全 文 ：植物科学学报　 ２０１６ꎬ ３４(２): ３１６~３２４
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｐｌａｎｔｓｃｉｅｎｃｅ.ｃｎ
ＤＯＩ:１０􀆰 １１９１３ / ＰＳＪ􀆰 ２０９５￣０８３７􀆰 ２０１６􀆰 ２０３１６
刘甜甜ꎬ周倩ꎬ吴秋云ꎬ熊兴耀. 马铃薯晚疫病菌侵染的 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ荧光染色方法研究[Ｊ] . 植物科学学报ꎬ ２０１６ꎬ ３４(２): ３１６－３２４
Ｌｉｕ ＴＴꎬ Ｚｈｏｕ Ｑꎬ Ｗｕ ＱＹꎬ Ｘｉｏｎｇ ＸＹ. Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ ｆｌａｖｉｎｅ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ[ Ｊ] .
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ ２０１６ꎬ ３４(２): ３１６－３２４
马铃薯晚疫病菌侵染的 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ
荧光染色方法研究
刘甜甜１ꎬ 周 倩１∗ꎬ 吴秋云２ꎬ 熊兴耀３ꎬ４
(１. 植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室ꎬ 湖南农业大学植物保护学院ꎬ 长沙 ４１０１２８ꎻ
２. 湖南省马铃薯工程技术中心ꎬ 湖南农业大学园艺园林学院ꎬ 长沙 ４１０１２８ꎻ ３. 中国农业科学院
蔬菜花卉研究所ꎬ 北京 １０００８１ꎻ ４. 湖南农业大学作物种质创新与资源利用国家重点实验室培育基地ꎬ 长沙 ４１０１２８)
摘　 要: 在植物病害研究中ꎬ 观察寄主植物被病原菌入侵的过程非常重要ꎮ Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ 染料可附
着于菌丝ꎬ 在波长为 ３３０ ~ ３８０ ｎｍ的激发光下被激发出蓝色荧光ꎮ 为了更好的观察寄主植物中病原真菌的侵染
情况ꎬ 本实验以 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ为染剂ꎬ 对寄主植物中病原真菌的侵染情况进行了观察研究ꎮ 结果显
示ꎬ 用 ０􀆰００２％(Ｍ / Ｖ)Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ溶于 ０􀆰１ ｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ (ｐＨ ８􀆰５)配制的染色液染色 ５ ｍｉｎ的效
果最佳ꎻ 使用 ９５％乙醇溶液替代 ０􀆰１５％三氯乙酸(Ｗ / Ｖ)酒精溶液 ∶氯仿(Ｖ / Ｖ)(４∶１)对寄主植物叶片脱色的方法
操作简便、 毒害较低ꎻ 染色时省略了番红预染步骤ꎮ 将改良的染色方法用于晚疫病菌入侵的马铃薯叶片观察取
得了良好的效果ꎮ 该技术是一种改良的、 快速有效、 安全无毒的观察真菌菌丝入侵植物的荧光染色方法ꎬ 也适
用于观察其他真菌入侵寄主植物组织的过程ꎮ
关键词: Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥꎻ 马铃薯ꎻ 晚疫病菌ꎻ 荧光染色ꎻ 入侵过程
中图分类号: Ｑ９４５􀆰８　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１６)０２￣０３１６￣０９
　 　 　 收稿日期: ２０１５￣１２￣０３ꎬ 退修日期: ２０１５￣１２￣２５ꎮ
　 基金项目: 国家自然科学基金项目(３１２０１５０２)ꎻ 高校博士学科点专项科研基金项目(２０１２４３２０１２００１５)ꎮ
Ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ ｗａｓ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｇｒａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ (３１２０１５０２) ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｆｕｎｄ ｆｏｒ Ｄｏｃｔｏｒａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ｈｉｇｈｅｒ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ (２０１２４３２０１２００１５) .
　 作者简介: 刘甜甜(１９９１－)ꎬ 女ꎬ 硕士研究生ꎬ 研究方向为植物病理学(Ｅ￣ｍａｉｌ: ８７２２５４８７７＠ｑｑ􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ􀆰 Ｅ￣ｍａｉｌ: ｚｈｏｕｑｉａｎ２６１７＠ｈｕｎａｕ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ)ꎮ
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ ｆｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ
ＬＩＵ Ｔｉａｎ￣Ｔｉａｎ１ꎬ ＺＨＯＵ Ｑｉａｎ１∗ꎬ ＷＵ Ｑｉｕ￣Ｙｕｎ２ꎬ ＸＩＯＮＧ Ｘｉｎｇ￣Ｙａｏ３ꎬ４
(１. Ｈｕｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｅｓｔｓꎬ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ
Ｈｕｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０１２８ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２. Ｈｕｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｐｏｔａｔｏｅｓꎬ
Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ Ｃｏｌｌｅｇｅꎬ Ｈｕｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０１２８ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３. Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ
ａｎｄ Ｆｌｏｗｅｒｓꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ４. Ｐｒｅ￣Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ
Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｒｏｐｓꎬ Ｈｕｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０１２８ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｈｏｓｔ ｐｌａｎｔｓ ｉｎｖａｄｅｄ ｂｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ ｈａｖｅ ｇｒｅａｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｉｎ
ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ. Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ ｃａｎ ａｔｔａｃｈ ｔｏ ｈｙｐｈａｅꎬ ｗｈｉｃｈ ｇｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｕｎｄｅｒ
３３０－３８０ ｎｍ ｌｉｇｈｔ. Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ ｆｌａｖｉｎｅ
７ＧＦＥ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｆｕｎｇａｌ ｈｙｐｈａｅ ｉｎｖａｄｉｎｇ ｐｌａｎｔｓ. Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｌｅａｆ
ｓｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ０􀆰００２％ (Ｍ / Ｖ) ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｉｎ ０􀆰１ ｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ
(ｐＨ ８􀆰５) ｆｏｒ ５ ｍｉｎ. Ｕｓｉｎｇ ９５％ ｅｔｈａｎｏｌ ｉｎｓｔｅａｄ ｏｆ ０􀆰１５％ ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ (Ｗ / Ｖ) ａｌｃｏｈｏｌ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ ∶ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ (Ｖ / Ｖ) ４ ∶１ ｆｏｒ ｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓａｆｒａｎｉｎｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ
ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ. Ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｐｏｔａｔｏ
ｌｅａｖｅｓ ｉｎｖａｄｅｄ ｂｙ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ ａｎｄ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｇｏｏｄ ｅｆｆｅｃｔｓ. Ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ
ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｆａｓｔꎬ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｎｏｎ￣ｔｏｘｉｃꎬ ａｎｄ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｖａｓｉｏｎ
ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ａｎｄ ｈｏｓｔｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥꎻ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓꎻ Ｐｏｔａｔｏꎻ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｔａｉｎｉｎｇꎻ
Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
　 　 在植物病理学研究中ꎬ 经常需要观察研究寄主植
物与病原真菌的相互作用ꎮ 观察真菌入侵寄主植物的
过程及其相互作用的试验方法也随着研究的发展不断
改进ꎮ 传统的组织透明染色法可以对组织中病菌菌丝
扩展进行定量研究ꎬ 揭示寄主和病原物相互作用的时
空变化动态ꎮ 然而ꎬ 组织透明染色法的应用具有一定
的局限性ꎬ 它难以区分细胞的病理性坏死和机械创
伤ꎬ 且用于观察真菌孢子在寄主植物表面的萌发和入
侵的过程还需要借助超薄切片手段ꎮ 采用超薄切片结
合组织透明染色法观察真菌入侵的过程ꎬ 操作步骤繁
琐、 耗时长[１－３]ꎬ 没有经验的实验人员需要经过反复
摸索尝试才能获得理想的观察效果ꎮ
另一种经常使用的观察植物被真菌孢子入侵的
方法是通过转基因技术ꎬ 将绿色荧光蛋白(ＧＦＰ)
基因转化到病原真菌中ꎬ 使其在菌体中表达ꎬ 然后
在荧光显微镜下观察寄主植物中病菌的形态和活动
情况ꎮ 这种方法能更准确、 快速地观察寄主植物表
面和组织中的病菌行为ꎬ 是研究寄主植物与病菌之
间相互关系较为理想的方法[４－８]ꎮ 然而ꎬ 该方法涉
及转基因的操作过程ꎬ 包括表达载体的构建和遗传
转化等ꎬ 其实验周期长ꎬ 且对操作者的技术要求较
高ꎻ 而且绿色荧光蛋白表达量少导致的荧光亮度不
够和荧光稳定性较差的问题也使这种方法受到限
制[９]ꎮ 此外ꎬ 有不少真菌的遗传转化难以成功ꎮ
因此ꎬ 建立一种快速、 能够在宿主和病原真菌
之间产生类似绿色荧光蛋白的对比效果、 无需进行
遗传转化或超薄切片也能观察真菌入侵过程的染色
方法很有必要ꎮ 本实验以 Ｋｎｉｇｈｔ 等的方法[１０]为基
础进行改良ꎬ 以马铃薯和晚疫病菌为对象ꎬ 以期探
索出一种简便快捷、 高效无毒的观察真菌菌丝入侵
寄主过程的方法ꎬ 并将该方法应用于其他寄主与病
原真菌互作过程的观察研究ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 供试植物
供试马铃薯(Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ.)品种为
湖南马铃薯工程技术中心保存的‘Ｆａｖｏｒｉｔａ’ꎮ
１􀆰 １􀆰 ２　 供试菌种
马铃薯晚疫病菌 ( Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ )
ＣＮ１５２由中国农业科学院蔬菜花卉研究所谢丙炎
老师赠送ꎮ 晚疫病菌于黑麦培养基上 １８℃培养、
备用ꎮ
１􀆰 ２　 仪器与试剂
１􀆰 ２􀆰 １　 仪器
Ｎｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ８０ｉ荧光显微镜(北京锐驰恒业
仪器科技有限公司)ꎻ Ｍｏｔｉｃ ＢＡ２１０ 显微镜(麦克
奥迪实业集团有限公司)ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２　 试剂
脱色液Ⅰ: ０􀆰１５％三氯乙酸(Ｗ / Ｖ)酒精溶液 ∶
氯仿(Ｖ / Ｖ) ＝ ４ ∶１ꎻ 脱色液Ⅱ: ９５％酒精溶液ꎻ 透
明液: ５０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＯＨꎻ 缓冲液: ０􀆰１ ｍｏｌ / Ｌ
Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ溶液(ｐＨ ８􀆰５)ꎻ 染色液: 将 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ
Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ(购自 Ｃｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ 公
司)溶于 ０􀆰１ ｍｏｌ / Ｌ 的 Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ 缓冲液(ｐＨ ８􀆰５)
中ꎻ ５０％酒精溶液ꎻ ５０％ (Ｖ / Ｖ)甘油ꎮ 其他试剂
均购自国药集团化学试剂有限公司ꎮ
１􀆰 ３　 方法
１􀆰 ３􀆰 １　 供试植物的培养
使用改良的 ＭＳ 培养基[１１]于室内(２０ ±２)℃、
光暗周期为 １６ ｈ / ８ ｈ 条件下培养马铃薯组培苗ꎬ
待幼苗长出 ３ ~ ４片蚕豆大小的叶片时ꎬ 取其叶片
进行实验ꎮ
１􀆰 ３􀆰 ２　 孢子悬浮液的制备
使用黑麦培养基[１２]培养马铃薯晚疫病菌ꎬ 于
１８℃暗培养 ７ ｄ后观察其产孢量ꎮ 用无菌水冲洗并
分离游动孢子囊ꎬ 在普通显微镜下使用血球计数板
将游动孢子囊浓度调至 １􀆰０ × １０４ ~５个 / ｍＬꎬ 直接
接种于马铃薯组培苗上ꎮ
１􀆰 ３􀆰 ３　 接种方法
采用活体喷雾接种法: 将配好的马铃薯晚疫病
菌孢子悬浮液均匀喷雾于组培苗上ꎬ 然后将组培苗
放入组培室继续培养ꎬ 光强不低于 １０ ０００ ｌｘꎬ 湿
７１３　 第 ２期　 　 　 　 　 　 　 　 刘甜甜等: 马铃薯晚疫病菌侵染的 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ荧光染色方法研究
度 １００％ꎮ
１􀆰 ３􀆰 ４　 不同脱色液脱色效果的比较
取已接种晚疫病菌的马铃薯组培苗叶片ꎬ 分别
在脱色液Ⅰ中浸泡 ４８ ｈ 和脱色液Ⅱ中沸水浴
１５ ｍｉｎꎬ 然后将样品转移至 ５０％酒精溶液中清洗
１５ ｍｉｎꎬ 再转移至 ５０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＯＨ 溶液中进行
透明处理 ２次ꎬ 每次 １５ ｍｉｎꎬ 接着用纯净水清洗 ３
次ꎬ 每次 １０ ｍｉｎꎬ 最后在 ０􀆰１ ｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ缓冲
液(ｐＨ ８􀆰５)中放置 ３０ ｍｉｎ 后直接制片并进行观
察ꎬ 比较 ２种不同脱色液的脱色效果ꎮ
１􀆰 ３􀆰 ５　 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ 染色液不同浓
度和染色时间的效果比较
为了优化 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ 的染色效
果ꎬ 避免因染色液浓度过高导致叶片背景荧光信号
强而干扰观察ꎬ 以未接种晚疫病菌的马铃薯组培苗
叶片和晚疫病菌菌丝为材料ꎬ 进行染色液浓度和染
色时间的筛选比较ꎮ
先用 ０􀆰１ ｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ 缓冲液(ｐＨ ８􀆰５) 将
Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ 染料配制成 ０􀆰１％ (Ｍ /
Ｖ)的母液(以下简称母液)ꎬ 然后将母液分别稀释
１０、 ２０、 ５０、 １００倍待用ꎮ 染色时ꎬ 先使用脱色液
Ⅱ用上述方法对叶片进行脱色透明ꎬ 处理后的叶片
和菌丝在 １０、 ２０、 ５０、 １００ 不同稀释倍数的母液
中分别浸泡 １、 ５、 １０ ｍｉｎꎬ 然后用蒸馏水清洗 ２
遍ꎬ 在荧光显微镜下观察ꎬ 筛选出最佳的染色液浓
度和染色时间ꎮ 所有荧光照片拍摄的曝光时间均为
１３０ ｍｓꎮ
１􀆰 ３􀆰 ６　 马铃薯晚疫病菌在叶片上入侵过程的观察
分别在马铃薯组培苗上接种晚疫病菌后 ０、
１２、 ２４、 ４８、 ７２、 ９６ ｈ取叶片样品进行观察ꎮ
(１)叶片表面孢子的萌发和入侵观察
取接种后 ０、 １２、 ２４ ｈ 的叶片ꎬ 直接将稀释
５０倍(０􀆰１％母液的 １ / ５０)的母液分别均匀喷雾在
马铃薯叶片和晚疫病菌菌丝表面ꎬ 染色 ５ ｍｉｎꎬ 然
后在配置 ＵＶ￣２Ａ 过滤器 (激发过滤器ꎬ ３３０ ~
３８０ ｎｍꎻ 分色镜ꎬ ４００ ｎｍꎻ 屏障过滤器 ４２０ ｎｍ)
的荧光显微镜下观察(不加盖玻片)ꎮ
(２)马铃薯叶组织内的菌丝生长观察
取接种后 ４８、 ７２、 ９６ ｈ 的叶片ꎬ 先用脱色液
Ⅱ进行脱色ꎬ 方法同上ꎮ 然后用稀释 ５０ 倍的母液
浸泡 ５ ｍｉｎꎬ 取出后制成临时玻片ꎬ 于荧光显微镜
下观察ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 脱色效果的比较
分别用脱色液Ⅰ和脱色液Ⅱ对马铃薯叶片进行
脱色ꎬ 结果显示两种脱色液都能去除叶片中的色
素ꎬ 但采用脱色液Ⅱ的脱色效果更好、 叶片更透
明ꎬ 脱色处理后叶片的细胞结构仍清晰可见(图
１)ꎮ 脱色液Ⅱ中不含氯仿和三氯乙酸等刺激性试
剂ꎬ 仅为 ９５％乙醇ꎬ 且脱色时间短ꎬ 完全可以替
代脱色液Ⅰꎮ
２􀆰 ２　 染料 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ 染色的适宜
浓度和时间
利用 ０􀆰１％母液配制的不同浓度 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ
Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ染色液(母液浓度分别稀释 １０、 ２０、
５０、 １００倍)对晚疫病菌菌丝进行染色ꎬ 结果显示
(图 ２)ꎬ 染色 １０ ｍｉｎ时ꎬ 不同浓度染色液都能使
a b
ａ: 脱色液Ⅰ的脱色效果ꎻ ｂ: 脱色液Ⅱ的脱色效果ꎮ
ａ: Ｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｅｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ⅰꎻ ｂ: Ｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｅｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ⅱ.
图 １　 不同方法脱色透明后的马铃薯叶片 (１０ × ４０)
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｄｅｃｏｌｏｒｅｄ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｅｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ
８１３ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷　
bc
d
a e
f
g
h
i
j
k
l
ａ ~ ｄ: 稀释 １０、 ２０、 ５０和 １００倍母液对菌丝染色 １０ ｍｉｎ的效果ꎻ ｅ ~ ｈ: 稀释 １０、 ２０、 ５０和 １００倍母液对菌丝染色 ５ ｍｉｎ
的效果ꎻ ｉ ~ ｌ: 稀释 １０、 ２０、 ５０和 １００倍母液对菌丝染色 １ ｍｉｎ的效果ꎮ
ａ ~ ｄ: １０ꎬ ２０ꎬ ５０ ａｎｄ １００ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｏｒ １０ ｍｉｎꎻ ｅ ~ ｈ: １０ꎬ ２０ꎬ ５０
ａｎｄ １００ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｏｒ ５ ｍｉｎꎻ ｉ ~ ｌ: １０ꎬ ２０ꎬ ５０ ａｎｄ １００ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ
ｏｆ ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｏｒ １ ｍｉｎ.
图 ２　 不同浓度染色液处理叶片不同时间菌丝的着色效果 (１０ × ２０)
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ ｏｎ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｍｅｓ
菌丝着色ꎬ 并且荧光信号的强度随着染色液浓度的
降低而降低(图 ２: ａ ~ ｄ)ꎻ 染色 ５ ｍｉｎ 时ꎬ 不同
浓度染色液均能使菌丝着色(图 ２: ｅꎬ ｆ)ꎬ 但稀释
１００倍的染色液荧光信号已经很微弱(图 ２: ｈ)ꎮ
染色 １ ｍｉｎ时ꎬ 除了稀释 １０ 倍的染色液染色的信
号较好外(图 ２: ｉ)ꎬ 其余浓度荧光强度均达不到实
验要求(图 ２: ｊ ~ ｌ)ꎮ
用 １０、 ２０、 ５０、 １００ 不同稀释倍数的母液对
马铃薯叶片染色时发现ꎬ 染色 １０ ｍｉｎ 时ꎬ 不同浓
度染色液都能够与叶片结合产生荧光信号ꎬ 且荧光
强度随着染色液浓度的降低而降低(图 ３: ａ ~ ｄ)ꎻ
染色 ５ ｍｉｎ时ꎬ 稀释 ５０ 倍和 １００ 倍的母液对叶片
染色的荧光信号已经很微弱(图 ３: ｇ、 ｈ)ꎻ 染色
１ ｍｉｎ 时ꎬ 除稀释 １０倍和 ２０倍的母液在叶脉上附
着有荧光信号外ꎬ 其余叶片背景都没有荧光残留
(图 ３: ｉ ~ ｌ)ꎮ
９１３　 第 ２期　 　 　 　 　 　 　 　 刘甜甜等: 马铃薯晚疫病菌侵染的 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ荧光染色方法研究
ab
d
e
c
f
g
h
i
j
k
l
ａ ~ ｄ : 稀释 １０、 ２０、 ５０和 １００倍母液对叶片染色 １０ ｍｉｎ 的效果ꎻ ｅ ~ ｈ: 稀释 １０、 ２０、 ５０ 和 １００ 倍母液对叶片染色
５ ｍｉｎ 的效果ꎻ ｉ ~ ｌ: 稀释 １０、 ２０、 ５０和 １００倍母液对叶片染色 １ ｍｉｎ的效果ꎮ
ａ ~ ｄ: １０ꎬ ２０ꎬ ５０ ａｎｄ １００ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｏｒ １０ ｍｉｎꎻ ｅ ~ ｈ: １０ꎬ ２０ꎬ ５０
ａｎｄ １００ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｏｒ ５ ｍｉｎꎻ ｉ ~ ｌ: １０ꎬ ２０ꎬ ５０ ａｎｄ １００ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ
ｏｆ ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｏｒ １ ｍｉｎ.
图 ３　 不同浓度染色液处理叶片不同时间的染色效果 (１０ × ２０)
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ ｏｎ ｌｅａｖｅｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｍｅｓ
　 　 在观察菌丝入侵植物的实验中需要同时对叶片
和菌丝进行染色ꎬ 所以需要选择既能够使菌丝顺利
染色ꎬ 又不会在叶片上造成荧光残留的染色液浓度
和染色时间ꎮ 通过对比分析上述两种染色效果ꎬ 最
终确定以 ０􀆰１％母液浓度 １ / ５０ 倍染色液ꎬ 即
０􀆰００２％(Ｍ / Ｖ)的 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥꎬ 染色
５ ｍｉｎ时ꎬ 效果最佳ꎮ
２􀆰 ３　 晚疫病菌在马铃薯叶片上入侵过程的观察
取马铃薯组培苗叶片喷雾接种后 ０、 １２、 ２４ ｈ
的样品直接染色(将染色液均匀喷雾在叶片表面)ꎬ
观察晚疫病菌入侵马铃薯叶片的情况ꎮ 结果显示
(图 ４)ꎬ 接种后 ０ ｈꎬ 可在荧光显微镜下观察到尚
未萌发的游动孢子囊(图 ４: Ａꎬ ａ)ꎮ 接种后１２ ｈꎬ
可见游动孢子囊开始萌发(图 ４: Ｂꎬ ｂ)ꎬ 接种后
０２３ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷　
２４ ｈꎬ 萌发的菌丝开始在叶面上扩展、 入侵(图 ４:
Ｃꎬ ｃ)ꎮ 接种后 ２４ ｈ 菌丝开始入侵到叶片内部ꎬ
但叶片中的叶绿素会干扰观察ꎬ 因此ꎬ 对接种后
４８、 ７２、 ９６ ｈ 的材料需要进行脱色透明ꎬ 然后再
染色观察ꎮ 接种后 ４８ ｈꎬ 可见菌丝在寄主叶片内
不断扩展(图 ４: Ｄꎬ ｄ)ꎻ 接种后 ７２ ｈꎬ 可观察到叶
片中有大量菌丝交错生长形成菌丝网(图 ４: Ｅꎬ
ｅ)ꎻ 接种后 ９６ ｈꎬ 菌丝从叶片组织中向外生长至
叶片表面(图 ４: Ｆꎬ ｆ)ꎮ
３　 讨论
采用不同染料对植物组织内真菌组织进行染
色观察的报道较多ꎮ 例如: 李慧霞等[１３]用苯胺蓝
染色法对马铃薯叶片被晚疫病菌入侵的过程及菌
丝的扩展情况进行了组织细胞学观察ꎬ 但该方法中
固定、 染色、 脱色的样品处理前后共耗时 ４ ｄꎬ 叶
片组织中菌丝体的辨析度也不高ꎬ 容易同液泡和叶
绿体等细胞器相混淆ꎮ Ｄｕｃｋｅｔｔ等[１４]用 ３ꎬ３′￣二己
A
a
B
b
C
c
D
d
E
e
F
f
Ａ ~ Ｃ: 对接种后 ０、 １２、 ２４ ｈ的叶片直接喷雾染色(１０ × ４０)ꎮ Ｄ ~ Ｆ: 对接种后 ４８、 ７２、 ９６ ｈ的叶片经脱色透明处理后ꎬ
再用染色液分别处理 ５ ｍｉｎ后的观察结果(其中ꎬ Ｄ、 Ｅ是在 １０ × ２０荧光显微镜下的观察结果ꎬ Ｆ是在 １０ × １０荧光显微镜下
的观察结果)ꎮ 图 ａ ~ ｆ分别为图 Ａ ~ Ｆ的普通光对照图ꎮ
Ａ ~ Ｃ: Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ０ ｈꎬ １２ ｈꎬ ａｎｄ ２４ ｈ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｓｐｒａｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ (１０ × ４０) . Ｄ ~ Ｆ: Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ
ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ４８ ｈꎬ ７２ ｈꎬ ａｎｄ ９６ ｈ ｂｙ ｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｏｒ ５ ｍｉｎ. Ｄꎬ Ｅ (１０ × ２０) ａｎｄ Ｆ (１０ × １０) .
图 ４　 晚疫病菌入侵马铃薯叶片的情况
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｖｅｓ ｉｎｖａｄｅｄ ｂｙ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ
１２３　 第 ２期　 　 　 　 　 　 　 　 刘甜甜等: 马铃薯晚疫病菌侵染的 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ荧光染色方法研究
基含氧碳菁碘代物染色ꎬ 观察了苔藓植物假根内的
内生子囊菌ꎬ 此染料通常用于观察寄主组织内的子
囊菌或者植物的菌根真菌ꎮ 陶明福等[１５]应用 ＤＡＰＩ
荧光显微技术对感染黄化病的长春花植株进行了切
片染色观察ꎬ 但植物组织本身细胞核 ＤＮＡ和 ＤＡＰＩ
结合后也会发出荧光ꎬ 对病原菌与寄主的互作观察
会产生影响ꎬ 且 ＤＡＰＩ荧光显微技术多用于植原体
(为一类病原物)和动物组织细胞核的观察ꎮ Ｈｏｃｈ
等[１６]研究发现 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ能够对包
括卵菌在内的多种真菌细胞壁进行染色ꎬ 荧光信号
比 Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ Ｗｈｉｔｅ Ｍ２Ｒ 更持久ꎬ 且使用成本更
低ꎮ 之后ꎬ 出现了许多利用 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ
７ＧＦＥ染色观察寄主与真菌互作过程的研究[１７－２０]ꎮ
Ｌｅｏｎ等[２１]对经 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ 染色后
的蛙壶菌的生长进行了观察ꎬ 发现 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａ￣
ｖｉｎｅ ７ＧＦＥ 的附着不会影响其游动孢子囊的活性ꎮ
Ａｎｄｅｒｓｏｎ 等[１７] 对比了包括 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ
７ＧＦＥ和 Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ Ｗｈｉｔｅ 在内的 ３ 种不同的荧光
染料与植物细胞壁中各类碳水化合物的选择性ꎬ 结
果发现 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ 和 Ｐｏｎｔａｍｉｎｅ
Ｆａｓｔ Ｓｃａｒｌｅｔ ４Ｂ与含有 β￣１ꎬ４糖苷键的多糖都能结
合ꎬ 但前者结合后产生的荧光强度比后者弱ꎮ 有研
究表明[１６ꎬ２２]ꎬ Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ 与地衣多
糖结合后能激发出强烈的荧光ꎬ 地衣多糖主要以
β￣１ꎬ３ 糖苷键连接而成ꎬ 推测 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ
７ＧＦＥ也可以与 β￣１ꎬ３糖苷键结合ꎬ 可激发出较 β￣
１ꎬ４糖苷键更为强烈的荧光ꎮ 植物和卵菌的细胞壁
中都有含 β￣１ꎬ４糖苷键的纤维素ꎬ 但卵菌细胞壁还
有含 β￣１ꎬ３糖苷键的 β￣葡聚糖ꎮ 因此ꎬ 本实验选择
Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ 对马铃薯叶片晚疫病菌
进行染色观察ꎬ 并调整 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ
的浓度和染色时间以优化染色效果ꎬ 通过试验ꎬ 发
现将 ０􀆰１％ Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ 母液溶于 ０􀆰１
ｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ (ｐＨ ８􀆰５)配制成的 ０􀆰００２％(即母
液稀释 ５０倍)的染色液对叶片染色 ５ ｍｉｎꎬ 效果最
佳ꎮ
为了简化操作程序ꎬ 降低染色过程中有毒有害
试剂的使用ꎬ 本实验用 ９５％乙醇替代 ０􀆰１５％三氯
乙酸(Ｗ / Ｖ)酒精溶液∶氯仿(Ｖ / Ｖ)＝ ４ ∶１ 的溶液用
于叶片脱色ꎬ 并省去了 Ｋｎｉｇｈｔ 等[１０]的方法中并不
具明显区分效果的番红染色步骤ꎮ 本研究结果显
示ꎬ 经改良后的脱色、 染色方法效果较好ꎬ 且更方
便、 安全、 快捷ꎮ
我们还使用改良后的染色方法对其他被真菌
侵染的植物进行了染色ꎬ 结果显示(图 ５)ꎬ 引起豇
豆煤霉病和稻瘟病的菜豆假尾孢菌(Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏ￣
a b c
d e f
ａ、 ｂ: 菜豆假尾孢菌的菌丝和分生孢子ꎻ ｃ: 稻瘟病菌的分生孢子ꎻ ｄ: 稻瘟病菌的菌丝ꎻ ｅ: 芸苔链格孢的分生孢子和菌丝ꎻ ｆ: 盘
多毛孢菌的孢子和菌丝ꎮ ｅ、 ｆ同时开启了荧光灯和普通灯ꎮ
ａꎬ ｂ: Ｈｙｐｈａｅ ａｎｄ ｓｐｏｒｅｓ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｃｒｕｅｎｔａꎻ ｃ: Ｓｐｏｒｅｓ ｏｆ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａꎻ ｄ: Ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｏｆ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ
ｇｒｉｓｅａꎻ ｅ: Ｓｐｏｒｅｓ ａｎｄ ｈｙｐｈａｅ ｏｆ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃａｅꎻ ｆ: Ｓｐｏｒｅｓ ａｎｄ ｈｙｐｈａｅ ｏｆ Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ ｍｅｎｅｚｅｓｉａｎａ. ｅ ａｎｄ ｆ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｔｏ￣
ｇｅｔｈｅｒ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｌａｍｐ.
图 ５　 用本研究改良的染色法对其他真菌的染色效果 (１０ × ２０)
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｄｙｅｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｆｕｎｇｉ ｗｉｔｈ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ
２２３ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷　
ｓｐｏｒａ ｃｒｕｅｎｔａ)和稻瘟病菌(Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ)
的孢子和菌丝均能够被染色ꎬ 但引起油菜黑斑病和
葡萄盘状盘多毛孢枯枝病的芸苔链格孢(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ
ｂｒａｓｓｉｃａｅ)和盘多毛孢菌 ( Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ ｍｅｎｅｚｅｓｉ￣
ａｎａ)的菌丝虽然能够被染色ꎬ 但颜色深的孢子却
无法着色ꎮ 因此ꎬ 如观察颜色深的真菌孢子萌发及
侵染寄主的过程需要将荧光显微镜的普通灯和荧光
灯同时开启(图 ５: ｅꎬ ｆ)ꎮ
４　 结论
本实验将 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ 染料应用
于寄主植物被病原菌入侵过程的显微观察ꎬ 对比研
究不同染色液浓度和不同染色时间的效果ꎮ 结果表
明ꎬ Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ ７ＧＦＥ 染色液的最佳使用
浓度为 ０􀆰００２％(Ｗ / Ｖ)ꎬ 最适染色时间为 ５ ｍｉｎꎮ
在此浓度和时间下ꎬ 可观察到马铃薯叶片被晚疫病
菌入侵的全过程ꎬ 即: 从游动孢子囊的萌发、 入
侵ꎬ 到叶片组织中菌丝的扩展情况ꎬ 最后菌丝从气
孔中生长出来的形态也清晰可见ꎮ
我们认为ꎬ 本研究中经过改良的观察寄主植物
被病原菌侵染过程的荧光染色方法ꎬ 能够对多种不
同的植物真菌病害的侵染过程进行观察ꎬ 为研究寄
主植物与病原真菌的互作奠定了基础ꎮ
参考文献:
[ １ ] 　 余仲东ꎬ 李琰ꎬ 李登武. 两类专性寄生真菌侵染植物的组织
学染色技术初步研究[Ｊ] . 武汉植物学研究ꎬ ２００５ꎬ ２３(６):
５８８－５９１.
Ｙｕ ＺＤꎬ Ｌｉ Ｙꎬ Ｌｉ ＤＷ. Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｉｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｓｔｕｄｙ ｏｆ
ｔｗｏ ｐｌａｎｔ ｏｂｌｉｇａｔｅ ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ｈｏｓｔｓ[Ｊ] . Ｊｏｕｒ￣
ｎａｌ ｏｆ Ｗｕｈａｎ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈꎬ ２００５ꎬ ２３ ( ６): ５８８ －
５９１.
[ ２ ] 　 殷萍萍ꎬ 李珊珊ꎬ 王玉玲ꎬ 曾会明. 立枯丝核菌(Ｒｈｉｚｏｃｔｏ￣
ｎｉａ ｓｏｌａｎｉ)对日本结缕草(Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｓｔｅｕｄ.)的侵染
过程研究[Ｊ] . 微生物学通报ꎬ ２０１５ꎬ ４２(７): １２５３－１２６２.
Ｙｉｎ ＰＰꎬ Ｌｉ ＳＳꎬ Ｗａｎｇ ＹＬꎬ Ｚｅｎｇ ＨＭ. Ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ
ｏｆ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ ｉｎ Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ[ Ｊ] . Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
Ｃｈｉｎａꎬ ２０１５ꎬ ４２(７) : １２５３－１２６２.
[ ３ ] 　 王庭杰ꎬ 张亮ꎬ 韩琼ꎬ 郑风霞ꎬ 王天琪ꎬ 冯娜娜ꎬ 王太霞.
玉米茎秆细胞壁和组织构建对抗压强度的影响[Ｊ] . 植物科
学学报ꎬ ２０１５ꎬ ３３(１): １０９－１１５.
Ｗａｎｇ ＴＪꎬ Ｚｈａｎｇ Ｌꎬ Ｈａｎ Ｑꎬ Ｚｈｅｎｇ ＦＸꎬ Ｗａｎｇ ＴＱꎬ Ｆｅｎｇ
ＮＮꎬ Ｗａｎｇ ＴＸ. Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｔａｌｋ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｏｎ ｔｈｅ
ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｖｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｏｆ ｍａｉｚｅ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ
２０１５ꎬ ３３(１): １０９－１１５.
[ ４ ] 　 Ｃｈｅｎ ＸＲꎬ Ｃｈｅｎｇ ＢＰꎬ Ｗａｎｇ ＸＬꎬ Ｄｏｎｇ ＳＭꎬ Ｗａｎｇ ＹＬꎬ
Ｚｈｅｎｇ ＸＢꎬ Ｗａｎｇ ＹＣ. Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ (ＧＦＰ)
ａｓ ａ ｖｉｔａｌ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏ￣
ｒａ ｓｏｊａｅ ａｎｄ ｓｏｙｂｅａｎ [ Ｊ ] . Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎꎬ
２００９ꎬ ５４(１６): ２８２２－２８２９.
[ ５ ] 　 Ｓｅｂａｓｔｉｅｎ ＪＳꎬ Ｔｅｓｔａ Ａꎬ Ｋａｍｏｕｎ Ｓꎬ Ｌａｕｒｅｎｃｅ ＶＭ. Ｕｓｅ ｏｆ
ａ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｓｐｌａｓｈ ｄｉｓ￣
ｐｅｒｓａｌ ｏｆ ｓｐｏｒａｎｇｉａ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ [ Ｊ] . Ｅｕｒ Ｊ
Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌꎬ ２００５ꎬ １１２(４): ３９１－３９４.
[ ６ ] 　 Ｊｉｎ ＤＸꎬ Ｌｉｕ ＧＺꎬ Ｚｈｕ ＨＧꎬ Ｙａｎｇ ＸＹꎬ Ｚｈａｎｇ ＸＬ. Ｔｒａｎｓｆｏｒ￣
ｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｐｌａｎｄ ｃｏｔｔｏｎ (Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ.) ｗｉｔｈ ｇｆｐ
ｇｅｎｅ ａｓ ａ ｖｉｓｕａｌ ｍａｒｋｅｒ [ Ｊ ] . Ｊ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ
２０１２ꎬ １１(６): ９１０－９１９.
[ ７ ] 　 吴娟ꎬ 邹路阳ꎬ 曾群安ꎬ 徐虹. 钝顶螺旋藻 ＦｔｓＺ 在大肠杆
菌中的表达和定位 [ Ｊ] . 植物科学学报ꎬ ２０１３ꎬ ３１ ( ２):
１７１－１７７.
Ｗｕ Ｊꎬ Ｚｏｕ ＬＡꎬ Ｚｅｎｇ ＱＡꎬ Ｘｕ Ｈ. Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ ＦｔｓＺ ｆｒｏｍ Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ[Ｊ] .
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｍａｌꎬ ２０１３ꎬ ３１(２): １７１－１７７.
[ ８ ] 　 徐莹ꎬ 刘太国ꎬ 何月秋ꎬ 陈万权. 绿色荧光蛋白及其在丝状
真菌研究中的应用[Ｊ] . 植物保护ꎬ ２００８ ꎬ ３４(６): １－６ .
Ｘｕ Ｙꎬ Ｌｉｕ ＴＧꎬ Ｈｅ ＹＱꎬ Ｃｈｅｎ ＷＱ. Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓ￣
ｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ[ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ ２００８ꎬ ３４(６): １－６.
[ ９ ] 　 Ｋｉｌａｒｕ Ｓꎬ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ Ｍꎬ Ｓｔｕｄｈｏｌｍｅ Ｄꎬ Ｓｏａｎｅｓ Ｄꎬ Ｌｉｎ Ｃꎬ
Ｔａｌｂｏｔ ＮＪꎬ Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ Ｇ. Ａ ｃｏｄｏｎ￣ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓ￣
ｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ Ｚｙｍｏｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ[Ｊ] .
Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ Ｂｉｏｌꎬ ２０１５ꎬ ７９(６): １２５－１３１.
[１０] 　 Ｋｎｉｇｈｔ ＮＬꎬ Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ ＭＷ. Ａ ｒａｐｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ ｉｎ ｃｅｒｅａｌ ｔｉｓ￣
ｓｕｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃｒｏｗｎ ｒｏｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌꎬ ２０１１ꎬ
６０(６): １１４０－１１４３.
[１１] 　 苏跃ꎬ 冯泽蔚ꎬ 胡虎. 马铃薯试管苗快繁培养基研究[Ｊ] . 种
子ꎬ ２００９ꎬ ２８(３): ７１－７３.
Ｓｕ Ｙꎬ Ｆｅｎｇ ＺＷꎬ Ｈｕ Ｈ. Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｎｓ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ
ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｆｒｅｅ￣ｖｉｒｕｓ ｐｏｔａｔｏ ｔｕｂｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ [ Ｊ] . Ｓｅｅｄꎬ
２００９ꎬ ２８(３): ７１－７３.
[１２] 　 李惠霞ꎬ 刘永刚ꎬ 王蒂ꎬ 杨富银. 马铃薯晚疫病菌培养条件
的研究[Ｊ] . 中国马铃薯ꎬ ２００７ꎬ ２１(４): ２０３－２０５.
Ｌｉ ＨＸꎬ Ｌｉｕ ＹＧꎬ Ｗａｎｇ Ｄꎬ Ｙａｎｇ ＦＹ. Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｃｕｌ￣
ｔｕｒａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ[ Ｊ] . Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｏ￣
ｔａｔｏ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ ２００７ꎬ ２１(４): ２０３－２０５.
[１３] 　 李惠霞ꎬ 刘永刚ꎬ 张俊莲ꎬ 王蒂. 马铃薯对晚疫病水平抗性
的组织细胞学观察[ Ｊ] . 西北植物学报ꎬ ２０１５ꎬ ３５(８) :
１５５４－１５５９.
Ｌｉ ＨＸꎬ Ｌｉｕ ＹＧꎬ Ｚｈａｎｇ ＪＬꎬ Ｗａｎｇ Ｄ. Ｈｉｓｔｏｃｙｔｏｌｏｇｙ ｏｆ ｉｎｔｅｒ￣
ａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ ａｎｄ ｐｏｔａｔｏ ｃｕｌｔｉｖａｒ
ｗｉｔｈ ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ[Ｊ] . Ａｃｔａ Ｂｏｔａｎｉｃａ Ｂｏｒｅａｌｉ￣Ｏｃｃｉ￣
ｄｅｎｔａｌｉａ Ｓｉｎｉｃａꎬ ２０１５ꎬ ３５(８): １５５４－１５５９.
[１４] 　 Ｄｕｃｋｅｔｔ ＪＧꎬ Ｒｅａｄ ＤＪ. Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅꎬ
３２３　 第 ２期　 　 　 　 　 　 　 　 刘甜甜等: 马铃薯晚疫病菌侵染的 Ｓｏｌｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌａｖｉｎｅ荧光染色方法研究
３ꎬ３′￣ｄｉｈｅｘｙｌｏｘａｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ ｉｏｄｉｄｅꎬ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ
ｏｆ ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ ｆｕｎｇｉ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｉｖｅｒｗｏｒｔ ｒｈｉｚｏｉｄｓ ａｎｄ
ｅｒｉｃｏｉｄ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｒｏｏｔｓ[Ｊ] . Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌꎬ １９９１ꎬ １１８(２):
２５９－２７２.
[１５] 　 陶明福ꎬ 车海彦ꎬ 罗大全. 海南长春花黄化病植原体的 ＤＡＰＩ
荧光显微检测[Ｊ] . 热带农业工程ꎬ ２０１０ꎬ ３４(２): １７－２０.
Ｔａｏ ＭＦꎬ Ｃｈｅ ＨＹꎬ Ｌｕｏ ＤＱ. Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｏｆ
Ｈａｉｎａｎ ｐｅｒｗｉｎｋｌｅ ｙｅｌｌｏｗｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ[Ｊ] . Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ ２０１０ꎬ
３４(２): １７－２０.
[１６] 　 Ｈｏｃｈ ＨＣꎬ Ｇａｌｖａｎｉ ＣＤꎬ Ｓｚａｒｏｗｓｋｉ ＤＨꎬ Ｔｕｒｎｅｒ ＪＮ. Ｔｗｏ
ｎｅｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅｓ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｆｏｒ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ
ｃｅｌｌ ｗａｌｌｓ[Ｊ] . Ｍｙｃｏｌｏｇｉａꎬ ２００５ꎬ ９７(３): ５８０－５８８.
[１７] 　 Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＣＴꎬ Ｃａｒｒｏｌｌ Ａꎬ Ａｋｈｍｅｔｏｖａ Ｌꎬ Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ Ｃ.
Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｒｅｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ
ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｒｏｏｔｓ[ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２０１０ꎬ
１５２(２): ７８７－７９６.
[１８] 　 Ｏｌｉｖｅｒ ＪＰꎬ Ｃａｓｔｒｏ Ａꎬ Ｇａｇｇｅｒｏ Ｃꎬ Ｃａｓｃóｎ Ｔꎬ Ｓｃｈｍｅｌｚ ＥＡꎬ
Ｃａｓｔｒｅｓａｎａ ＳＣꎬ Ｌｅóｎ ＩＰ. Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｃｏｎ￣
ｓｅｒｖｅｄ ｐｌａｎｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｍｏｓｓｅｓ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔａꎬ
２００９ꎬ ２３０(３): ５６９－５７９.
[１９] 　 Ｔａｋａｈａｒａ Ｈꎬ Ｄｏｌｆ Ａꎬ Ｅｎｄｌ Ｅꎬ Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ Ｒ. Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔ￣
ｒｉｃ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ ｂｉｏｔｒｏｐｈｉｃ
ｈｙｐｈａｅ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｅａｖｅｓ ｆｏｒ ｓｔａｇｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎ￣
ｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｊꎬ ２００９ꎬ ５９(４): ６７２－６８３.
[２０] 　 Ｋｎｉｇｈｔ ＮＬꎬ Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ ＭＷ. Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ
ｏｆ ｗｈｅａｔ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄ￣
ｏｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌꎬ ２０１３ꎬ ６２(３): ６７９－６８７ .
[２１] 　 Ｌｅｏｎ ＲＦꎬ Ｒａｙｍｏｎｄ ＥＫ. Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ｖｉａｂｌｅ
Ｂａｔｒａｃｈｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｄｅｎｄｒｏｂａｔｉｄｉｓ[Ｊ] . Ｊ Ｐａｒａｓｉｔｏｌꎬ ２０１２ꎬ ９８
(３): ５０９－５１２.
[２２] 　 Ｌａｔｉｊｎｈｏｕｗｅｒｓ Ｍꎬ ｄｅ Ｗｉｔ ＰＪꎬ Ｇｏｖｅｒｓ Ｆ. Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ ａｎｄ
ｆｕｎｇｉ: ｓｉｍｉｌａｒ ｗｅａｐｏｎｒｙ ｔｏ ａｔｔａｃｋ ｐｌａｎｔｓ[Ｊ] . Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏ￣
ｂｉｏｌꎬ ２００３ꎬ １１(１０): ４６２－４６９.
(责任编辑: 张 平)
４２３ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷