全 文 ：第 5 卷
V OI
.
5 No
第 4 期
4
草 地 学 报
AC I
,
A A G RI 召11A SINCA
1卯7 年
1卯7
直立型扁蓓豆成熟胚离体培养
器官发生组织学研究
金 洪 李 高 鸟云飞
(内蒙古农牧学院草原科学系 , 呼和浩特 01 0 18 )
摘要 : 本文首次报导了直立型扁楷豆(几伦之法〕勿瀚 门动 e几必。 (L . )甸ak cv . ‘Zhi li ’ )成熟胚离体培
养中器官发生的组织学研究 。 选用 MS 培养基并附加不同浓度的外源激素 IA A 、 NAA 和 BA 进行培
养 , 定期做冰冻切片进行观查 。 结果表明 二IA A 、 NA A 与 BA 的配合使用对直立型 扁箱豆成熟胚愈伤
组织的诱导和不定芽的器官发生有显著的促进作用 。 不定芽起源 于胚轴的皮层细胞 , 或表皮和皮层
细胞同时启动 。 愈伤组织的形成可分为三个时期 : 启动期 、分裂期 、形成期 ; 不定芽形成全过程可分
为四个阶段 : 启动阶段 、芽原基形成阶段 、叶原基形成阶段和不定芽形态建成阶段 。
关键词 : 直立型扁楷豆 ; 成熟胚 ; 不定芽 ; 形态建成
1 前言
扁稽豆 (Me l沥to瀚 几“触n ic。 (L . )划ak )属豆科扁楷豆属多年生草本植物 , 在我国北 方地
区普遍表现出抗旱 、抗寒 、耐痔薄 、抗风沙 、草质优良 、营养价值高 、适应性强等特点。 但由于茎
多斜卧地面 、产草量低 , 故一般只能放牧利用 。 为有效利用这一优良种质资源 , 我们采用多次
混合选择法成功地选育出直立型扁蓓豆品种 , 使其又具有植株直立 、叶片较大 、开花整齐 、早
熟 、耐盐碱 、产量和结实率较高等优良性状 (乌云飞等 , 19 3 )。
近年来对豆科牧草的组织培养发展很快 , 利用胚 、胚轴 、子叶 、芽以及不同器官外殖体诱导
出愈伤组织 、腋芽 、不定芽和胚状体 , 许多物种还得到 了完整植株 。 但不定芽形态建成组织学
方面的研究还很少 , 而对其它科植物类似的报导也不多见 (杨增海 , 19 87 ;张棋等 , 19 89 ;桂耀林
等 , 1夕男);刘玉喜等 , 19 2) 。 本文对愈伤组织和不定芽的形态建成进行 了组织学观察 , 详细研
究 了愈伤组织和不定芽的生产部位和器官的形成过程 , 同时就外源激素对胚发育 的影响进行
了初步探讨 。
2 材料和方法
供试种子于 19 5 年采 自内蒙古农牧学院牧草试验地 。 将种子洗净 , 置于培养箱(25 ℃ )内
水浸 48 小时后选取吸涨的种子 , 在 75 %酒精中浸泡 30 秒后转人 0 . 2 % H邪l: 溶液中消毒 巧 分
钟 ,无菌水冲洗 3 次 。 在无菌条件下剥去种皮 , 将切除子叶后 的胚浅插 于固体培养基进行培
养 ,基本培养基为 MS , 附加不同浓度的 IAA 、N从 和 BA , pH 值 6 . 5 , 培养温度为 25 士 1℃ 、蔗糖
3 %
、琼脂 0 . 9 % , 每 日光照 ro 一 12 小时 , 光照强度为 150 一 2 (X 刃h 以 。
当外植体诱导出愈伤组织或不定芽后 , 分期取材 , 用冰冻切片机切片 , 切片厚度为 10脚 ,
用铁矾苏木精染色 , 在光学显微镜下观察愈伤组织和不定芽的发生以及器官的形成过程 。
3 结果分析
3
.
1 愈伤组织的诱导和增殖
当把切除子叶后 的直立型扁蓓豆成熟胚接人附加有不 同浓度的 IAA 、NAA 和 BA 或只附
2 7 6 草 地 学 报 1卯 7 年
加 NA A 和 BA 的 MS 固体培养基 8 一 12 日后 , 可以观察到疏松的白色愈伤组织在一些外植体的
胚轴和切面形成 , 其愈伤组织 的诱导率较高 , 达到 37 . 4 % 。 一个月后 , 愈伤组织的直径达到 4
一 7
~
, 呈乳白色团块 。 通过镜检观察 , 直立型扁蓓豆成熟胚愈伤组织形成可分为 3 个时期 :
启动期 、分裂期和形成期 , 其形成过程与某些其它物种愈伤组织的形成具有相似之处 (桂耀林
等 , 19 男〕)。
3
.
1
.
1 启动期 : 该时期需经 3 一 5 日 , 是愈伤组织形成的起点 , 外观上无明显的变化 , 切 片镜
检 , 可观察到细胞体积有所增大 , 内容物增多 , 核质和细胞质浓密 。
3
.
1
.
2 分裂期 : 切面形成许多小乳突 , 胚轴上数 目相对较少 。 切片观察可见细胞排列紧密 , 细
胞核比例很大 , 细胞数 目明显增多 , 有许多细胞处于不同分裂时期 。
3
.
1
.
3 形成期 : 细胞分裂速度加快 , 细胞数 目显著增加 , 形成 白色疏松 的愈伤组织 团块 , 一个
月后直径可达到 4 一 7~
。 当把这种疏松的愈伤组织切成 1~ 见方的小块转 移到相 同的 MS
固体培养基上继代培养时 , 可继续增殖 。
经一个月对 5 个不同处理材料的愈伤组织诱导的情况观察(见表 1 ) , 附加 IAA 、N AA 和 BA
愈伤组织诱导率较高 。
表 1 不同浓度附加激素对直立型扁蓓豆成熟胚愈伤组织诱导的影响 (30 天 )
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2 一 3
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.
2 胚培养不定 芽的分化
直立型扁蓓豆成熟胚离体培养能够产生完整的不定芽 , 较成功的培养基是 MS + IAA (0 . 25
一 0
.
5 1 1可L) 十 N从(0 . 5 11 1『L) 十 BA (1 一 2 n l岁L) , 接种 3 日后 , 在下 、上胚轴陆续产生不定芽 , 将
带有不定芽的外植体在相 同培养基中继代培养 , 不定芽可生长成幼茎 , 不定芽的分化率为 20
一 30 % 。
直立型扁楷豆成熟胚接种 l 一 2 日后 , 胚轴 由白色变为淡绿色 , 一周后转变为绿 色 , 并表现
出向地性趋势 。
外植体接种 3 一 5 日后 , 最早出现不定芽的部位是下胚轴上部与子叶基部之间 。 首先 出现
许多淡黄色小斑点 , 随后在其中央出现亮绿色半球形突起 , 此后 1 一 2 日后发育成芽的类似物 ,
并逐渐长大形成不定芽 。 下胚轴下部出现黄色小斑点 的时间较晚 (7 一 10 日 ) , 形成不定芽 的
时间差别较大 。 形成不定芽最晚的部位是上胚轴 , 在接种 巧 日以后才从胚轴表面陆续 出现不
易用肉眼观察到的小突起 , 不同步地长成完整的不定芽约需 20 日左右 。

草 地 学 报 1叩7 年
突起 (图 2 ) , 这是黄色小斑点的雏形 。
3
.
3
.
3 叶原基形成阶段 在胚培养 ro ~ 巧 日可观察到幼叶原基的形成和发育过程 。 芽原基
侧方的分生组织开始进行平周分裂 , 产生一团排列紧密 , 核大而细胞质浓的小型细胞构成叶原
基 。 在不定芽的形态建成过程 中 , 随着细胞的不断分裂 , 芽原基不断形成 , 叶原基也逐渐成熟 ,
而新的叶原基又从芽顶端 的侧生分生组织生成 , 如此可形成完整的不定芽。 这一过程就是外
观在胚轴上形成 的黄斑 , 并在 中间出现 了亮绿色小突起 , 逐渐成为肉眼可辩的芽(图 3 )。
3
.
3
.
4 不定芽结构建成阶段 在胚离体培养 3 一 5 周后陆续形成完整的不定芽 。 不定芽外包
有若干幼叶 , 茎尖分生区为锥形 , 其顶端可分辩出原套一原体的组织结构 , 原套为 2 层排列整
齐的细胞构成 , 包围着其下方的一团个体较小 , 排列不太整齐的原体 。 在顶端分生组织中央位
置的表面细胞被认为是原始细胞 , 形成原始细胞层 , 其下面是中央母细胞区 , 再下面是肋状分
化组织 (伊销 , 19 82 ; R笔hav an , 19 83 ) ,最外面包裹若干幼叶而形成完整的不定芽 (图 4 )。
随着不定芽的发育生长 , 在幼茎出现初生叶 , 在其叶腋处有叶芽形成 , 腋芽的结构与不定
芽相似 Q
3
.
4 胚状体的形成
当愈伤组织诱导出来并形成乳白色的疏松团块后 , 在愈伤组织 中出现经分裂而形成的细
胞团 , 与周围细胞界限分 明 , 其特点表现为细胞小 、核大 、细胞质浓密 。 由于细胞分裂速度快 ,
可见到多核细胞 。 愈伤组织 中的这种特殊细胞就是胚性细胞(谷祝平等 , 19男〕) , 它们是体细胞
胚发生的最初起源 。 胚性细胞团经细胞分裂不断增大 , 发育为体细胞胚的球形胚阶段 。
在不定芽形态建成的研究中还发现 , 胚轴表面不但可形成不定芽 , 同时也产生胚状体的原
始体 。 外殖体在离体培养 ro 一 巧 日 , 分生细胞团可分别形成芽原基和胚状体前体 , 它们在外
观上难以用肉眼辨认 , 只能在胚轴表面看见不平的小突起 。 胚状体的起源与不定芽相同 , 也是
由表皮和皮层细胞分裂形成 。 这种细胞团与周围的薄壁细胞有明显的分界 。 本试验研究观察
到的只是胚状体的球形原始体 , 未能观察到以后的发育过程 。 球形原始体的细胞具有极性 , 近
顶端的细胞个体较小 , 染色较深而且排列十分紧密 , 其下方的细胞较大 , 染色较浅 , 排列相对较
疏松 。 由于这些细胞 的分裂和发育 , 将会形成完整的胚状体(谷祝平等 , 19 男〕; R 川g a 等 , 19 85 )。
4 结论与讨论
4
.
1 直立型扁蓓豆成 熟胚经 离体培 养可 以成功地诱导出愈伤组织 和不定芽 , 以附加 IAA
(0
.
25 一 0
.
5 n官L) 、N从(0 . Slllg/ L) 和 BA (1 一 Zln留L) 的 M S 固体培养基为适宜 。 愈伤组织 的诱
导可分为 3 个时期 :启动期 ·分裂期和形成期 ;不定芽形成的全梦程分为 4 个阶段 :启动阶段 、
芽原基形成阶段 、叶原基形成阶段和不定芽形态建成阶段 。 IAA 、NAA 和 BA 的搭配使用对直
立型扁楷豆成熟胚愈伤组织的诱导和不定芽的形成具有显著的促进作用 。
IAA 和 N从 均属生长类激素 , 在组织培养的多数情况都是选择其中一种 , 本研究中同时
使用 IAA 和 NA A 的效果要 比单纯使用 NAA 的效果明显好的多 。 这表明 IAA 、N AA 以及细胞分
裂素 BA 三种外源激素与直立型扁蓓豆成熟胚的内源激素相互作用对诱导愈伤组织和不定芽
的效果较好 。 另外 , 本试验 中的外殖体是切除了子叶的成熟胚 ,使胚在发育中的激素和养分主
要 由培养基提供 , 这样就有利于分析外源激素对胚的生长 以及愈伤组织和不定芽形成过程 中
的作用 。
4
.
2 直立型扁蓓豆成熟胚离体培养中 , 不定芽起源于胚轴的表皮和皮层细胞 , 为外起源 , 形成
第 4 期 金 洪等 直立型扁楷豆成熟胚离体培养器官发生组织学研究
的不定芽结构与正常芽相同。
曾有学者对不同物种的胚进行培养都得到了不定芽 , 许多情况下是从外植体表皮或是皮
层细胞平周分裂而形成的 , 通过组织学 观察证明是外起源 (谷祝平等 , 1夕男〕) , 直立型扁楷豆胚
轴上分化形成的不定芽 , 其起源与其它学者的研究结果是一致的 。
对于不定芽的形成过程 , 有的学者分为 3 个阶段(A ro n ld , 19 85 ) , 也有的学者分为 4 个阶段
(谷祝平等 , 19哭)) , 我们把直立型扁蓓豆不定芽的分化分为 4 个阶段是从形态 比较上更容易区
分 。
4
.
3 胚状体是植物组织培养形态发生最常见和重要的方式 , 通过对直立型扁稽豆成熟胚的离
体培养 , 从愈伤组织和胚轴上都可诱导出胚状体的球形原始体 。 在 同一培养基和同一培养程
序中即可诱导形成愈伤组织和不定芽 , 又可产生胚状体的情况并不多见 , 但胚状体只停留在球
形胚状体的原始阶段 , 这可能是由于培养基的种类和激素配 比不合适所致 , 对于胚状体的发育
尚需进一步研究 。
参 考 文 献
9
l0
乌云飞 、玉柱 、石风铃 , 1卯3 , 直立型扁蓓豆的选育及其生物特性的研究 . 内蒙古草业 , 3 : 51 一 53
杨增海 , 1989 , 园艺植物组织培养 . 北京 :农业出版社 , 42 一 13 7
桂耀林 , 19 叭) , 植物组织培养 . 北京 :科学出版社 , 54 一 65
刘玉喜 , 1卯2 , 红松成熟胚离体培养器官发生组织学研究 . 植物研究 , 12 (2) : 189 ~ 193
张 棋 , 19 89 , 三七胚培养中的胚胎发生 . 植物学通报 , 6 (4 ) : 23 6 一 239
伊稍 K . (李正理译 ) , 1982 , 种子植物解剖学 . 上海 :上海科学技术出版社 , 191 一 1盯
儿沙a v an Y . (陈祖铿译 ) , 19 83 , 维管植物实验胚胎发生 . 北京 :科学出版社 , 212 一 2 13
谷祝平 、郑国昌 , 19喇〕, 玉米愈伤组织培养中体细胞胚发生的研究 . 兰州大学学报 (自然科学版 ) , 26 (4 ) : 12 1
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2 80 草 地 学 报 1叩 7 年
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