｇ/ Ｌꎬ 牛肉
浸膏 ５ ｇ/ Ｌꎬ ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ ０ ５ ｇ/ Ｌꎬ 蔗糖５ ｇ / Ｌꎬ
Ｋａｎ １００ ｍｇ / Ｌꎬ Ｒｉｆ １００ ｍｇ / Ｌꎻ １ / ２ ＭＳ液体培养
基: 无机盐减半ꎬ 其它不变ꎬ 添加 ３％蔗糖ꎮ
各培养基 ｐＨ 值为 ７ ０ꎬ 培养基 １２１℃高压灭
菌 ２０ ｍｉｎꎬ Ｋａｎ和 Ｒｉｆ采用过滤灭菌ꎬ 在培养基灭
菌后加入ꎮ
１ ２ ２ ３ 侵染和共培养
用根癌农杆菌菌液浸泡‘光叶蔷薇’愈伤组织
１０~３０ ｍｉｎꎬ 并在浸染过程中不断的轻轻震荡ꎻ 用
无菌滤纸吸去愈伤组织表面的残留菌液后ꎬ 将其接
种到附加乙酰丁香酮(ＡＳ)的共培养培养基中ꎬ 共
培养 １~３ ｄꎮ
１ ２ ２ ４ 正交试验设计‘光叶蔷薇’遗传转化因素
正交试验设计采用 ４ 因素 ３ 水平的 Ｌ９(３４)ꎬ
各因素试验水平见表 １ꎮ ４ 因素分别是侵染时间、
菌液浓度、 共培养基中乙酰丁香酮(ＡＳ)的浓度及
共培养时间ꎮ 试验参数设计参照毕玲等[２０]的方法ꎮ
按照试验设计对转化受体进行侵染处理ꎬ 共培养结
束后ꎬ 统计愈伤组织的 ＧＵＳ 基因瞬时表达率ꎬ 并
用 ＳＡＳ软件进行分析ꎮ
１ ２ ２ ５ ＧＵＳ基因瞬间表达的检测
共培养 １、 ２、 ３ ｄ后ꎬ 用无菌滤纸吸干材料表
面的液体ꎬ 然后将其放入 １ ５ ｍＬ的离心管中ꎬ 向
离心管注入 ＧＵＳ 染色液ꎬ ３７℃水浴避光保温过
夜ꎮ 经染色后ꎬ 可直接观察愈伤组织染色情况(肉
眼观察到的蓝色反应即是 ＧＵＳ 基因瞬时表达呈阳
性)ꎬ 统计 ＧＵＳ 基因瞬时表达率ꎮ 瞬时表达率 ＝
(呈现蓝色的外植体数 /外植体总数) × １００％ꎮ
１ ２ ２ ６ ＧＵＳ染色液配方
１０ ｍｇ氯霉素、 ５ ｍＬ ＮａＨ２ＰＯ４(浓度为１ ｍｏｌ / Ｌ)、
１ ｍＬ Ｔｒｉｔｏｎ(浓度为 １０％)、 ２０ ｍＬ 甲醇、 ８８ ９ ｍｇ
Ｘ￣Ｇｌｕｅ分别溶解后ꎬ 混合定容至 １００ ｍＬꎮ ｐＨ 值
调至 ７ ５ꎬ ４℃ 保存ꎮ
表 １ 正交试验的处理组合
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
编号
Ｎｏ
菌液浓度(ＯＤ６００)
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
侵染时间(ｍｉｎ)
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ
共培养时间(ｄ)
Ｃｏ￣ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ
乙酰丁香酮浓度(μｍｏｌ / Ｌ)
Ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
１ ０ ４ １０ １ ５０
２ ０ ４ ２０ ２ １００
３ ０ ４ ３０ ３ ２００
４ ０ ５ １０ ２ ２００
５ ０ ５ ２０ ３ ５０
６ ０ ５ ３０ １ １００
７ ０ ６ １０ ３ １００
８ ０ ６ ２０ １ ２００
９ ０ ６ ３０ ２ ５０
２４１ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷
２ 结果与分析
２ １ ‘光叶蔷薇’愈伤组织诱导及植株再生
２ １ １ 愈伤组织的诱导
以‘光叶蔷薇’顶生幼嫩小叶为外植体ꎬ 叶背
朝下接种至附加不同浓度生长素 ＮＡＡ 的 ＭＳ 基本
培养基上进行愈伤组织诱导ꎬ ２５ ｄ 后统计愈伤组
织发生率ꎮ 由表 ２ 可知ꎬ 高浓度的生长素 ＮＡＡ
(５ ０~１３ ０ ｍｇ / Ｌ)能诱导产生大量愈伤组织ꎬ 且
愈伤组织形成于小叶柄处(图 ２: ａ)ꎮ 但 ＮＡＡ浓度
过高(１１~１３ ０ ｍｇ / Ｌ)诱导形成的愈伤组织继续培
养易褐化死亡ꎬ 故‘光叶蔷薇’小叶外植体在附加
５ ０~９ ０ ｍｇ / Ｌ ＮＡＡ 的 ＭＳ 培养基上暗培养 ２５ ｄ
后诱导产生的愈伤组织状态较好ꎮ
表 ２ 不同浓度 ＮＡＡ对‘光叶蔷薇’叶片
愈伤组织诱导的影响
Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｕｘｉｎｓ ｏｎ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｌｅａｆｌｅｔｓ
ｏｆ Ｒｏｓａ ｗｉｃｈｕｒａｉａｎａ ‘Ｂａｓｙｅｓ ｔｈｏｒｎｌｅｓｓ’
ＮＡＡ
(ｍｇ / Ｌ)
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｆ ＮＡＡ
愈伤组织
发生率(％)
Ｃａｌｌｕｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ
愈伤组织
生长状态
Ｃａｌｌｕｓ ｆｅａｔｕｒｅｓ
０ ０ ００ ± ０ ００ ｅ 叶柄处膨大
１ ０ ３７ ００ ± ０ ０４ ｄ 有少量水渍化愈伤和大量类根体生成
３ ０ ５５ ００ ± ０ ０５ ｃ 有少量水渍化愈伤和大量类根体生成
５ ０ ８３ ００ ± ０ ０３ ｂ 有大量愈伤生成ꎬ 乳白色、 松软、 颗粒状
７ ０ ８７ ５０ ± ０ ０３ ａ 有大量愈伤生成ꎬ 乳白色、 松软、 颗粒状
９ ０ ８９ ００ ± ０ ０２ ａ 有大量愈伤生成ꎬ 乳白色、 松软、 颗粒状
１１ ０ ８６ ５０ ± ０ ０２ ａ 有大量愈伤生成ꎬ 灰白色、 致密、 较硬
１３ ０ ８３ ５０ ± ０ ０３ ｂ 有大量愈伤生成ꎬ 灰白色、 致密、 坚硬
注: 不同字母表示在 ｐ < ０ ０５水平上差异显著ꎬ 下同ꎮ
Ｎｏｔｅ: Ｃｏｌｕｍｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ａｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ａｔ ｐ < ０ ０５ Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ.
２ １ ２ 愈伤组织的分化
将由外植体诱导产生的愈伤组织转接至附加不
同浓度 ＴＤＺ的分化培养基上ꎬ 暗培养 １０ ｄ 后进行
正常光照培养ꎮ ２５ ｄ 后愈伤组织即分化出不定芽
(图 ２: ｂ、 ｃ)ꎮ 从表 ３ 可以看出当 ＴＤＺ 浓度为
１ ０~２ ０ ｍｇ / Ｌ时胚性愈伤组织无分化现象ꎻ ＴＤＺ
浓度为 ３ ０~６ ０ ｍｇ / Ｌ 时ꎬ 胚性愈伤组织均分化
出不定芽ꎬ 且当 ＴＤＺ 浓度为 ５ ０ ｍｇ / Ｌ 时不定芽
分化率最高ꎬ 达到 １８ ３４％ꎬ 故‘光叶蔷薇’胚性愈
伤组织分化的最佳分化培养基是附加 ５ ０ ｍｇ / Ｌ
ＴＤＺ的 ＭＳ基本培养基ꎮ
表 ３ 不同浓度 ＴＤＺ对‘光叶蔷薇’胚性
愈伤组织分化的影响
Ｔａｂｌｅ ３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＴＤＺ ｏｎ
ｓｈｏｏｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ｏｆ
Ｒｏｓａ ｗｉｃｈｕｒａｉａｎａ ‘Ｂａｓｙｅｓ ｔｈｏｒｎｌｅｓｓ’
ＴＤＺ浓度(ｍｇ / Ｌ)
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＤＺ
愈伤组织分化率(％)
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｃａｌｌｉ
１ ０ ０ ００ ± ０ ００ ｃ
２ ０ ０ ００ ± ０ ００ ｃ
３ ０ １２ １８ ± ０ ０６ ｂ
４ ０ １２ ７６ ± ０ ０９ ｂ
５ ０ １８ ３４ ± ０ １１ ａ
６ ０ １０ ７０ ± ０ ０２ ｂ
２ １ ３ 暗培养时间对愈伤组织分化的影响
将转接至附加 ５ ０ ｍｇ / Ｌ ＴＤＺ分化培养基上的
愈伤组织分别暗培养 ８、 ９、 １０、 １１ 和 １２ ｄ 后进
行正常光照培养ꎬ ２５ ｄ 后观察愈伤组织分化情况
并统计愈伤分化率ꎮ 结果表明(表 ４)ꎬ 暗培养 ８ ｄ、
９ ｄ和 １２ ｄ的愈伤组织无分化现象ꎬ 而培养 １０ ｄ
和 １１ ｄ的愈伤组织均能分化出不定芽ꎬ 其愈伤组
织分化率分别为 １５ ６％和 ５ ２７％ꎬ 故对于‘光叶
蔷薇’来说ꎬ 暗培养 １０ ｄ 时ꎬ 愈伤组织的分化率
最高ꎮ
表 ４ 暗培养时间对‘光叶蔷薇’胚性愈伤组织分化的影响
Ｔａｂｌｅ ４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄａｒｋ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｏｎ ｓｈｏｏｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ｏｆ Ｒｏｓａ ｗｉｃｈｕｒａｉａｎａ
‘Ｂａｓｙｅｓ ｔｈｏｒｎｌｅｓｓ’
暗培养时间(ｄ)
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ ｉｎ ｄａｒｋｎｅｓｓ
愈伤组织分化率(％)
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｃａｌｌｉ
８ ０ ００ ± ０ ００ ｃ
９ ０ ００ ± ０ ００ ｃ
１０ １５ ６０ ± ０ ０４ ａ
１１ ５ ２７ ± ０ ０９ ｂ
１２ ０ ００ ± ０ ００ ｃ
２ １ ４ 植株的再生
将分化出不定芽的愈伤组织转至含 ０ １ ｍｇ / Ｌ
６￣ＢＡ和 ０ ０５ ｍｇ / Ｌ ＮＡＡ 的 ＭＳ 培养基上继续培
养ꎬ 不定芽伸长生长并形成丛生芽(图 ２: ｄ)ꎮ 将
伸长的不定芽再转接到扩繁培养基上培养增殖即可
得到再生植株(图 ２: ｅ、 ｆ)ꎮ
３４１ 第 ２期 吕经娟等: ‘光叶蔷薇’器官间接再生体系的建立及 ＧＵＳ基因转化的初步研究
a1000 mμ 1000 mμ
1000 mμ
b
c d
e f
ａ 小叶外植体愈伤组织的诱导ꎻ ｂꎬ ｃ 从愈伤组织上诱导不定芽ꎻ ｄ 不定芽伸长ꎻ ｅ 再生植株ꎻ ｆ 移栽植株ꎮ
ａ Ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｌｅａｆ ｅｘｐｌａｎｔｓꎻ ｂꎬ ｃ Ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ ｃａｌｌｉꎻ ｄ Ｅｌｏｎｇａｔｅｄ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ
ｂｕｄｓꎻ ｅ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｌａｎｔꎻ ｆ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｐｌａｎｔ
图 ２ ‘光叶蔷薇’不定芽诱导和植株再生
Ｆｉｇ ２ Ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｓａ ｗｉｃｈｕｒａｉａｎａ ‘Ｂａｓｙｅｓ ｔｈｏｒｎｌｅｓｓ’
２ ２ ＧＵＳ基因转化
２ ２ １ 极差分析法
采用极差(Ｒ)分析法对‘光叶蔷薇’愈伤组织
ＧＵＳ基因的瞬时表达率进行分析ꎬ 研究不同处理
下各因素对遗传转化的影响ꎬ 结果表明(表 ５)ꎬ 各
因素对转基因的影响程度从大到小排列为: 菌液浓
度、 侵染时间、 乙酰丁香酮浓度、 共培养时间ꎮ 其
中 Ａ因素即菌液浓度的优水平为 Ａ２ꎬ 即 ＯＤ６００为
０ ５时最优ꎻ 而 Ｂ３、 Ｃ２、 Ｄ１分别为 Ｂ、 Ｃ、 Ｄ因素
的优水平ꎬ 故 ４因素的优水平组合 Ａ２Ｂ３Ｃ２Ｄ１为本
实验的最优水平组合ꎬ 即‘光叶蔷薇’愈伤组织转
基因的最优条件为: 菌液浓度 ＯＤ６００为 ０ ５ꎬ 侵染
时间为 ３０ ｍｉｎꎬ 共培养时间为 ２ ｄꎬ 乙酰丁香酮的
浓度为 ５０ μｍｏｌ / Ｌꎮ
４４１ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷
２ ２ ２ ＳＡＳ方差分析法
利用 ＳＡＳ软件对正交试验结果进行方差分析
(表 ６)ꎬ 其结果与极差分析法较为一致ꎮ ４ 因素对
转化效果的影响都是极显著的ꎬ 而且对遗传转化的
影响程度不同ꎬ 其中菌液浓度的影响最大ꎬ 其次是
侵染时间和乙酰丁香酮浓度ꎬ 最后是共培养时间ꎮ
ＧＵＳ基因的染色情况如图 ３ 所示ꎬ 即愈伤组
织 ＧＵＳ表达呈阳性ꎬ ＧＵＳ基因转化成功ꎮ
表 ５ 正交试验极差分析结果
Ｔａｂｌｅ ５ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｒａｎｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
编号
Ｎｏ
转化条件
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ
ＧＵＳ基因瞬时表达率(％)
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ＧＵＳ ｇｅｎｅ
菌液浓度
Ａ (ＯＤ６００)
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
侵染时间
Ｂ (ｍｉｎ)
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ
共培养时间
Ｃ(ｄ)
Ｃｏ￣ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ
乙酰丁香酮浓度
Ｄ (μｍｏｌ / Ｌ)
Ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
重复 １
Ｒｅｐｅａｔ １
重复 ２
Ｒｅｐｅａｔ ２
平均值
Ａｖｅｒａｇｅ
１ ０ ４ １０ １ ５０ １３ ３３ １２ ５０ １２ ９１５
２ ０ ４ ２０ ２ １００ ２０ ００ １８ ７５ １９ ３７５
３ ０ ４ ３０ ３ ２００ １６ ６７ １７ ６５ １７ １６
４ ０ ５ １０ ２ ２００ ２６ ６７ ２８ ５７ ２７ ６２
５ ０ ５ ２０ ３ ５０ ３３ ３３ ３７ ５０ ３５ ４１５
６ ０ ５ ３０ １ １００ ４０ ００ ４３ ７５ ４１ ８７５
７ ０ ６ １０ ３ １００ ２５ ００ ２６ ６７ ２５ ８３５
８ ０ ６ ２０ １ ２００ １２ ５０ １１ ７６ １２ １３
９ ０ ６ ３０ ２ ５０ ４２ ８２ ４６ ６７ ４４ ７６５
Ｋ１ ４９ ４５ ６６ ３７ ６６ ９２ ９３ ０９５
Ｋ２ １０４ ９１ ６６ ９２ ９１ ７６ ８７ ０８５
Ｋ３ ８２ ７３ １０３ ８ ７８ ４１ ５６ ９１
ｋ１ １６ ４８ ２２ １２ ２２ ３１ ３１ ０３
ｋ２ ３４ ９７ ２２ ３１ ３０ ５９ ２９ ０３
ｋ３ ２７ ５８ ３４ ６０ ２６ １４ １８ ９７
Ｒ １８ ４９ １２ ４８ ８ ２８ １２ ０６
主次 ＲＡ(１８ ４９)> ＲＢ(１２ ４８)> ＲＤ(１２ ０６)> ＲＣ(８ ２８)
优水平 Ａ２ Ｂ３ Ｃ２ Ｄ１
优组合 Ａ２Ｂ３Ｃ２Ｄ１
表 ６ ＳＡＳ方差分析结果
Ｔａｂｌｅ ６ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ ｂｙ ＳＡＳ ｒｅｓｕｌｔｓ
变异来源
Ｓｏｕｒｃｅ
平方和
ＳＳ
自由度
ＤＦ
均方
ＭＳ
Ｆ值
Ｆ ｖａｌｕｅ
菌液浓度(ＯＤ６００)
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
１０３８ ８６２ ２ ５１９ ４３１ １６５ ６８∗∗
侵染时间(ｍｉｎ)
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ６１２ ９９３ ２ ３０６ ４９７ ９７ ７６
∗∗
共培养时间(ｄ)
Ｃｏ￣ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ２０５ ７２０ ２ １０２ ８６０ ３２ ８１
∗∗
乙酰丁香酮浓度(μｍｏｌ / Ｌ)
Ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ５００ ９６０ ２ ２５０ ４８０ ７９ ８９
∗∗
误差
Ｅｒｒｏｒ ２８ ２１６ ９ ３ １３５
总和
Ｔｏｔａｌ ２３８６ ７５１ １７
注: ∗∗表示在 ｐ ≤ ０ ０１水平上差异显著ꎮ
Ｎｏｔｅ: ∗∗ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ ｐ ≤ ０ ０１
５４１ 第 ２期 吕经娟等: ‘光叶蔷薇’器官间接再生体系的建立及 ＧＵＳ基因转化的初步研究
图 ３ ＧＵＳ基因瞬间表达检测
Ｆｉｇ ３ ＧＵＳ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
３ 讨论
本实验成功获得了‘光叶蔷薇’的再生植株并
初步建立了其间接器官发生途径的再生体系ꎬ 即以
‘光叶蔷薇’无菌苗顶生小叶为外植体ꎬ 将在附加
高浓度 ＮＡＡ诱导培养基上暗培养获得的愈伤组织ꎬ
转接至分化培养基(ＭＳ ＋ ５ ０ ｍｇ/ Ｌ ＴＤＺ ＋ ３０ ｇ / Ｌ
葡萄糖 ＋ ２ ５ ｇ / Ｌ ＧＥＬ)暗培养 １０ ｄ 后光照培养
２０~２５ ｄ 即可分化出不定芽ꎻ 将分化出不定芽的
愈伤组织转至含 ０ １ ｍｇ / Ｌ ６￣ＢＡ 和 ０ ０５ ｍｇ / Ｌ
ＮＡＡ的 ＭＳ 培养基上继续培养ꎬ 不定芽伸长生长
并形成丛生芽ꎻ 伸长的不定芽可在无菌苗扩繁培养
基上培养增殖ꎬ 即可获得‘光叶蔷薇’的再生植株ꎮ
本研究与前人的报道结果相比ꎬ ‘光叶蔷薇’的愈
伤组织发生率相对偏低ꎮ 获取易于分化的胚性愈伤
组织是建立间接器官发生途径再生体系的关键ꎬ 本
研究发现经 ＮＡＡ 诱导得到的愈伤组织比 ２ꎬ４￣Ｄ 诱
导得到的愈伤组织易于分化ꎬ 这与林娅等[２１]的研
究结果一致ꎻ ＴＤＺ 在愈伤组织的分化培养过程中
发挥着重要的作用ꎬ 这与高莉萍等[２２]的观点一致ꎮ
本实验简单可行ꎬ 但并未探讨不同的附加物(Ｐｒｏ
和 Ａｇ等)对愈伤组织分化不定芽的影响ꎬ 同时分
化率不高也是最重要的问题所在ꎬ 期望在以后的研
究中能够加以改善ꎮ
进行转化实验时ꎬ 农杆菌的菌液浓度和浸染时
间会因转化受体材料的不同而进行选择ꎮ 菌液浓度
ＯＤ６００一般为 ０ ０５ ~０ ７ꎬ 如果植物转化受体对农
杆菌较为敏感ꎬ 则需要较低的菌液浓度ꎬ 反之ꎬ 可
选择相对较高的菌液浓度ꎮ 农杆菌菌液的侵染时间
也很重要ꎬ 一般不超过 ３０ ｍｉｎꎮ 若侵染时间太长ꎬ
植物细胞可能会受到细菌的毒害作用ꎬ 侵染时间过
短又会造成转化受体与菌液不能充分接触ꎬ 从而影
响转化ꎮ 高莉萍等[１８]以月季品种‘萨曼莎’胚性愈
伤组织为转化受体的研究结果表明ꎬ 当菌液浓度
ＯＤ６００值为 ０ ５~０ ８ 时ꎬ 侵染 ２０ ｍｉｎ 就可以成功
转化ꎬ 转化率达到 ６９ ２％ꎮ 本研究以‘光叶蔷薇’
的胚性愈伤组织为转化受体ꎬ 菌液浓度 ＯＤ６００值为
０ ５ꎬ 侵染时间为 ３０ ｍｉｎ 时ꎬ ＧＵＳ 基因转化率最
高(４４％)ꎬ 但此结果显著低于月季品种‘萨曼莎’
的转化率ꎬ 说明‘光叶蔷薇’的遗传转化条件还可
以进一步优化ꎮ
影响基因转化的重要因素还有共培养时间和乙
酰丁香酮浓度ꎮ 在共培养阶段ꎬ 农杆菌会将其 Ｔ￣
ＤＮＡ区域整合到植物基因组中ꎬ 即完成转化ꎮ 在
预培养或共培基中添加乙酰丁香酮ꎬ 可诱导 ｖｉｒ 基
因表达ꎬ 从而促进农杆菌细胞中的 Ｔ￣ＤＮＡ 转移到
试验植物细胞中ꎮ 本研究在共培养基中加入不同浓
度的乙酰丁香酮ꎬ 结果表明乙酰丁香酮(ＡＳ)浓度
为 ５０ μｍｏｌ / Ｌ、 共培养 ２ ｄ是‘光叶蔷薇’愈伤组织
转基因的最优条件ꎬ 此结果只是在本实验条件及培
养环境下得到的ꎮ 另外ꎬ 外植体的类型、 共培养时
光照条件、 共培养培养基中盐浓度和 ｐＨ值、 共培
养温度等也是影响 Ｔ￣ＤＮＡ 转化的重要因素ꎮ 要想
获得更好的转化体系ꎬ 还需要对各个环节和条件进
行优化ꎮ
参考文献:
[ １ ] Ｂｙｒｎｅ ＤＨꎬ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｎꎬ Ｂｒｅｎｔ Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎ Ｈ Ｔｈｅ
ｕｓｅ ｏｆ Ｒｏｓａ ｗｉｃｈｕｒｉａｎａ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ
ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｒｏｓｅｓ ａｄａｐｔｅｄ ｔｏ ｈｏｔ ｈｕｍｉｄ ｃｌｉｍａｔｅｓ
[Ｊ] . Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃꎬ ２００７ꎬ ７５１: ２６７－２７４.
[ ２ ] Ｒｏｕｔ ＧＲꎬ Ｓａｍａｎｔａｒａｙ Ｓꎬ Ｍｏｔｔｌｅｌｙ Ｊꎬ Ｄａｓ Ｐ Ｂｉｏ￣
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｓｅ: ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏ￣
ｇｒｅｓｓ[Ｊ] . Ｓｃｉ Ｈｏｒｔｉｃꎬ １９９９ꎬ ８１: ２０１－２２８
[ ３ ] Ｄｏｈｍ Ａꎬ Ｌｕｄｗｉｇ Ｃꎬ Ｎｅｈｒｉｎｇ Ｋꎬ Ｄｅｂｅｎｅｒ Ｔ Ｓｏ￣
ｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｒｏｓｅｓ [ Ｊ] . Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃꎬ
２００１ａꎬ ５４７: ３４１－３４８
[ ４ ] Ｌｉ ＸＱꎬ Ｋｒａｓｎｙａｎｓｋｉ ＳＦꎬ Ｋｏｒｂａｎ ＳＳ Ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍ￣
ｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓꎬ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓꎬ
ａｎｄ ｓｈｏｏｔ ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｒｏｓａ [ Ｊ ] . Ｊ Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２００２ａꎬ １５９: ３１３－３１９
[ ５ ] Ｋｉｍ ＣＫꎬ Ｃｈｕｎｇ ＪＤꎬ Ｊｅｅ ＳＯꎬ Ｏｈ ＪＹ Ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍ￣
６４１ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷
ｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｆｒｏｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｒｏｗｎ ｌｅａｆ ｅｘｐｌａｎｔ ｏｆ Ｒｏ￣
ｓａ ｈｙｂｒｉｄａ Ｌ [Ｊ] . Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈꎬ ２００３ꎬ ５: １６９－
１７２
[ ６ ] Ｐｈｉｌｉｐｐｅ Ｖꎬ Ｍａｒｉｏｎ Ｍꎬ Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ Ｇꎬ Ａｕｒｅｌｉｅ Ｃꎬ
Ｔｈｏｍａｓ Ｄꎬ Ｍｏｈａｍｍｅｄ Ｂ Ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅ￣
ｓｉｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｐｌｏｉｄ Ｒｏｓａ ｃｈｉｎｅｎ￣
ｓｉｓ ｃｖ Ｏｌｄ Ｂｌｕｓｈ[ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔꎬ
２０１０ꎬ １００: ７３－８１
[ ７ ] Ｌｌｏｙｄ Ｄꎬ Ｒｏｂｅｒｔｓ ＡＶꎬ Ｓｈｏｒｔ ＫＣ Ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ
ｖｉｔｒｏ ｏｆ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｓｈｏｏｔｓ ｉｎ Ｒｏｓａ[Ｊ] . Ｅｕｐｈｙｔｉｃａꎬ
１９９８ꎬ ３７: ３１－３６
[ ８ ] Ｂｕｒｇｅｒ ＤＷꎬ Ｌｉｕ Ｌꎬ Ｚａｒｙ ＫＷꎬ Ｌｅｅ ＣＩ Ｏｒｇａｎｏｇｅｎ￣
ｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙ￣
ｏｓ ｏｆ Ｒｏｓａ ｈｙｂｒｉｄａ Ｌ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓ Ｏｒｇꎬ
１９９０ꎬ ２１: １４７－１５２
[ ９ ] Ｒｏｓｕ Ａꎬ Ｓｋｉｒｖｉｎ ＲＭꎬ Ｂｅｉｎ Ａꎬ Ｎｏｒｔｏｎ ＭＡꎬ Ｋｕｓｈａｄ
Ｍꎬ Ｏｔｔｅｒｂａｃｈｅｒ ＡＧ Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｕｔａｔｉｖｅ
ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｓｈｏｏｔｓ ｆｒｏｍ ａ ｃｈｉｍｅｒａｌ ｔｈｏｒｎｌｅｓｓ ｒｏｓｅ
(Ｒｏｓａ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒａ Ｔｈｕｍｂ ｅｘ Ｊ Ｍｕｒｒ ) ｉｎ ｖｉｔｒｏ[Ｊ] .
Ｊ Ｈｏｒｔｉｃ Ｓｃｉꎬ １９９５ꎬ ７０: ９０１－９０７
[１０] 林毅雁 ‘月月粉’的再生及刺玫月季育种研究[Ｄ] .
北京: 北京林业大学ꎬ ２０１０
[１１] 陈雪ꎬ 张金柱ꎬ 潘兵兵ꎬ 桑成瑾ꎬ 马雪ꎬ 杨涛ꎬ 车
代弟 月季愈伤组织的诱导及植株再生[Ｊ] . 植物
学报ꎬ ２０１１ꎬ ４６ (５): ５６９－５７４
[１２] Ｄｏｈｍ Ａꎬ Ｌｕｄｗｉｇ Ｃꎬ Ｎｅｈｒｉｎｇ Ｋꎬ Ｄｅｂｅｎｅｒ Ｔ Ｓｏ￣
ｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｒｏｓｅｓ [ Ｊ] . Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃꎬ
２００１(５４７): ３４１－３４６
[１３] Ｌｉ ＸＱꎬ Ｋｒａｓｎｙａｎｓｋｉ ＳＦꎬ Ｋｏｒｂａｎ ＳＳ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅ ｕｉｄＡ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｓ ｏｆ
ｒｏｓｅ ｖｉａ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔａꎬ
２００２ｂꎬ ４０: ４５３－４５９
[１４] Ｆｉｒｏｏｚａｂａｄｙ Ｅꎬ Ｍｏｙ Ｙꎬ Ｃｏｕｒｔｎｅｙ￣Ｇｕｔｔｅｒｓｏｎ Ｎꎬ
Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｋ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｏｓｅ (Ｒｏ￣
ｓａ ｈｙｂｒｉｄａ) ｐｌａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｔｉｓｓｕｅ [ Ｊ] .
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ １９９４ꎬ １２: ６０９－６１３
[１５] Ｋｉｍ ＣＫꎬ Ｃｈｕｎｇ ＪＤꎬ Ｐａｒｋ ＳＨꎬ Ｂｕｒｒｅｌｌ ＡＭꎬ Ｋａｍｏ
ＫＫꎬ Ｂｙｒｎｅ ＤＨ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ￣ｍｅｄｉ￣
ａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｓａ ｈｙｂｒｉｄａ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ
ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ (ＧＦＰ) ｇｅｎｅ[ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓ Ｏｒｇꎬ ２００４ꎬ ７８: １０７－１１１
[１６] Ｓｏｕｑ Ｆꎬ Ｃｏｕｔｏｓ￣Ｔｈｅｎｅｎｏｔ Ｐꎬ Ｙｅａｎ Ｈꎬ Ｄｅｌｂａｒｄ Ｇꎬ
Ｍａｚｉｅｒｅ Ｙꎬ Ｂａｒｂｅ ＪＰꎬ Ｂｏｕｌａｙ Ｍ Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒ￣
ｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｏｓｅｓꎬ ２ ｅｘａｍｐｌｅｓ: Ｏｎｅ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ￣
ｅｓｉｓ Ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｏｎ ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈ￣
ｗａｙ[Ｊ] . Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃꎬ １９９５ꎬ ４２４: ３８１－３８８
[１７] Ｌｉ ＸＱꎬ Ｇａｓｉｃ Ｋꎬ Ｃａｍｍｕｅ Ｂꎬ Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ Ｗꎬ Ｋｏｒ￣
ｂａｎ ＳＳ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｏｓｅ ｌｉｎｅｓ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ａｎ ａｎｔｉｍｉ￣
ｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅꎬ Ａｃｅ￣ＡＭＰ１ꎬ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ｅｎ￣
ｈａｎｃｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ (Ｓｐｈａｅｒｏｔｈ￣
ｅｃａ ｐａｎｎｏｓａ) [Ｊ] . Ｐｌａｎｔａꎬ ２００３ꎬ ２１８: ２２６－２３２
[１８] 高莉萍ꎬ 包满珠 优化根癌农杆菌介导的月季‘萨
蔓莎’遗传转化系统的研究[ Ｊ] . 北京林业大学学
报ꎬ ２００５ꎬ ２７(４): ６０－６４
[１９] Ｙｕｋｉｈｉｓａ Ｋꎬ Ｍａｓａｋｏ ＦＭ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｓｅ
ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｇｅｎｅｒ￣
ａｔｅｄ Ｂｌｕｅ￣Ｈｕｅｄ ｆｌｏｗｅｒｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇ ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ
[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２００７ꎬ ４８ ( １１): １５８９ －
１６００
[２０] 毕玲ꎬ 刘凤鸾ꎬ 董爱香ꎬ 周晓阳ꎬ 马男ꎬ 赵梁军
狗蔷薇类原球茎遗传转化体系的建立[Ｊ] . 核农学
报ꎬ ２０１２ꎬ ６(２): ２７０－２７４
[２１] 林娅ꎬ 郑玉梅ꎬ 刘青林 影响愈伤组织诱导和分化
的因素[Ｊ] . 分子植物育种ꎬ ２００６ (４): ２２３－２２７
[２２] 高莉萍ꎬ 包满珠 月季‘萨蔓莎’愈伤组织的诱导及
植株再生[Ｊ]. 园艺学报ꎬ ２００５ꎬ ３２ (３): ５３４－５３６
(责任编辑: 刘艳玲)
７４１ 第 ２期 吕经娟等: ‘光叶蔷薇’器官间接再生体系的建立及 ＧＵＳ基因转化的初步研究