全 文 ：武汉植物学研究 2002, 20 (2) : 153～ 156
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
猕猴桃属植物线粒体D NA 片段 PCR-RFL P 研究初报Ξ
李林林　黄宏文ΞΞ
(中国科学院武汉植物研究所, 武汉　430074)
关键词: 猕猴桃属; 线粒体DNA ; PCR 2R FL P; 单元型
　　中图分类号: Q 943. 2　　　　　文献标识码: A 　　　　　文章编号: 10002470X (2002) 0220153204
PCR-RFL P Analys is on M itochondr ia l D NA of A ctin id ia
L I L in2L in, HUAN G Hong2W en3 3
(W uhan Institu te of B otany , T he Ch inese A cad emy of S ciences, W uhan　430074, Ch ina)
Abstract: T h irty2fou r taxa of A ctin id ia w ere invest iga ted th rough PCR 2R FL P analysis of tw o m i2
tochondria l DNA fragm en ts, including nad 1öB 2C gene and nad 4ö122 gene. D igest ion of these tw o
fragm en ts by seven rest rict ion endonucleases yielded tw en ty po lymo rph ic rest rict ion fragm en ts.
W e on ly found rest rict ion fragm en t length varia t ion cau sed by in sert ion o r delet ion. It suggests
tha t m tDNA restrict ion length po lymo rph ism cou ld be an eff icien t ind ica to r fo r con servat ion
b io logy.
Key words: A ctin id ia; M itochondria l DNA (m tDNA ) ; PCR 2R FL P; H ap lo type
　　猕猴桃属 (A ctin id ia ) 植物, 全世界有 66 个种,
约 118 个种下分类单位 (变种、变型) [1 ]。近来通过对
猕猴桃属植物的细胞质DNA 研究证实, 该属植物
细胞质DNA 为单亲遗传, 其线粒体DNA 为严格的
母性遗传[2 ] , 这一单亲遗传特性为研究猕猴桃属植
物分类及系统学提供了新的途径。在高等植物中, 由
于线粒体DNA 的高度保守, 以及重排率高而突变
率低, 加之在植物组织中的含量较低, 限制了它在系
统学研究中的应用, 不适合属以上高阶元间的比较
研究[3 ] , 但线粒体DNA 序列进化速度快, 在近缘种
内或种间显示出了更大的变异性, 并且线粒体DNA
的大小和单亲遗传的特点使之成为属下水平分类群
的 R FL P 分析的有效研究对象[4 6 ]。目前猕猴桃属
植物DNA 水平上的系统学和多样性研究主要是以
核DNA 和叶绿体DNA 为主, 至今未见有关于线粒
体DNA 方面的研究报道[1 ]。然而, 最近对猕猴桃属
部分分类群的 cpDNA 的 R FL P 分析表明, 基于叶
绿体DNA 研究的属下系统关系对传统的分组和分
系支持度很低, 但是受其变异位点少等局限, 未能提
供该属分组分系的有效分子遗传学依据[7 ]。从现有
猕猴桃属系统学研究的进展来看, 不论从细胞遗传
学水平还是DNA 水平上的研究都不能很好的解决
猕猴桃属植物分类系统中存在的属下分组混乱及某
些种间界限模糊等问题, 因此从线粒体DNA 的母
性遗传角度来研究猕猴桃属植物的系统发育和遗传
多样性, 已经成为一个必要的途径。本研究选用了 2
个常用于植物遗传学和系统学研究的线粒体基
因——nad 1 和 nad 4[2, 8 ]和 7 个限制性内切酶, 对猕ΞΞΞ 通讯作者。E2m ail: hongw en@public. w h. hb. cn收稿日期: 2001206211, 修回日期: 2001207219。基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30070082) ; 中国科学院资源与生态环境研究重点项目 (KZ9522J12102) ; 中国科学院生命科学与　　　生物技术青年科学家小组资助; 欧盟项目 (IN CO 2DC IC18CT 970183) ; 国家重点基础研究发展规划项目 (G2000046806)。　　　作者简介: 李林林 (1975- ) , 女, 硕士研究生, 从事分子生物学研究。
猴桃属植物 34 个分类群进行 PCR 2R FL P 分析, 试
图利用猕猴桃属植物线粒体DNA 的严格母性遗传
的特点, 拓展可用于猕猴桃分子系统学的遗传信息
范围, 为该属的分子生物学研究提供一个新的研究
途径。
1　材料和方法
本研究所用的试验材料均采于中国科学院武汉
植物研究所猕猴桃种质资源圃 (资源圃保育的全部
材料采自各物种自然分布区) , 共取样 34 个分类群
(表 1)。除山梨猕猴桃 (A . ruf a) 引自日本外, 其他
物种均原产中国。
植物基因组总的DNA 的提取采用新鲜叶片,
根据W eising 的CTAB 方法[9 ]进行。PCR 扩增反应
是在 PE 公司制造的 9600 型 PCR 仪上进行, 反应
表 1　试验材料
T able 1　T he o rigins of the m ateria ls
物种名称
T axon
自然分布区
D istribu tion
对萼 A . va lva ta 主产华东, 浙江、江西、湖南、湖北、安徽、广东
河南 A . henanensis 河南
阔叶 A . la tif olia var. la tif olia 江西、安徽、浙江、福建、湖南、贵州、云南、广西、广东
毛花 A . eria tha var. erian tha 浙江、福建、湖南、江西、广西、广东
清风藤A . sabiaef olia 福建、江西、湖南、安徽
繁花 A . p ersicina 福建
黑蕊 A . m elanand ra var. m elanand ra 浙江、江西、福建、湖北、四川、陕西、甘肃
秃果毛花 A . erian tha var. ca lvescens 广西桂林
大籽 A . m acrosp erm a var. m acrosp erm a 江西、江苏、浙江、安徽、湖北、广东
两广 A . liang g uang ensis 两广交界
江西 A . j iang x iensis 江西
桂林 A . g u ilinensis 广西桂林
白色毛花 A . erian tha f. a lba 福建、浙江
网脉 A . cy lind rica var. reticu la ta 广西、贵州
毛叶硬齿 A . ca llosa var. strig illosa 贵州、广西、湖南省区交界
京梨 A . ca llosa var. henry i 长江以南地区、云南、广西、湖北、湖南、安徽、福建、浙江
葛枣 A . p oly g am a 东北、甘肃、陕西、山东、河南、湖南、四川、浙江、云南、贵州
绵毛 A . f u lv icom a f. lana ta 江西、湖南、贵州、福建、云南、广东、广西
浙江 A . z hej iang ensis 浙江、江西
密花 A . ruf otricha var. g lom era ta 广西西北、贵州
华南 A . g laucop hy lla var. g laucop hy lla 广东、广西、湖南
中越 A . ind och inensis 广东、广西、云南
梅叶 A . m acrosp erm a var. m um oid es 安徽、江苏、江西、浙江
软枣 A . arg u ta var. arg u ta 东北、河南、河北、浙江、云南、安徽、福建
安息香 A . sty racif olia 湖南、福建
金花 A . ch ry san tha 广西、广东、云南
异色 A . ca llosa var. d iscolor 浙江、安徽、福建、江西、湖南、四川、贵州云南
山梨 A . ruf a 原产日本
粉毛 A . f u rinosa 广西
团叶 A . g laucop hy lla var. rotund a 广西大新
柱果 A . cy lind rica f. cy lind rica 广西
长叶 A . hem sley ana var. hem sley ana 浙江、福建、江西
中华 A . ch inensis 湖北、湖南、河南、安徽、江苏、浙江、江西、福建、广东、广西
美味 A . d eliciosa 云南、广西、甘肃、湖北、湖南、四川、贵州
　　注: 实验材料取自中国科学院武汉植物研究所。
N o te: M ateria ls w ere ob tained from W uhan Institu te of Bo tany , T he Ch inese A cadem y of Sciences.
451 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　 　第 20 卷　　
体积为 25 ΛL , 内含 5 mmo löL M gC l2, 5 mmo löL
dN T P, buffer, 1U T aq酶, 总DNA , 引物各18 pmo l。
以 nad 1 和 nad 4 为目的片段, 进行扩增, 扩增采用
特 定 的 引 物 对 nad 1öB 2C 和 nad 4ö122 [8 ] ,
引物 nad 1öB 的 序 列 为 5‘2GCA T TA CGA TCT 2
GCA GCTCA 23‘, 引 物 nad 1öC 的 序 列 为
5‘2GGA GCTCGA T TA GT T TCT GC23‘, nad 4ö1 的
序列为 5‘2CA GT GGGT T GGTCT GGTA T G23‘, 引
物 nad 4ö2 的 序 列 为 5‘2TCA TA T GGGC2
TA CT GA GGA G23‘。扩增程序为: 95℃ (1 m in) →
93℃ ( 45 s ) ; 5715℃ ( 45 s ) ; 72℃ ( 90 s ) ; 30 个
循环→72℃ (4 m in ) → 10℃ (20 m in)。扩增产物
用H inf É、H aeË、H haÉ、A luÉ、B stoÉ、M sp É
和N d eÉ 7 个限制性内切酶进行酶切, 酶解反应体
积为 10 ΛL。内含 5 ΛL 的 PCR 产物, 5 U 的限制性
内切酶和 1×内切酶缓冲液。酶解反应时间为 12 h,
其中B stoÉ 在 65℃下反应 4 h。酶解产物在 8% 的垂
直板聚丙烯酰胺电泳胶中电泳, 电泳缓冲液为
1×TBE, 电压为 5 V öcm , 电泳时间是 3 h。电泳结束
溴化乙锭 (EB ) 染色后在透射紫外仪上观察, 照相
记录。
2　结果和讨论
PCR 扩增反应结果: 扩增出猕猴桃属植物的
nad 1 基因片段长度为 1 565 bp , nad 4 基因片段长度
为 2 061 bp。各个分类群扩增出来的片段长度没有
多态性。分别用上述的 7 个限制性内切酶对 2 个基
因进行酶切, 结果 nad 1 基因和 nad 4 均有 6 种酶有
限制性片段长度多态性, 它们是H inf É、H aeË 、
H haÉ、A luÉ、B stoÉ 和N d eÉ。2 个基因酶切结果
共得到 63 条酶切片段, 其中有 43 条片段为 34 个分
类群所共有; 研究中没有发现在猕猴桃属植物线粒
体DNA 上存在点突变 (即在限制性内切酶的识别
位点上发生的碱基替换) , 只发现了由于碱基的插入
或缺失而造成的长度变异, 共有 20 条酶切片段具多
态性 (见表 2) , 其多态性的表现形式为DNA 片段的
有无。
随着DNA 标记技术的发展, R FL P 分析技术
已经广泛应用于系统学和分子水平遗传多样性研
究。而线粒体DNA 在动、植物中不同的特点, 使得
线粒体DNA 的R FL P 多态性分析成为动物系统学
和生物多样性的一个有力工具[10 ]。有学者对植物线
粒体 DNA 多态性进行了研究 [4 6 ] , 例如, 朱世华
等[5 ]利用线粒体DNA 多态性对普通野生稻和亚洲
栽培稻的遗传变异和分布的分析, 孙全清等[6 ]利用
线粒体DNA 多态性对稻属的系统发育和亲缘关系
的研究等, 在植物线粒体DNA 方面取得了一定进
展。Strau ss 等[11 ]在利用线粒体DNA 的R FL P 对松
属 3 个物种共 19 个居群的多样性研究时指出,
m tDNA 的多态性在居群多样性的研究中是一个很
好的分子标记。这些研究都证明了植物线粒体DNA
在系统发育关系和生物多样性的研究中同样具有很
重要的意义。同时基于线粒体DNA 分子系统发育
关系的研究在生物保护中也具有很重要的作用。
表 2　猕猴桃属线粒体D NA 2 对引物酶
切片段长度多态分布
T able 2　R estrict ion fragm ent length varia t ion caused
by insert ion o r delet ion found at tw o m itochodria l
DNA regions in A ctin id ia
序号
N o. m tDNA
限制性内切酶
R estrict ion
endonucleases
由插入或缺失引起的
变异片段长度
R estrict ion fragm ent
length varia t ion
(bp )
1 nad 1 H inf É 329
2 nad 1 H inf É 217
3 nad 4 H inf É 648
4 nad 1 H aeË 185
5 nad 4 H aeË 632
6 nad 4 H aeË 450
7 nad 1 H ha 410
8 nad 1 H ha 309
9 nad 1 H ha 201
10 nad 4 H ha 242
11 nad 4 H ha 180
12 nad 1 A luÉ 72
13 nad 4 A luÉ 404
14 nad 4 A luÉ 309
15 nad 1 B stoÉ 218
16 nad 1 B stoÉ 81
17 nad 4 B stoÉ 309
18 nad 1 N d eÉ 201
19 nad 4 N d eÉ 622
20 nad 4 N d eÉ 404
　　本研究发现的猕猴桃属植物线粒体DNA 的多
态性, 将有利于证实近缘种之间具有相同的限制性
酶切片段, 从而找出它们在某一段DNA 上核酸序
列的相似性, 探讨某些物种之间的亲缘关系。利用
DNA 限制性酶切片段长度的多态性确立植物分类
单位的单元型及其分布规律[12, 13 ]在植物遗传多样
性评价及保育遗传学中也具有重要意义[11 ]。本研究
结果表明, 有些物种具有相同的线粒体DNA 酶切
片段, 将可用于研究猕猴桃属植物的单元型分布, 并
551　第 2 期　　　　　　　　　　李林林等: 猕猴桃属植物线粒体DNA 片段 PCR 2R FL P 研究初报
可进一步探讨造成物种形成不同单元型的原因。猕
猴桃属植物在形态学、染色体倍性、同工酶水平上具
有丰富的遗传多样性[1 ] , 本研究结果也为利用线粒
体DNA 酶切片段长度的多态性分析来研究猕猴桃
属植物种间遗传多样性分布格局, 探讨线粒体DNA
的多态性在该属植物的遗传资源保育中的应用提供
了新途径[14 ]。
参考文献:
[ 1 ]　黄宏文, 龚俊杰, 王圣梅, 等. 猕猴桃属植物的遗传多
样性. 生物多样性, 2000, 8 (1) : 1 12.
[ 2 ]　T esto lin R , C ip rian i G. Paternal inheritance of
ch lo rop last DNA and m aternal inheritance of m ito2
chondria l DNA in the genus A ctin idia. T heor A pp l
Genet, 1997, 94: 897 903.
[ 3 ]　Palm er D J. M itochondria l DNA in p lan t system a2
t ics: app licat ions and lim ita t ions. In: So lt is P S,
So lt is D E. Doyle J J eds. M o lecu lar System atics of
P lan ts. N ew Yo rk, L ondon: Chapm an and H all,
1992, 36 49.
[ 4 ]　L uo H , Coppeno lle V B , Segu in M , et a l. M itocon2
dria l DNA po lymo rph ism and phylogenetic rela t ion2
sh ip s in H evea brasiliensis. M olecu ler B reed ing ,
1995, 1: 51 63.
[ 5 ]　朱世华, 汪向明, 王明全. 中国普通野生稻线粒体
DNA 的限制性片段长度多态性. 宁波大学学报 (理
工版) , 1998, 11 (4) : 11 16.
[ 6 ]　孙全清, 王象坤, 吉村淳, 等. 普通野生稻与亚洲栽培
稻线粒体DNA 的 R FL P 分析. 遗传学报, 1998, 25
(1) : 40 45.
[ 7 ]　C ip rian i G, T esto lin R , Gardner R. R estrict ion2site
varia t ion of PCR 2amp lified ch lo rop last DNA regions
and its imp licat ion fo r the evo lu tion and taxonom y of
A ctin id ia. T heor A pp l Genet, 1998, 96: 389 396.
[ 8 ]　D em esure B , Sodzi N , Petit R J. A set of un iversal
p rim ers fo r amp lificat ion of po lymo rph ic non2coding
region of m itochondria l and cho rop last DNA in
p lan ts. M olecu lar E cology , 1995, 4: 129 131.
[ 9 ]　W eising K, N ybom H ,W o lff K, et a l. DNA F inger2
p rin ting in P lan ts and Fungi. Boca R aton, F lo rida,
U S: CRC P ress, 1995. 50 54.
[ 10 ]　李祥龙, 刘金福. 动物线粒体DNA 的 R FL P 在家养
动物遗传多样性研究中的应用. 河北农业技术师范
学院学报, 1998, 12 (1) : 55 60.
[ 11 ]　Strauss S H , Hong Y P, H ipk ing V D. H igh level of
popu lat ion differen tia t ion fo r m itochondria l DNA
hap lo types in P inus rad ia ta , m u rica ta , and a ttenua2
ta. T heor A pp l Genet, 1993, 86: 605 611.
[ 12 ]　M archelli P, Gallo L , Scho lz F, et a l. Ch lo rop last
DNA m arkers reveal a geograph ical divide acro ss A r2
gen tinean sou thern beech N othof ag us nervosa
(Ph il. ) D im. et M il. distribu tion area. T heor A pp l
Genet, 1998, 97: 642 646.
[ 13 ]　Tozuka A , Fukush i H , H irata T , et a l. Compo site
and clinal distribu tion of G ly cine soja in Japan re2
vealed by R FL P analysis of m itochondria l DNA.
T heor A pp l Genet, 1998, 96: 170 176.
[ 14 ]　Balfourier F , Im bert C, Charm et G. Evidence fo r
phylogeograph ic structu re in L olium species rela ted
to the sp read of agricu ltu re in Europe. A cpDNA
study. T heor A pp l Genet, 2000, 101: 131 138.
651 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　 　第 20 卷