全 文 ：武汉植物学研究 2004，22(4)：359～363
Journal of Wuhan Botanical Research
培养基成分对杜仲愈伤组织生长及
次生代谢产物含量的影响
李 琰 ，张朝红 ，马希汉
(1．西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌 712100t 2．西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100)
摘 要 ：以Bs+ 0．5 mg／L NAA + 0．5 mg／L BA为基本培养基，研究了 B 培养基中 8种主要无机盐浓度对杜仲
愈伤组织生长及绿原酸和总黄酮两种次生代谢产物含量的影响。结果表明：在1 OOO～5 000 mg／L范围内增加培养
基中KNO。的含量有利于愈伤组织生长，Bs培养基中当KNO。的浓度达到 z／3时，绿原酸和总黄酮含量及产量最
高 ；(NH．)：SO．以 4／3原浓度时对愈伤组织生长量、总黄酮含量及产量最高，对绿原酸的含量则是其为原浓度的
1／3时最高；MgSO．以 2[3浓度对生长量及 1／3浓度对绿原酸、总黄酮积累最高tNaH：PO．、CaCI：和 MnSO．以原浓
度的愈伤组织生长和次生代谢产物合成最好；ZnSO．和FeSO．的原浓度愈伤组织的生长量最大，而 1／3浓度的绿
原酸和总黄酮含量最高。
关键词：杜仲；组织培养；无机盐；次生代谢产物
中图分类号：Q946．8t$722．37 文献标识码：A 文章编号：1000—470X(2004)04—0359—05
Effects of M edium Concentration on Callus Growth and
Secondary M etabolites of Eucommia ulmoides
LI Yan ，ZHANG Zhao—Hong。。M A Xi—Han
(1．College of Life Science，No~hwest Sci—Tech University of Agriculture and Forestry，Yangling，Shaanxi 712100，Chinat
2．College of Horticulture，No~hwest Sci—Tech University of Agriculture and Forestry，Yangling，Shaanxi 712100，China)
Abstract：The effects of medium concentration on callus growth and the accumulation of chloro—
genic acid and flavonoids of Eucommia ulmoides were investigated．The treatments were designed
n B5 medium supplemented with 0．5 mg／L NAA + 0．5 mg／L BA．The results showed that the
callus growth was increased when KNO3 content was increased，whereas chlorogenic acid and
flavonoids contents were highest when KNO3 concentration waS 2／3 of original amount in Bs
medium．The 4／3 content of(NH4)2SO4 in Bs medium were best for the callus growth and
flavonoids content and yield，whereas chlorogenic acid content was highest when(NH4)2SO4 con—
tent was 1／3 of original amount in Bs medium．The callus growth was highest when MgSO4 con—
centration was 2／3，whereas chlorogenic acid and flavonoids contents were highest when MgSO4
content was 1／3 in Bs medium．The original content of NaH2PO4，CaC12 and MnSO4 in B5 medium
were best for the callus growth and the accumulation of chlorogenic acid and flavonoids．The con—
tents of ZnSO4 and FeSO4 in Bs medium Was best for the callus growth but chlorogenic acid and
flavonoids contents waS highest when ZnSO4 and FeSO4 concentration was 1／3 in Bs medium．
Key words：Eucommia ulmoides；Tissue culture；Salt；Secondary metabolites
杜仲(Eucommia ulmoides Oliv．)为我国特有经 济林木，也是一种名贵的药用植物，具有补肾壮阳和
收稿 日期 ：2003—12—03，修回日期；2004—06—07。
基金项目；国家。十五 攻关项目(2oo1BA5o2Bo4o3)及西北农林科技大学青年科研专项部分内容。
作者简介 ；李琰(1971一)，女，硕士，讲师，主要从事植物学及药用植物学的教学和研究。
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36O 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
抑制肿 瘤等 作用，特 别是对 血压有双 向调节作
用 h z-。杜仲的药用成分主要为木脂素类、环烯醚萜
类、黄酮类、松脂素二糖甙、绿原酸等次生代谢产物，
其中松脂素二糖甙、黄酮类、绿原酸等为杜仲降血压
的主要成分 。1]。目前上述次生代谢产物主要从树
皮中提取 ，但是，杜仲树生长缓慢，且剥皮对树的生
长有影响 引，为了更有效地保护杜仲种质资源，采用
组织培养技术 ，在组织和细胞水平上促成杜仲有效
次生代谢产物的生物合成，就可以在不受田间条件
制约的情况下 ，进行以杜仲次生代谢产物为目的的
细胞培养 。
培养基的组成成分对植物细胞生长和次生代谢
产物的形成有很大的影响，这已被人们所重视，从而
在组织培养中设计出一系列的高盐、高氮、中盐、低
盐等各种类型培养基[el，这些培养基其营养元素的
配合 比率是沿用 Konp氏(1860年)植物水培的营
养液配方修改而成的。但是每种离体培养的植物组
织和细胞的生长和代谢，所需要的无机元素浓度常
有所差异。关于不同材料对各营养元素的最适需求
问题 ，尚在不断进行探索之中。比如在紫草细胞培养
中，增加培养基中的Cu。+含量能大幅度提高紫草宁
的合成[7]。关于培养基中无机盐对杜仲次生代谢产
物的影响方面的研究，张檀等[8]从植株水平作过报
道，但离体培养和植株水平的生长和代谢方面有较
大差异，在组织培养中尚未见到这方面的报道。笔者
主要研究培养基中 8种主要无机盐浓度对杜仲愈伤
组织的生长和次生代谢产物含量的影响，以期为杜
仲大规模细胞培养生产次生代谢产物奠定基础。
l 材料和方法
杜仲茎段愈伤组织诱导参照文献E9]的方法，诱
导 出的愈 伤 组织 ，再 经 B + o．5 mg／L NAA+
0．5 mg／L BA的培养基继代 2次后用作试验材
料[1。。试验以添加 0．5 mg／L NAA+0．5 mg／L BA
的B 培养基为基础，研究某一成分时将培养基中相
应的盐设计成浓度梯度，培养基其他成分不变。培养
基中加入蔗糖 30 g／L，用琼脂 6 g／L固化，pH值用
PHS一2C型酸度计高压灭菌前调至 6．3。试验每个处
理接种 2O瓶，每瓶接种大小基本相近的愈伤组织 3
块，鲜重控制在0．3O～O．40 g之间。培养条件在温度
(25±2)℃，光照12 h／d，光照强度1 000~1 500 Ix下
培养。培养 20 d后收获 ，计算愈伤组织增长量。
计算方法为：愈伤组织增长量 一 收获量／瓶一
接种量／瓶。
愈伤组织中次生代谢产物的提取是先将收获的
愈伤组织于烘箱中80"C烘至恒重，粉碎后精确称取
1 g放入烧瓶中，每次加入 16 mL 6O 酒精于 8O℃
水浴中冷凝回流提取 2次，每次 1 h，抽滤，合并滤液
定容至 5O mL备用。绿原酸的测定采用反相高效液
相色谱 (HPLC)法[1 。色谱条件为：色谱柱 Nova—
pak C18柱(4 m，3．9 mm×75 mm)，流动相 ：甲酸
：水 ：冰乙酸(19；8O：1)；流速 ：1 mL／min；检测
波长：324 nm；总黄酮的测定采用硝酸铝一亚硝酸钠
比色法L1引。取提取液1 mL于10 mL容量瓶中显色，
用UV一2000紫外可见分光光度计在510 nm比色。
2 结果与分析
2．1 大量元素对愈伤组织生长和次生代谢产物含
量的影响
培养基中的 KNO3在 1 000 5 000 mg／L范围
内愈伤组织鲜重随着 KNO。浓度的增加而明显增
加 (表1)，而干重在2000mg／L浓度以上差异不明
表 1 KNO 对愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响
Table 1 Effects of KNOs on callus growth and secondary metabolites products
注：均值后字母不同表示差异显著，小写与大写字母分别表示 5 和 1 的显著水平，下表同。
Notes：Means which are significantly are folowed letters，smal and large letters indicate the different at 5 and 1
levels respectively．The following tables are just the same．
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第 4期 李 琰等：培养基成分对杜仲愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响 361
显。当 KNO。浓度为 2 000 mg／L时，绿原酸的含量
和产量极显著地大于其他浓度。黄酮含量和产量以
2 000 3 000 mg／L的浓度相对较高。可见，愈伤组
织的生长和绿原酸及黄酮的积累对 KNo。浓度的
要求不同。
(NH。)2SO。在 134～179 mg／L的范围内愈伤
组织的增长量极显著高于其他浓度，而绿原酸的含
量以 45 mg／L最高，并随(NH。) SO 浓度升高而下
降。由于绿原酸的生长量和含量对(NH。)2SO 需求
的差异，因而使产量在 45～179 mg／L范围内差异
较小。黄酮的含量和产量与愈伤组织生长所需的
(NH。)2SO。浓度相似 ，即以 179 mg／L最好(表 2)。
MgSO。以 334 mg／L时愈伤组织生长最好，而
绿原酸的含量和产量均以 167 mg／L MgSO 最高 ，
并随浓度升高而逐渐降低。黄酮含量和产量分别以
低浓度的167 mg／L和 334 mg／L MgSO。明显高于
其他浓度，也随浓度升高而下降。可见，2种次生代
谢产物的积累均以低于B 培养基原浓度的 MgSO。
有利，高于原浓度后有抑制作用(表 3)。
增加和减少 B 培养基中 NaH。PO 浓度都显著
地抑制了愈伤组织生长和绿原酸产量及总黄酮的形
成 ，这说明B 培养基中 NaH。PO。浓度对杜仲愈伤
组织生长和次生代谢产物的合成最适宜(表 4)。
CaC1z在试验的 5O～250 mg／L范围内对愈伤
组织生长影响不明显，对次生代谢物有极显著影响，
但仍以B 培养基中原浓度 150 mg／L最好(表 5)。
表 2 (NH．)：SO．对愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响
Table 2 Effects of(NHD2SO4 on callus growth and secondary metabolites products
表 3 MgSO．对愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响
Table 3 Effects of MgSO(on callus growth and secondary metabolites products
表 4 NailzPO．对愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响
Table 4 Effects of NaHzPO(on callus growth and secondary metabolites products
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362 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
表 5 CaCI 对愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响
Table 5 Effects of CaC1 2 on callus
．
growth and secondary metabolites products
2．2 微量元素对愈伤组织生长和次生代谢产物含
量的影响
FeSO．、MnSO 和 ZnSO 为培养基提供微量元
素的无机盐，它们以 B 培养基中本身的浓度最有利
于愈伤组织的生长。在 9．28~46．42 mg／L范围内，
随着 FeSO．浓度升高，绿原酸的含量和产量则极显
著下降，黄酮以低于 B 本身 FeSo 浓度的含量高，
以B 本身FeSO 浓度产量最高(表6)。B 培养基中
MnSO．浓度不仅对愈伤组织生长有利，而且对绿原
酸和总黄酮的积累也最有利(表 7)。在试验浓度内，
随 ZnSO 浓度增加，愈伤组织中绿原酸和总黄酮积
累也明显下降(表 8)。
表 6 FeSO．对愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响
Table 6 Effects of FeSO‘on callus growth and secondary metabolites products
M nSO·
concentration
(mg／L)
增长量 Increment
鲜重 (g)
Fresh weight
(g／flask)
干重 (g)
Dry weight
(g／flask)
绿原酸含量(％)
Chlorogenic
acid contents
绿原酸产量(mg) 黄酮含量( ) 黄酮产量(mg)
Chlorogenic Flavonoids Flavonoids
增长量 Increment
ZnSO． — — 绿原酸含量(％) 绿原酸产量 (mg)
concentration 鲜重 (g) 干重 (g) Chlorogenic Chlorogenic
(mg／L) Fresh weight Dry weight acid contents acid yield
(g／flask) (g／flask)
黄酮含量(％) 黄酮产量 (mg)
Flavonoids Flavonoids
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第4期 李 琰等：培养基成分对杜仲愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响 363
3 讨论
利用植物组织培养生产次生代谢产物的关键在
于提高愈伤组织的生长量和增加次生代谢产物的含
量，其可以通过愈伤组织来源、培养基中的营养物质
含量、植物激素、培养条件等多个方面进行优化而实
现[1引。在培养基的营养物质含量中，各种无机盐的
浓度是一个重要方面。一般来讲无机盐浓度较高时
比较适合于愈伤组织的生长 ，无机盐浓度较低时比
较适合于次生代谢产物的积累。本试验中增加 B 培
养基中 KNo。的含量有利于愈伤组织生长，而 2／3
B 培养基的KNo。最利于绿原酸和总黄酮的积累；
MgSO．以低于 B 培养基的浓度对愈伤组织生长和
绿 原 酸、总黄 酮 的 积 累 为 好；以 B 培 养 基 中
(NH．)。SO．、CaCI。和 MnSO 浓度最有利于杜仲愈
伤组织生长和次生代谢产物的合成；B 培养基中
ZnSO．和 FeSO．的浓度虽然对杜仲愈伤组织的生
长最好，但以 1／3 B 培养基的浓度的绿原酸和黄酮
的积累最高。这些结果进一步证实了愈伤组织生长
和次生代谢产物积累对无机盐浓度需求差异的一般
规律。造成这种差异主要是因为细胞的快速生长与
细胞的初生代谢相联系，而初生代谢过程及细胞的
生长需要大量的化合物来参与；而次生代谢是植物
在逆境条件下产生的一种保护剂或废弃物，极少参
与到细胞的构造中去，它们往往是在细胞停止生长
或停止分裂时积累较多，或者，它们的积累导致了细
胞的生长停滞。由于这种差异的存在，人们在增殖细
胞数量和生产次生代谢产物时常选用不同盐浓度的
培养基。日本山田康之等在大量研究的基础上，建立
起了紫草细胞培养的生长培养基 MG一5及生产紫草
宁培养基 M一9，这两种培养基的最大差别是：MG一5
培养基中无机盐的浓度远远高于M一9培养基[1‘。因
此 ，用组织培养法生产杜仲次生代谢产物时，由于愈
伤组织生长和次生代谢产物的积累也存在这种对无
机盐浓度要求的差异，也需要采用二步培养法，即先
在无机盐浓度较高的生长培养基上快速繁殖培养材
料，即增加细胞的生物量，然后把材料转移到无机盐
浓度较低的生产培养基上生产次生代谢产物。但愈
伤组织的生长和次生代谢产物积累是多种盐共同作
用的结果，本试验仅分别对各个无机盐成分单独进
行试验，各种成分之间的交互作用及其最优化培养
基还需要进一步研究。
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