全 文 ：第 2 卷
V o l
.
2 N o
.等1 期 草 地 学 报A C T A A G R E S T IA SIN CA 1 9 9 4 年1 9 9 4
紫花首蓓原生质体培养与植株再生
舒文华 耿华珠 孙勇如
(中国农科院畜牧所 , 北京 , 1 0 0 0 9 4 ) (中国科学院遗传所 , 北京 , 1 0 0 1 0 1 )
摘要 : 由和 田首楷和单选首楷叶肉分离原生质体 , 采用改良的 K护 和 M S 培养基进行液
体浅层培养 。原生质体经一次分裂 , 二次分裂和多次分裂 , 形成小细胞团 , 并很快长成小愈伤组
织 。 愈伤组织在 M S 分化培养基上增殖并分化 , 产生小植株 , 经 M S 无激素培养基生根形成完
整的再生植株 。
关键词 : 紫花首稽 ; 叶肉 ; 原生质体培养 ; 植株再生
1 前言
紫花首蓓 (Me di ca g 。 : at iv 。 L
.
)是重要的牧草之一 , 具有高产优质的特点 , 被誉为 “牧
草之王” 。 首楷属 内有 60 余个种 ,具有丰富的遗传资源 。 一般野生首糟在抗逆性 、适应性等
方面均优于栽培的紫花首楷 , 如果将其优良性状转到后者 ,就能进一步扩大紫花首楷的种植
范围 ,提高其产草量 , 更好地为生产服务 。但常规的有性杂交往往得不到种子或杂种不育 , 存
在着亲本不亲和现象 。生物技术的发展促进了远缘间遗传物质的重组研究 , 细胞融合是解决
亲本不亲和的有效手段之一 (G ilm o u r , D . M . 1 9 5 7 ; G ilm o u r , D . M . 2 9 5 9 . ) 。 原生质体是去掉
细胞壁的细胞 , 采用化学方法或电融合 , 可将不同来源的原生质体融合到一起 , 经过进一步
选择培养 , 可形成杂种细胞 , 最后得到杂种后代 。 因此 , 有必要开展首楷原生质体培养的研
究 。
早在 70 年代末 , K . N . K ao 等就利用紫花首楷叶片分离原生质体并再生植株 (K . N.
K a 。 , 1 9 8 0 ) , 随后有许多科学家 , 先后从首楷子叶 、根和悬浮细胞系等分离原生质体并再生
植株 (尹光初等 , 1 9 9 0 ) 。 1 9 8 9 年 , G ilm o u r , D . M . 等将 M . : a tiv a 的原生质体分别和 M .
b o re a lis
、
M
.
fa l
c a t a
、
M
.
q u a sifa l
e a ta 等的原生质体融合 , 并获得愈伤组织 (D . M . G ilm o u r ,
1 9 8 7
,
1 98 9 )
。 中国的首箱原生质体培养工作开展较晚 。 1 9 8 2 年 , 吕德阳和许智宏在英国利用
K
S
P 培养基 , 分别得到首楷子叶和根原生质体的再生植株 , 所用材料均为外国品种 (D . 丫
L u
,
1 9 5 3
.
2
.
H
.
X u
, 1 9 5 2 )
。
2 9 9 0 年 , 黄绍兴利用 K sP 培养基得到保定首蓓子叶原生质体的
再生植株 , 这是 目前利用中国首箱品种成功地进行原生质体培养的唯一报道 (黄绍兴 ,
1 9 9 0)
, 但尚无首蓓原生质体融合的报道 。 本试验是以中国首楷材料进行原生质体培养的研
究 , 旨在为首蓓原生质体融合和培育新品种打下基础 。
2 材料和方法
2
.
1 植物材料 选用和田首楷和单选首楷 , 种子由中国农科院畜牧所繁殖 。 1 9 9 1 年 10 月 7
日将上述两材料的种子分别播种于花盆中 , 置于 自然光照下 , 温度 20 ~ 2 ℃ 。 一个月后 , 待
植株长到 15 厘米左右 , 取顶部鲜绿色长约 1 厘米左右的叶片 , 用来分离原生质体 。
2
.
2 方法
2
.
2
.
1 原生质体游离 将叶片用 70 %酒精浸泡 3一 5秒 , 立刻用无菌水冲洗 2遍 , 置于
第 1 期 舒文华等 : 紫花首箱原生质体培养与植株再生
0
.
1 %升汞 中消毒 15 分钟 , 再用无菌水冲洗
4 ~ 5 遍 。 剥去 叶片下表皮 , 置于酶液中酶解 。
所用酶液组成为 : R 一 1 0 纤维素酶 (C ellu la s e ,
O n o z u k a R
一
1 0 ) 2 %
,
R
一 1 0 果 胶 酶
(M a e e r o z y m e R
一1 0 )0
.
5 %
, 0
.
6 m o l CPW 溶
液 (表 1 )p H 5 . 8 。
在温度 25 士 1 ℃下 , 酶解 4 个小时 , 利用
4 0 0 目尼龙网过滤 , 除掉杂质 。 将该原生质体
悬浮液离心 (5 0 r p m , 2 分钟 ) , 除去上清液 ,
再经 0 . 6 m ol CPw 溶液和原生质体培养基
各洗涤离心 2 次 , 得到纯化的原生质体 。
表 1 C PW 溶液组成
T a b le 1 A mo
u n t a n d eo m P o u n d o f C PW
s o lu tio n
数量 A m o u n t 成份 C o m p o u n d
2 7
.
2 m g / L K H : PO ;
10 1 m g / L K N O 3
14 8 0 m g /L C a C I:
·
2 H 2 0
2 4 6 m g / L M g S O ;
·
7 H 2 0
0
.
1 6 m g / L K l
0
.
0 2 5 m g / L C u SO 。
·
5 H 2 0
5 8 0 m g / L M E S
1 1 0 9 / L M a n ni to l
2
.
2
.
2 原生质体培养 利用改良的 K sP 培养基和 M S 培养基 (表 2) , 将纯化的原生质体稀
释 , 使密度达到 1 又 1 0丫m l左右 , 接种在直径 3 厘米的小培养皿中 , 每皿 Z ml , 用 Pa ra fil m
胶带封 口 , 置于暗处 ,进行静止培养 , 温度 25 士 1 ℃ 。
表 2 原生质体培养墓
T a b le 2 Pr o to Pla s t e u ltu r e m e d iu m
激素
p hy t o h o r m o n e s
培养基
(m e d iu m )
(m g / L )
2
, 4 一D
K sP
一
1 K sP
一
2 K . P
一
3 K sP
一
4 K sP
一
5 M S
一
1 MS
一
2
011
.
0
,口匕
. .100
·
1
.
K SP + 谷氨酞胺 (L 一G lu t am i n e ) 2 0 m g / L ; 荀萄糖 ( G lu e o s e ) 0 . 6 m o l, p H 5 . 8 .
2
.
M S + 谷氨酞胺( L 一G lu ta m in e ) 2 0 m g / L ; 天门冬酞胺 (L 一A s p a r a g in e ) 2 0 m g / L ;
丙酮酸钠( so d iu m Py r u v a t e ) 2 0 m g / L , 柠檬酸(C itr ie a e id ) 1 0 m g /L ; 葡萄糖 (G lu e o s e ) 0 . 6 m o l, p H 5 . 5
2
.
2
.
3 培养基渗透压的调节 用葡萄糖调节培养基的渗透压 , 原生质体的最初培养基用
0
.
6 m ol 的葡萄糖 。 在培养过程中需不断补加新鲜培养基并降低渗透压 。渗透压的降低要逐
渐进行 , 经过 0 . 6 、 0 . 5 、 0 . 4 、 0 . 3 m ol , 最后达到一般组织培养要求 。加液时将原来培养液吸
出 1 / 3 , 再补加相应量的渗透压降低的新鲜培养液 , 使原生质体保持旺盛生活力 。
2
.
2
.
4 分化条件 来源于原生质体的愈伤组织经增殖 , 移入分化培养基 (表 3 ) , 在光照 16
小时 , 光强 2 0 0 0 L u x , 温度 2 5 士 1 ℃下培养 。
2
.
2
.
5 生根 生根培养基为不含任何激素的 MS 培养基 。待小苗 2~ 3 厘米后 , 移到生根培
养基上分化根 。
3 结果
纯化的原生质体 (图版 1 ) , 培养于改良的 K sP 和 MS 培养基中 , 采用液体浅层培养 。
在 7 种原生质体培养基中 , 均能产生原生质体分裂 , 但速度与频率不同 。 其中以 K : P一2
和 MS 一 1 为最好 , 一般在培养第 2 天 , 原生质体膨大并逐渐成椭圆形 , 第 3 天开始第一次分
裂 , 第 5 天统计分裂频率 , 分别达到 38 %和 35 % 。 第 7 天进入第二次分裂 , 第 8 天为分裂高
峰 , 二次分裂频率分别占原生质体总数的 30 %和 28 % , 二次分裂很快 , 持续时间短 , 迅速进
草 地 学 报 1 9 9 4 年
表 3 分化培养墓
T a b le 3 D iffe r e n tia tiv e m e diu m
激 素
p hy t o h o r m o n e
s
(m g / L ) M S
一a
M S
一
b
培养基
M S
一
d
(m e d iu m )
M S
一C M S
一 e
2
,
4 一 D
N A A
丛里兰
0
.
2 5
M S
一g M S
一
h
:
.
:
0 0
.
4 0
0 0
2 2
0 0 0
2 2 4
. 附加 CH 19 / L , G e lr it e 0 . 2 5 % , S u e r o s e 2 0 9 / L , p H 5 . 5 .
入多次分裂 , 第 10 天即出现多细胞组织 , 并逐渐形成小细胞团 。原生质体分裂和生长情况见
图版 2 ~ 5 。
其它培养基有不同表现 , K : P 一 1 、 K S P一 3 、K SP 一 4 和 K : P一 5 出现分裂较晚 , 一般在第 4 天开
始分裂 , 第 7 天进入分裂高峰 , 但分裂频率最高只有 15 % , 很难进行二次分裂 , 而且寿命短 ,
很快停止分裂 , 只有少数细胞能正常分裂并形成愈伤组织 。 MS 一 2 分裂频率更低 , 在培养的
第 7 天统计 , 只有 7 % , 而且很快就停止分裂 , 这可能是受激素浓度的影响所致 。 来源于原生
质体的小细胞团 , 经过不断补加新鲜培养液及降低渗透压 ,很快长成肉眼可见的小愈伤颗粒
并逐渐长大为直径 1 毫米以上的小愈伤组织 。将愈伤组织接种到培养基 MS 十 2 , 4 一D Zm g / L
+ G elri t
e 0
.
25 %上增殖 , 愈伤组织生长很快 ,待长到 0 . 5 一 1 厘米 , 移入分化培养基 。
愈伤组织在 8 种分化培养基中生长情况有很大差异 。 M S 一 a 使愈伤组织进一步长大 ,但
不分化 , 可能是 2 , 4 一D 浓度过高所致 ; M S 一b 使愈伤组织逐渐长出绿点 , 但很快整个组织变
绿 , 也不分化 , 可能是 K T 过高 ; M S 一 c 、M S 一 e 、 M S 一f、 M S 一 g 、 M S 一h 能使愈伤组织长出绿色
芽点 , 并长出绿芽 , 但很难发育成正常苗 , 一般出现玻璃苗现象 ; MS 一d 表现最好 , 愈伤组织
长出绿色芽点并分化出丛生芽 ,最后发育成小苗 。 由此看来 , 2 , 4 一D 和 K T 或其它细胞分裂
素的浓度直接影响着愈伤组织的分化 。在本试验 中 , 以 2 , 4 一D 1 m g / L 和 K T Zm g / L 配合最
佳 , 分化率高 , 可达 60 %以上 。 从接入愈伤组织到分化出植株 , 一般需 2 个月左右 。 再生植株
长到 2一 3 。m 左右 , 移入 M S 无激素培养基生根 , 并很快得到根系发达的完整的再生植株 。
愈伤组织生长和分化情况见图版 6一 8 。 再生植株及生根情况见图版 9 ~ 1 0 。
3 讨论与结论
采用紫花首蓓叶片分离培养原生质体 , 国外 已经报道 , 国内尚未成功 。 本试验在国内开
创了紫花首蓓叶片原生质体培养再生植株的先例 , 而且所用两个材料 , 均为第一次得到它们
的再生植株 。本试验认为 , 植株顶部新生叶片生活力强 , 有利于得到活力高的原生质体 , 为原
生质体分裂及愈伤组织分化提供了保证 。
酶的浓度和酶液渗透压需调整适当 。酶浓度过高 , 会造成原生质体死亡 ;酶浓度过低 , 原
生质体游离不彻底 。 渗透压也很关键 ,过高会使原生质体皱缩 , 过低会使原生质体胀裂 。 以
往实验多采用 3 种以上的酶 , 而且酶解时间长 , 一般在 8 小时以上 。本试验表明 ,酶液组成以
e ellu la s e R
一
1 0 2 %
,
M a e e r o z y m e R
一
1 0 0
.
5 %
, 渗透压 0 . 6 m o l较合适 , 只采用两种酶 , 仅 4
个小时就可得到大量有活力的原生质体 。 在紫花首蓓原生质体培养中 , 国内外基本上采用
K
S
P 培养基 , 但该培养基成分复杂 (K . N . K ao , 1 98 0 ) , 给试验带来一些不便 。 我们采用 K sP
和 M S 培养基分别进行了实验 , 对 K sP 和 MS 培养基进行了改良 。 采用改良的 MS 培养基
。
4 4
。 草 地 学 报 1 9 9 4 年
得到了再生植株 ;另外 , 在原生质体培养前期采用改 良的 K sP 而愈伤组织增殖及分化采用
改良的 MS 也得到再生植株 。 M S 培养基成分简单 , 可以减小只采用 K sP 的难度 。
生长素与细胞分裂素的浓度配合是原生质体培养的关键 。 本试验认为 。 较低的 2 , 4 一D
(0
.
2 ~ 1 m g / L )有利于原生质体分裂及愈伤组织的形成和分化 。 另外 , 低浓度的 6 一BA 和
Z T 有利于首箱原生质体的分裂 , 而中等浓度的 K T 有利于愈伤组织的分化 。
紫花首箱的原生质体培养 , 国内外仍在继续研究 , 并 已用于首楷细胞融合和基因工程 ,
成为首箱遗传操作的重要内容和手段 。相信进一步开展原生质体培养的研究 , 会促进首箱生
物技术育种的发展 。
参 考 文 献
1
2
3
4
5
6
7
尹光初等 , 1 9 9。, 植物生物技术与作物改良 , 中国科技出版社 , 69 ~ 10 。
黄绍兴等 , 1 9 9 0 , 紫花首猎原生质体植株再生及遗传转化的研究 , 中国科学院遗传所《研究工作年报》,
科学出版社 , 74 ~ 75
D
.
Y
.
L u
,
M
.
R
.
Da
v e y a n d E
.
C
.
Co e kin g
,
1 9 8 3
,
A eo m p a r s io n o f th e e u lt u r a l b e h a v io u r o f p r o to p la sts
fr o m le a v e s
, e o tyled o n s a n d r o o t s o fM七d ic a g o sa tiv a . Pla n t se ie n e e le tte r s . 3 1 : 8 7 一 9 9
G ilm o u r
,
D
.
M
. ,
Da
v e y
,
M
.
R
.
a n d C o ek in g
,
E
.
C
. ,
1 9 8 7
,
Is o la tio n a n d e u ltu r e o f h e te r o k a r yo n s fo llo w
-
in g fu s io n o f p r o to pla st s fr o m s e x u a lly eo m p a tib le a n d s e x u a ll in e o m p a tib le M七d ic a g o s p e e ie s , P la n t se i-
e n e e
.
5 3 : 2 6 3 ~ 2 7 0
G ilmo
u r , D
.
M
. ,
Da
v e y
,
M
.
R
.
a n d Co e kin g
,
E
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C
. ,
19 89
,
P r o d u e tio n o f so m a tie h y br id tis s u e s fo llo w in g
c h e m ie a l a n d e le e trie a l fu s io n o f p r o t o p la st s fr o m a lbin o ee ll s u s p e n s io n s o f M
e d ic a g o sa tiv a a n d M.
bo re
a lis
,
P la n t e e ll R e P o r ts
,
8
:
2 9~ 3 2
K
.
N
.
K a o
,
M
.
R
.
M i
e h a ylu k
,
1 9 8 0
,
Pla n t re g e n e r a tio n fr o m m es o p hy ll p r o to pla s ts o f a lfa lfa
.
Z
.
p fl a n z e n
-
ph y sio l
.
Bd
.
9 6
.
5
.
1 3 5~ 1 4 1
2
.
H
.
X u
,
M
.
R
.
Da
v e y a n d E
.
C
.
C o e k in g
,
1 9 82
,
O r g a n o g e n e s is fr o m r o o t p r o t o pla s ts o f t he fo ra g e
le g u m e s M 七d ica go sa tiv a a n d T r ig o n e lla fo e n u m 一g r a e e u m . 2 . p fla n z e n phy sio l. Bd
.
1 0 7
.
5
.
2 32 ~ 2 3 5
P R O T O P L A ST C U L T U R E A N D PL A N T
R E G E N E R A T IO N F R O M M E SO PH Y L L O F A L F A L FA
(材E D IC A G O S A T IV A L . )
S h u W
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(A n ima l
s eie n e e in s titu te
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C h in e s e A e a d e m y o f A g r ie u ltu r a l
Sc i
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,
1 0 0 0 9 4
,
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S u n Y o n g r u
(G e n e tie in stitu te
,
A e a d e m ia sin ie a
,
Be iji
n g
,
1 0 0 1 0 1
,
C hin a )
A加tr e t : Pr o to pla s ts w e re is o la te d fr o m m e s o Phy llo f tw o e u ltiv a rs o f a lfa lfa (H e tia n a n d Da n X u a n a l-
fa lfa ) u s in g a e n z ym e m ix tu r e
.
T w o k in d s o f p r o to p la s t e u ltu r e m e d iu m s o 〔m o difie d K aP a n d MS w e r e
u s e d
.
Pr o to Pla s ts e n te r ed d iv is io n a ft e r 24 to 4 8 h o u r s o f e u lt u r e a n d fo rm e d e e ll e o lo n ie s
.
A依r th e e a lli
w e r e tr a n sfer r e d to dif e r e n tia t e d m e d iu m pla n tle ts w e r e r e g e n e r a te d
.
T h e pla n tle ts r o o te d o n M S m
e d iu m
(n o h o rm o n e )
K ey w o rd s
: A lfa lfa ; M
e so p hy ll; Pr o t o pla s t e u ltu re , Pla n t re g e n e ra tio n