全 文 ：武汉植物学研究 2006，24(1)：58～62
Journa／of Wuhan Botanical Research
中国武汉地区萑草花粉变应原蛋白质组分的双向电泳分析
李东栋 ，孙，何韶衡 ，陶爱林
(1．海南大学理工学院生物工程系，海南海口 570228；2．汕头大学医学院变态反应学与炎症学研究所，广东汕头 515031)
摘 要：应用蛋白质双向电泳的分析技术对武汉地区生长的主要过敏原——荐草(Humu／us scnr Lour．)花粉的
蛋白质组分进行了分析。应用三氯乙酸法提取薇草花粉总蛋白质，通过等电聚焦和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电
泳分析获得了完整的薇草花粉全蛋白质图谱。应用专业分析软件(ImageMaster 2D)对电泳图谱分析表明：通过等
电聚焦和第二向SDS．PAGE电泳，有 122个不同的蛋 白质组分被检测出来 ，并进一步确定每个蛋白质相应的分子
量、等电点和相对含量。研究中获得的高分辨率的双向电泳图谱是我国捧草花粉变应原蛋白质第一张完整的蛋白
质图谱，将为今后捧草花粉中致敏蛋白质的检测、分离、基因克隆和变应原的标准化奠定基础。
关键词 ：薇草；花粉变应原；蛋白质组分；双向电泳
中图分类号：Q946．1 文献标识码：A 文章编号 ：1000-470X(2006)O1-0058-05
Analysis of Total Proteins in Polen of Humu~s scandens Lour．
in Wuhan Re#on of China by Two-dimensional Eleetrophoresis
LI Dong．Dong ” ．HE Shao-Heng2，TAO Ai-Un
(1．Department ofBioengineering，Hainan University。Haikou，Hainan 570228，China；2．Institute ofAlergy
andInflammation。Medical Colege ofShantou【 】 ，Shantou，Guangdong 515031，China)
Abstract： rhe total proteins in polen of Humulus s∞ ， Lour．，one of the most po pular aeroallergen
in China．were analyzed by two．dimensional electrophoresis in current study．The total proteins of the
polen were extracted by trlchloracetic acid(TCA)method，and then separated by isoelectric focusing as
first dimension and SDS PAGE as the second dimension．The spo ts of proteins were visualized by staining
with Coomassie Briliant Blue．After analysis with software(ImageMaster 2D)，122 diferent proteins
were detected；their isoelectric point(pI)，Molecular wei ght(MW)and relative volume of each protein
in the polen were also discovered．Th is iS the first high．resolution．two．dimensional protein map of the
pollen of H sc口，加 Lour．in China．Our finding has built a solid foundation for identification．charac．
terization．gene cloning and standardization of allergenic proteins in the polen of H s∞ ， B Lour．in
further．
Key words：Humulus sc口rI如ns Lour．：Polen allergen；Proteins；Two-dimensional electrophoresis
狺草(Humulus s∞， Lour．)，为一年生蔓生
性植物。在 中国除青海省、新疆 自治区外均有分
布⋯，而以武汉地区分布最为广泛。在传统医学的
研究当中，荏草主要被认为是一种具有清热解毒、利
尿消肿功效的中草药，并在多种疾病的治疗当中被
加以应用 。而在 1995年的花粉变应原调查中发
现，中国的广大地区空气中狺草的花粉计数仅次于
蒿草花粉。因此，狺草花粉被认为是中国花粉症的
另一个重要变应原l3 J。由于其分布广泛、花粉量
大，使过敏人群难以避免。在其开花季节会引起大
范围过敏人群产生哮喘、鼻炎等变态反应性疾病，且
发病率高，严重影响过敏人群的健康和正常生活。
花粉变应原的成分包括脂肪、多糖和蛋白质等，
但其中最主要的致敏成分是蛋白质H】。对花粉变
应原蛋白质组分的分析是确定致敏蛋白质并将其纯
化的基础。作为当前蛋白质研究当中分辨率最高的
研究方法 J，双向电泳技术通过蛋白质本身等电点
和分子量之间的差异可以达到对多种蛋白质进行高
分辨、多信息分析[6】。由于应用双向电泳体系对变
应原蛋白质组分进行分析在我 国少见报道 ，因
此，本实验对中国武汉地区蓰草花粉变应原中的蛋
白质组分进行了分析，并获得了完整的、高清晰度的
狺草花粉变应原双向电泳图谱，为今后狺草花粉变
应原的研究奠定了一定的基础。
收稿 13期：2005—05-31，修回13期：2005-10—29。
基金项 目：国家 自然科学基金资助项 目(30560092)；海南省 自然科学基金资助项 目(80406)；海南省教育厅 高校科研资助项 目
(ajkj200510)。
作者简介：李东栋(1975一)。男，江苏金坛人，博士，海南大学理工学院生物工程系副教授，主要从事植物分子生物学相关领域的研究。
· 通讯作者(E-mail：liddfym@hotmail．corl1)。
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第1期 李东栋等：中国武汉地区荐草花粉变应原蛋白质组分的双向电泳分析 59
1 材料与方法
1．1 实验材料和仪器
蓓草(Humulus scandens Lour．)花粉样品为8～9
月薇草开花季节采集的新鲜花粉，冻存于 一70~C冰
箱待用。
丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠
(SDS)、二硫苏糖醇(DTr)、甘氨酸等电泳试剂购自
Sigma公司。IPG干胶条及相应平衡溶液购 自BIO—
RAD公司。其它试剂为国产分析纯。
主要的实验仪器及应用软件：等电聚焦 系统
(BIO—HAD)、第二向垂直电泳系统(BIO—RAD)。双
向电泳凝胶分析系统 ImageMaster 2D(Amersham)。
1．2 实验方法
1．2．1 萑草花粉变应原蛋白质的提取
采用三氯乙酸法(TCA) 提取蓓草花粉总蛋
白质并稍做修改。取新鲜花粉约 0．1～0．5 g液氮
研磨后转入 1．5 mL离心管，加入1 mL预冷的 10％
TCA丙酮溶液于 一20~C冻存2 h以沉淀蛋白质。
4oC，15 000 g离心 15 min后 去上 清，加入 1 mL
一 2O℃预冷丙酮(含0．05％ 3-巯基乙醇)清洗沉淀
物(4℃，15 000 g离心 10 min去上清)2次。沉淀物
4℃真空干燥 10 min去除剩余痕量的丙酮。取沉淀
物，按照 1：10(W／V)的比例加入上样缓冲液(8 mol／L
尿素，4％ CHAPS，50 mmol／L DTr。0．2％ Bio—Lyte
3／10两性电解质 )。4℃溶解4 h后15000g离心 10
min，取上清，用上样缓冲液稀释至蛋白质终浓度为 1
～ 1．5 g／ L并进行双向电泳分析。
1．2．2 双向电泳分析
IPG胶条的水化 取 300 IL花粉蛋白质提取
样品溶液置于特定的胶条水化槽中，将预先准备好
的胶条[pH 4～7，17 em(胶条长度)]覆盖于样品缓
冲液之上，并覆盖2—3 mL矿物油以防止蒸发，室温
放置 16～24 h后用于等电聚焦。
第一向等电聚焦 取出水化好的IPG胶条放人
等电聚焦仪中，等电聚焦的条件为250 V，20 min；
10 000 V，2．5 h；10 000 V电泳达 40 000 V／h，聚焦
完毕后将胶条保存于 一7O℃待用。将等电聚焦的
胶条置 于平 衡 溶液 I(6 mol／L尿 素、2％ SDS、
0．375 mol／L rifs—HCI、20％ 甘油、2％ DYr)中平衡
10 min后转入平衡溶液 II(6 mol／L尿素、2％ SDS、
0．375 mol／L rifs—HCI、20％ 甘油、135 mmol／L碘乙
酰胺 )中10min。将平衡后的胶条在TGS( s—Gly—
cine—SDS pH 8．8)电泳缓冲液中漂洗 30 s后用于第
二向电泳分析。
第二向垂直 SDS-PAGE 平衡后的胶条转移
至垂直板上方(17 cm×17 cm)，用含痕量溴酚兰
0．1％的琼脂糖封闭。非连续性凝胶的制备为4％
的浓缩胶和 15％的分离胶。电泳缓冲液为 TGS，电
泳条件为 16 mA 30 rain，24 mA 5～6 h。
凝胶的染色 电泳完毕后，凝胶置于约300 mL
染色液中(0．25％考马斯亮蓝 R250、45．4％ 甲醇、
9．2％冰醋酸)，室温下，在摇床或旋转平台上染色
至少30 min后转入 300 mL高甲醇脱色液(45．4％
甲醇、7．5％冰醋酸)中脱色2～3 h，再用 500 mL低
甲醇脱色液(5％甲醇、7．5％冰醋酸)脱色 4～6 h或
过夜。
1．2．3 图象分析
脱色后 的凝胶 经 图象扫 描仪扫描后 用 hn—
ageMaster 2D软件进行图象分析。整个双向电泳过
程重复3次，验证其重复性，并选取其中重复性最好
的作为分析对象。
2 结果
2．1 萑草花粉蛋白质双向电泳图谱
电泳结果经考马斯亮蓝染色后显示：在分子量
11．012～97 kD、等电点4．0～7．0的范围内共检测
到 122个不同的蛋白质组分。和传统的单向 SDS—
PAGE相比，蛋白质组分分离中获得的蛋 白质种类
有 5—1O倍的增加，分辨率明显提高 】。具有相同
分子量不同等电点的蛋白质被清楚分离。其中的每
一 个斑点都代表一种蛋白质种类(图 1)。
一 30．0
． ·
一 20．1
一 l4 4
●
’ M W
MW：Molecular weight(kD) pI：Isoelectric point
图 l 薇草花粉变应原蛋白质组分双
向电泳图谱
Fig．1 The 2D map ofthe total proteins in polen of
胁删 nl珊 scande~ Lout．
5 摹
5
—U
5
5
4
0
4
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60 武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
2．2萑草花粉变应原总蛋白质的特征分析
应用 ImagelVlaster 2D软件分析结果表明：在 pH
值为4～7、分子量 11．012～94．917 kD的范围之内，
蓉草花粉蛋白质的分子量最高约y~j94．9 kD，最低为
11．012 kD。其中 10～20 kD的蛋白质种类最多，占
总蛋白质数量的31．1％。其次为20～30 kD的蛋白
质种类，占总蛋白质种类的25．4％。而两者之和占
了一半的比例(表 1、图 2)。在等电点方面，pH值
为6．0～7．0之间的蛋白质种类有 63种，占总蛋白
质种类的51．6％(表 1、图3)。
： 羹 圈
分子 量 (kD)
M olecular weight
图2 薇草花粉变应原蛋白质
组分的分子量分布
Fi辱2 MW di8tribution ofproteins in pollen of
／／．seanden,~Lour．
表1 薇草花粉蛋白质双向电泳图分析结果
Table 1 Analysis result of2D map ofthe total proteins in polen of皿 seanden,~Lour．
代号 等电点 分子量 代号 等电点 分子量 代号 等电点 分子量
No． pI Mw(kD) No． pI Mw(kD) No． pI Mw(kD)
1 5．2O6 94．917 42 6．458 36．796 83 4．551 20．752
2 6．162 95．764 43 5．918 39．66o 84 6．536 20．O93
3 5．726 95．764 44 6．251 38．881 85 6．1O5 20．O29
4 5．861 94．cr78 45 6．661 37．525 86 6．677 19．713
5 6．51O 91．610 46 4．993 33．403 87 6．417 19．223
6 6．775 90．402 47 5．398 33．789 88 5．528 19．405
7 4．416 78．881 48 4．328 33．149 89 6．O95 18．636
8 5．923 75．514 49 4．624 33．531 90 5．731 17．336
9 6．318 75．186 50 4．468 32．523 91 5．357 17．133
10 5．544 72．303 51 6．786 3O．278 92 6．510 16．788
11 4．801 73．889 52 5．518 3O．965 93 5．414 16．177
12 4．847 72．933 53 4．307 3O．734 94 4．821 16．222
13 6．079 69．243 54 6．432 28．644 95 5．757 15．775
14 6．1O5 64．639 55 6．594 29．610 96 6．578 15．645
15 6．786 69．542 56 5．798 29．O68 97 6．531 15．266
16 5．O97 67．185 57 5．871 28．O23 98 6．739 15．952
17 6．490 66．610 58 6．770 28．435 99 6．469 15．475
18 6．516 6o．89O 59 6．625 27．419 10o 6．006 15．559
19 4．333 65．757 60 6．791 27．518 101 6．817 15．688
20 5．850 65．476 61 5．741 27．518 1O2 4．619 15．517
21 6．853 62．466 62 4．343 27．O25 103 4．572 15．39o
22 4．52O 6o．1l9 63 6．921 26．928 1O4 5．O5O 15．266
23 5．648 6o．89o 64 6．692 25．89o 1O5 5．6ll 15．O62
24 5．144 6o．119 65 6．749 24．9D5 1O6 6．723 14．982
25 6．318 56．423 66 6．188 25．526 1O7 5．554 13．239
26 6．183 56．9O1 67 5．4O9 25．436 108 5．715 13．239
27 4．395 55．715 68 6．438 25．346 109 6．4O6 13．271
28 6．827 53．428 69 5．1O7 25．346 11O 6．183 13．114
29 6．469 52．762 70 6．50o 23．8O5 111 6．339 13．O53
30 6．141 52．324 71 6．703 22．849 112 4．364 13．O22
31 6．141 47．769 72 5．788 22．849 113 6．542 12．991
32 6．583 47．769 73 6．1O5 22．926 114 4．993 12．412
33 5．918 46．6o8 74 5．081 22．695 115 6．495 12．495
34 6．464 44．383 75 5．554 21．442 116 6．209 12．038
35 5．658 44．203 76 4．536 21．442 117 6．443 11．835
36 6．661 43．492 77 4．567 21．O93 ll8 6．651 12．O64
37 5．466 43．142 78 4．634 21．162 119 5．824 11．712
38 4．795 44．203 79 6．391 21．442 120 5．814 11．498
39 6．895 42．452 80 4．988 2O．752 121 6．734 11．4O6
40 4．375 41．774 81 6．853 20．485 122 6．O48 11．012
41 6．464 39．977 82 5．944 19．713
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第 1期 、 李东栋等 ：中国武汉地区蓉草花粉变应原蛋白质组分的双向电泳分析 61
壹
Z
Isoelectric point
图3 萑草花粉变应原蛋白质
组分的等电点分布
Fig．3 pI distribution of proteins in polen of
且 scandens Lout．
2．3 萑草花粉变应原中不同蛋白质相对含量分析
ImageMaster 2D分析软件同时可以通过蛋白质
斑点的大小确定每个蛋 白质的相对含量。结果表
明：在本研究中，含量最多的蛋 白质为 116号 (图
1)，其分子量和等电点分别为12．038 kD和6．209。
含量最低的蛋白质种类为62号，仅相当于116号蛋
白质总含量的1／465(表 2)。
2．4萑草花粉变应原不同蛋白质等电点和分子量相
关性分析
应用统计软件(sPss)对被检测蛋白质的等电
表2 萑草花粉变应原蛋白质组分相对含量分析
Table 2 Volume of diferent proteins in polen of且 scam m Lout．
代号 相对含量 代号 相对含量 代号 相对含量 代号 相对含量 代号 相对含量
No． Volume No． V0lume No． Volume No． Volume No． V0lIⅡle
1 55852．00o 26 1O90o．000 51 37736．000 76 1551．000 101 3 896．00o
2 16963．00o 27 9765．000 52 丁巧．000 77 1405．000 10 489．00o
3 6822．000 28 43412．000 53 1 774．00o 78 5550．000 103 1 350．00o
4 221O7．00o 29 38641．000 54 1O7066．000 79 3 836．000 1O4 621．00o
5 l1 3B7．000 30 8158．000 55 2393．00o 8O 8823．000 105 6459．000
6 12钙I5．00o 31 2OB73．000 56 12013．000 81 59334．000 106 8550．00o
7 1＆l4．00o 32 4916．000 57 4457．000 82 72917．000 1O7 33752．000
8 43649．000 33 37 343．000 58 2499．00o 83 561．000 108 9404．00o
9 59630．00o 34 55294．000 59 36488．000 84 71 891．000 109 1O802．00o
1O 1O8681．00o 35 7573．000 6o 4067．00o 85 4964．000 l1O 15 891．00o
l1 3584．000 36 34326．000 61 2579．00o 86 22698．000 111 697O．00o
12 2844．00o 37 3246O．00o 62‘ 283．00o B7 11 514．000 l12 506．00o
13 29256．00o 38 607．000 63 3378．000 88 1434．000 l13 2660．00o
14 8O45．00o 39 6526．000 64 121 79．00o 89 4751．a0o 114 3642．a0o
15 28907．000 40 1 817．000 65 26213．00o 90 2106．000 l15 5 822．00o
16 27 815．00o 41 45774．000 66 5866．00o 91 1 371．000 l16 131 632．00o
17 38g60．00o 42 70567．000 67 6650．00o 92 12434．000 l17 8O395．00o
18 4114．00O 43 13467．000 68 18489．00O 93 39554．000 118 13O89．00O
19 2253．00o 44 8g60．000 69 1 237．00o 94 529．000 l19 3741．00o
20 3618．00o 45 6o426．000 7O 21 564．00o 95 27254．000 120 3232．00o
21 17546．00o 46 4650．000 71 29734 ．00o 96 33949．000 121 82238．00o
22 6628．00o 47 1 442．000 72 8 o71．00o 97 4469．00o 122 l1151．00o
23 3787．00o 48 15295．000 73 8372．00o 98 l1 816．000
24 3033．00o 49 847．000 74 828O．00o 99 26932．000
25 34887．000 50 5498．000 75 79920．00o 100 15 824．000
点和分子量进行了相关性分析(Spearman’s)。结果
表明：蓓草花粉变应原中不同蛋白质组分等电点和分
子量之间的相关系数为 一0．O48，而P值为0．603(p<
0．05为显著差异)，说明其中所有蛋白质种类等电点
和各自所对应的分子量之间并无显著的相关性。
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62 武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
3 讨论
双向电泳技术诞生已经有很长的时间，并在相关
的医学研究中起到越来越重要的作用 ¨。随着实验
仪器的不断更新，尤其是相应分析软件的不断开发，
蛋白质双向电泳的结果将会更加趋向于客观、真实和
量化¨¨ 。相对以前的蛋白质双向电泳分析，本研究
应用新的分析软件(ImageMaster 2D)避免了诸多人为
因素的干扰，使蛋白质双向电泳分析更加客观，包含
更多的数据信息 ¨，更加方便和精确进行进一步研
究和应用。
本研究中获得的高分辨率双向电泳图谱是我国
薇草花粉变应原蛋白质第一张完整的蛋白质图谱。
国外亦未见报道。这种包含相对含量的分析图谱会
使人们尽快将注意力集中在含量较高的蛋白质上，从
而避免实验上的盲目性。同时，如果结合免疫标记技
术，利用过敏体质个体的血清对现有的蛋白质图谱进
行免疫筛选，将会更加直接地反映花粉中的致敏蛋
白[1引。对这些蛋白质的测序分析将直接获得变应原
蛋白质的氨基酸序列，从而为获得单一的变应原并为
其以后的标准化工作打下基础。
蓓草花粉变应原蛋白质等电点和分子量的相关
性分析表明两者之间并没有显著相关性，为随机分
布。这在一定程度上说明，花粉变应原蛋白质组分当
中同类蛋白质(如酶、结构蛋白质等)在总蛋白质中的
分布似乎并没有特定的分子量和等电点范围。虽然
以往的报道认为花粉中的致敏成分是分子量大约为
30 kD的一组蛋白质 引，而其等电点的分布往往为5
— 6之间。然而，在不同植物以及地域范围内致敏蛋
白质的种类特征是否如此则仍需进一步研究。
对变态反应性疾病治疗 目前唯一有效的办法是
应用特异性变应原进行脱敏治疗 引。但是，在过去
利用花粉中的天然变应原提取物进行治疗的过程中
却存在很多问题。如天然提取物中存在其它非致敏
蛋白质和其它种类的大分子，使应用时的计量很难
标准化，导致临床应用剂量很低，难以达到免疫治疗
的效果 引¨。此外其他种类的蛋 白质也可能成为病
人新的变应原，从而引起复合性过敏反应。这些问
题实际上严重限制了脱敏治疗的I临床应用和疗效。
因此，急需对致敏蛋白质进行纯化、标准化，并最终获
得基因工程重组的变应原应用于临床实践中。
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