全 文 ：美国花旗松离体胚愈伤组织诱导与茎芽分化的研究*
陆燕元 , 　樊军锋**
(西北农林科技大学林学院 ,陕西 杨陵 712100)
摘　要:以美国花旗松成熟胚为外植体进行离体培养诱导不定芽 。试验和统计分析表明 ,在供
试的 MS、N6、SH、GD、WPM 、DCR(改良)6种培养基中 , DCR改良的培养基为花旗松芽诱导的
最佳的初代培养基。 DCR+6-BA2. 0 mg /L是不定芽诱导的最佳组合 ,外植体不定芽诱导率达
74%,平均增殖系数为 6,最大增殖率为 8。 NAA及 2, 4-D的添加均不利于芽的诱导;培养基
中加入 0. 1%的活性炭有利于不定芽的生长和伸长 ,但对不定芽的分化无显著的影响。
关键词:美国花旗松;成熟胚;不定芽;诱导率;增殖系数
中图分类号:S722. 37　　文献标识码:A　　文章编号:1001-7461(2005)02-0096-04
Form ation o fC allus T issue and A dventitious Buds from Em bryos ofD ouglas-fir
LU Yan-yuan, 　FAN Jun-feng
(College ofF orestry, Northwest A＆F Un iversity, Yang ling, Shaanxi 712100, Ch ina)
Abstract:Thema tu re embryo s of Doug las-fir we re used as explan ts to induce adventitious buds onM S, N6 , SH ,
GD ,WPM , DCR med ia. The results showed that the optim almedium wasDCR for basic in vitro cultu re. DCR+6-
BA2. 0 mg /L w as the optima l combination , on which 74% pe r cent o f exp lants induced w ith an average rate o f
propaga tion 6, the highest ra te of propagation 8. Addition o fNAA and 2, 4-D wou ld inhibit the fo rmation of adven-
titious buds. A ctivated charcoa l promoted the g row th of adven titious buds, but it not had impo rtan t affect in form a-
tion of adventitious buds.
Key words:Doug las-fir;m atu re emb ryo;adventitious bud ;induce rate ;propaga tion ra te
　　针叶树种组织培养研究开始得比较晚 ,因为针
叶树中仅少数有中等生根能力 , 多数属难生根树
种 [ 1] 。不定芽及嫩梢的诱导率低 ,嫩梢生根困难 、
外植体污染率高等都是针叶树树种的组织培养中存
在的主要问题[ 2] 。近年来 ,针叶树的离体培养植株
再生研究取得了可喜的进展[ 3 ～ 10] 。美国花旗松离
体胚培养及芽的诱导在国内尚未见有报道 ,国外虽
有研究 [ 11, 12] ,但是芽的诱导率和增殖率还相对较
低 ,需要作进一步的研究。
花旗松属松科黄杉属 ,原产北美洲西部 ,是世界
上最重要的用材树种之一。我国在庐山 、北京植物
园 ,延安树木园曾有少量的引种栽培。但由于其结
实间期长 ,种子产量低 ,种子远远不能满足实际需
要 ,而且扦插繁殖要用小于 10年生枝条 ,这就使其
引种推广受到很大的限制。组织培养是其解决良种
快繁的主要途径之一。
1　材料与方法
1. 1　材料
供试的材料为从美国购进的成熟饱满的美国花
旗松 (P seudotsuga menziesii)种子 。
1. 2　材料的消毒与接种
选择成熟 、饱满的花旗松种子 ,用水充分浸泡 ,
使其吸水膨胀后 ,用 0. 1%KM nO 4溶液消毒 20m in,
用水冲洗干净后去掉种皮 ,经 70%酒精消毒 20 s并
用无菌水冲洗两次 , 0. 1%的 HgC l2消毒 8 ～ 10m in,
无菌水冲洗 5 ～ 6次 ,无菌条件下剥出胚 ,水平放置
于培养基中。
西北林学院学报　2005, 20(2):96 ～ 99
Journa l of Nor thw est Fore stry University
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
*
**
收稿日期:2004-08-09　　修回日期:2004-11-03
基金项目:国家林业局 “ 948”项目(2000-04-03)
作者简介:陆燕元(1979-),女 ,广西南宁人 ,硕士研究生 ,主要从事林木遗传育种和林木生物技术工作。
通讯作者:樊军锋。
1. 3　培养基
1. 3. 1　芽诱导培养基　不定芽诱导的基本培养基
采用 MS、GD、SH、N6、WPM 、DCR(改良:K 2SO4取代
原来的 NH3NO 4 ,有机元素中添加 2. 0mg /L的谷酰
胺 )6种培养基 ,附加 3%蔗糖 、0. 6%的琼脂 、pH5. 8
～ 6. 0、不同浓度的 6-BA 、NAA 、2, 4-D。
诱导率 =(产生不定芽的胚数 /接种胚的总数 )
×100%
增殖系数 =(不定芽的总数 /产生不定芽的胚
数 ) ×100%
1. 3. 2　芽生长和增殖培养基　包括不定芽的生长
和增殖 ,不定芽的生长以采用 DCR(改良)和 SH为
基本培养基附加 1%蔗糖 、 0. 6%琼脂 、 pH 5. 8和
0. 1%的活性炭 ,不加任何激素 ,每 30 d继代 1次 。
不定芽增殖 l /2DCR(改良 ), l /2 SH (大量元素减
半 )为基本培养基 ,含 6-BA 0. 05㎎ /L、 1%的蔗糖 、
0. 6%琼脂和 0. 1%的活性炭 、pH 5. 8。
1. 4　培养条件
培养温度 25±2℃、每日光照时间 14 h、光照强
度 2 000 ～ 3 000 lx、培养室相对湿度 60% ～ 80%。
1. 5　每个处理设 3个重复
2　结果与分析
2. 1　离体胚愈伤组织的诱导及不定芽的产生
接种 3 d后.在培养基上的胚子叶张开 , 7 d后
外植体原有的芽和子叶变绿 ,并逐渐脱分化成愈伤
组织 ,愈伤组织在原培养基上生长分化出不定芽点 ,
芽点再逐渐长成芽;个别的胚 7 d后子叶变变绿 , 10
d后开始变形 ,增粗 、缩短直接形成芽体 ,这种芽体
在继代培养中容易分化出芽 。 (图 1 , 2, 3)在生长过
程中 ,每 30 d换一次新鲜的培养基 ,以免养分耗尽
而死亡。
图 1　愈伤组织分化形成的不定芽
Fig. 1　The adven titious bud s of form ation
from callu s tissue d ifferent iation
图 2　子叶上形成的芽体在
继代培养中分化的丛生芽
F ig. 2　Th e grow ing th ick ly bud s of d ifferen tiation from
coty ledon d irect ly form ation buds in con tinu ing cu ltu re
图 3　丛生芽在继代培养
中的生长与伸长
Fig. 3　The grow ing and elongation of
thick ly buds in con tinu ing m ed ium
2. 2　影响愈伤组织形成和不定芽分化的因素
培养基类型以及培养基中所含的激素种类及浓
度对不定芽的诱导起重要作用 ,但对愈伤组织的影
响不是很显著。在试验的范围内愈伤组织的诱导率
都达到 70%以上 。花旗松的不定芽从子叶上直接
分化的很少 ,主要是从愈伤组织中分化出来。
2. 2. 1　基本培养基对不定芽的影响　将消毒后的
种胚接种到均附加 6-BA0. 5mg /L的 6种培养基中 ,
研究基本培养基对芽诱导和增殖的影响。结果由表
1可见 ,在附加 6-BA0. 5 mg /L时 ,基本培养基种类
对诱导芽的萌发和增殖影响较大 。尽管 DCR(改
良 )、SH、WPM三种培养基对芽的诱导率均在 60%
以上 ,但 DCR(改良)诱导效果最佳 , WPM次之 ,最
差的是 MS和 N6。经观察 ,以 DCR(改良 )为基本培
养基的组合 ,芽的萌动时间比其他的要早 10 d左
右 ,在 MS和 N6上生长的胚 ,子叶也能张开 ,并且也
有少量能够诱导出芽 ,但是愈伤组织和芽的生长后
期容易褐化枯死 ,这可能是 MS和 N6培养基
表 1　不同培养基对外植体诱导不定芽的影响
Tab le 1　 In flu ence of differen tm ed ium on exp lant’ s
adven titious bud s induction
基本
培养基
接种数
/个
分化芽
数 /个
诱导率
/%
增殖芽
数 /个 增殖系数
DCR改良 19 13 68 36 4. 5
SH 60 36 60 137 3. 8
WPM 14 9 64 42 3. 5
GD 50 24 48 70 2. 9
MS 40 11 28 66 4. 0
N6 40 5 13 16 3. 2
中含有高浓度的 NH+4 和 NO -3 所致 ,这与高盐浓度
的培养基 MS不利于松属器官的分化的结论一
致[ 13] 。相对于 MS和 N6, DCR改良培养基中降低
了 NO -3 、C l-、K+和 NH +4 的浓度 , 提高了 Ca2+和
Mn
2+的浓度 ,因此 ,以 DCR改良培养基为初代的最
97第 2期　　　　　　　　　　　陆燕元 等　美国花旗松离体胚愈伤组织诱导与茎芽分化的研究　　　　　　　　　　　
适基本培养基。
对该因素进行 q法检验 ,由表 2可知 ,基本培养
基 DCR改良和 SH之间差异不显著 , WPM 、GD和
MS之间差异不显著 ,但它们于 DCR改良和 SH之
间差异显著 , N 6于上两组差异都显著 。
表 2　不同培养基对不定芽形成的差异性比较
Tab le2　The comparison of difference of basa lm ed ia
基本培养基 平均诱导率 /% 平差异显著性
DCR改良 59. 36 A
SH 38. 98 A
W PM 29. 8 B
GD 28. 1 B
MS 26. 5 B
N6 15. 44 C
　　表中的字母表示 α=0. 05显著水平 ,凡是相同字母标记的即为
差异不显著 ,不同字母标记的即为差异显著。
2. 2. 2　6-BA和 NAA组合对不定芽诱导的影响　
以 DCR改良的培养基为基本培养基 ,研究 6-BA和
NAA配合对不定芽诱导的影响 。由表 3可看出 ,当
6-BA固定在某一浓度时 ,随着 NAA浓度从 0 ～ 1. 0
的的提高 ,愈伤组织的形成量也提高 ,但是芽的分化
表 3　不同植物生长调节剂对外植体诱导不定芽的影响
Tab le 3　 In fluen ce of d ifferen t p lan t grow th regu lators on
exp lan ts adven titious bud s induction
编号 6-BA /
m g L - 1
NAA /
m g - 1
接种数
/个
产生芽
数 /个
芽诱导
率 /%
平均增
殖系数
1
2
3
4
0. 5
0. 0
0. 1
0. 5
1. 0
19
16
16
19
13
6
1
1
68
38
6
85
4. 5
2. 0
2. 0
2. 0
5
6
7
8
1. 0
0. 0
0. 1
0. 5
1. 0
11
10
10
18
8
6
6
0
72
60
60
0
5. 4
3. 0
2. 0
0
9
10
11
12
2. 0
0. 0
0. 1
0. 5
1. 0
27
61
11
21
20
13
3
0
74
28
27
0
6. 0
3. 0
2. 0
0
13
14
15
16
4. 0
0. 0
0. 1
0. 5
1. 0
16
15
16
15
6
1
1
0
38
7
6
0
3. 0
2. 0
2. 0
0
率逐渐降低 ,以至完全不分化;当 NAA浓度为 0, 6-
BA浓度从 0. 5 ～ 2. 0逐渐递增时 ,芽的诱导率和增
殖率也逐渐提高 ,而 6-BA提高至 4. 0 mg /L时 ,诱
导率下降到了 38%,芽的增殖系数为 3,说明细胞分
裂素在一定范围内对于芽的诱导起着关键的作用 ,
但浓度过高时 ,它也会限制芽的分化 。 6-BA0. 5 ～
2. 0 mg /L +NAA0 ～ 0. 1 mg /L范围内时诱导率较
好 ,平均增殖率是 4 ～ 6,最大增殖率为 8。对试验进
行单因子效益分析 , 结果表明 , 在供试的范围内 ,
DCR改良培养基对芽的诱导率最高 ,当 6-BA浓度
为 2. 0 mg /L时 ,不定芽的诱导率最高。 NAA的添
加在试验供试的范围内表现的是负效应 。
由表 4可知 ,对美国花旗松不定芽影响较大的
植物激素种类是 6-BA ,其次是 NAA。
表 4　表 3资料的方差分析
Tab le 4　Varan ce analys is of the data in Tab le 3
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 临界值
6-BA 7809. 688 3 2603. 229 13. 218** F 0. 05(3, 9)
NAA 2503. 688 3 834. 5625 4. 237* 　　=3. 86
误差 1772. 563 9 196. 9514
总变异 12085. 94 15
2. 2. 3　6-BA和 2, 4-D组合对不定芽诱导的影响　
根据前人的研究 ,对于离体胚愈伤组织的诱导 , 6-
BA与 2, 4-D配合使用可使愈伤不断增殖 ,长期继代
保持活性 [ 2] 。但在试验中发现 ,添加 2, 4-D形成的
愈伤组织致密坚硬 ,玻璃化及褐化都很严重 ,愈伤组
织无分化能力。表 5表明 , 2 , 4-D的添加对芽的诱
导不利 ,特别是当 6-BA /2, 4-D的比值较低时 ,愈伤
组织毫无分化能力 。
表 5　6-BA和 2, 4-D配合对外植体诱导不定芽的影响
Tab le 5　 Inf luen ce of comb in ation of 6-BA and
2, 4-D on exp lan ts adventi tiou s buds indu ct ion
编号 6-BA
/m g L- 1
2, 4-D
/mg L- 1
接种外植
体数 /个
产生芽外
植体数 /个
芽的诱
导 /%
平均增
殖系数
Ⅰ 0. 5 1. 0 20 0 0 0
Ⅱ 0. 5 0. 1 13 1 8 2. 5
Ⅲ 4. 0 1. 0 52 2 4 2
表 6　活性炭对外植体诱导不定芽的影响
Tab le 6　 In fluen ce ofA ctivated ch arcoa l on exp lants adventit iou s buds indu ction
激素配比
/mg L- 1
添加活性炭 0. 1% 无活性炭
接种外植
体数 /个
产生芽外
植体数 /个
芽的诱
导率 /%
平均增
殖系数
接种外植
体数 /个
产生芽外
植体数 /个
芽的诱
导率 /%
平均增
殖系数
Ⅰ:6-BA0. 5+NAA0 9 6 67 2. 5 11 8 72 4. 5
Ⅱ:6-BA2. 0+NAA0 11 8 74 4. 7 15 12 80 4. 9
Ⅲ:6-BA 2. 0+NAA0. 5 11 3 27 2. 0 8 2 25 3. 0
Ⅳ:6-BA0. 5+ 2, 4-D0. 1 8 2 25 1. 5 20 2 10 1. 2
98　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　西北林学院学报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　20卷
2. 2. 4　活性炭对不定芽诱导的影响　表 6表明 ,活
性炭的添加对芽的诱导在试验供试的范围内没有明
显的促进作用 。在较适合芽诱导的 Ⅰ和 Ⅱ的组合
中 ,活性炭的添加反而使芽的诱导率稍有下降 ,这可
能是由于活性炭对激素有吸附作用 ,影响了不定芽
的分化;而在不利芽诱导的 Ⅲ和Ⅳ组合中 ,可能是由
于活性炭对过多激素的吸附 ,芽的诱导率反而有所
提高。
2. 3　不定芽的生长和增殖
将胚和愈伤组织分化产生的不定芽分别转入生
长培养基和增殖培养基中 ,发现部分芽能够进一步
分化产生丛生芽 ,而有部分芽子干枯死亡 ,加入活性
炭对其有一定的缓解 ,但也不能完全解决 。
表 7　不同培养基对不定芽增殖的影响
Tab le 7　 In fluence of d ifferen tm edia on p ropagation
of adven titiou s buds
培养基
接种不
定芽数
/个
30 d后
不定芽
数 /个
30d后不
定芽增
殖率 /%
30d后
不定芽枯
死数 /个
30d后
不定芽枯
死率 /%
1 /2DCR 29 139 4. 8 7 24
1 /2SH 30 156 5. 2 6 20
　　表 7表明 ,两种培养基对不定芽的增殖差异不
是很大 , 1 /2SH对不定芽的增殖率较大 , 1 /2DCR不
定芽的增殖率较小 ,且芽子的枯死率较高.在培养基
中添加 0. 1%的活性炭 ,可以使其枯死率降低 3 ～
4%,这可能是由于活性炭吸附了培养基中的有害物
质 ,使培养基更有利于芽子的生长和增殖 。
3　结论与讨论
在针叶树的离体繁殖中 ,初代培养芽苗分化的
启动通常受基本培养基中盐分及浓度的调控 ,所以
在初代培养中 ,基本培养基的选择尤为重要 。一般
来说 ,高盐浓度的培养基 MS不利于针叶树器官的
分化[ 11] 。在 DCR改良培养基上外植体不定芽诱导
及增殖系数均较优于其他供试的 5种培养基。
植物调节剂种类和配比对美国花旗松不定芽诱
导起关键的作用。 NAA和 2, 4-D有利于愈伤组织
的诱导 ,但不利于不定芽的诱导。对于花旗松不定
芽的形成 , DCR+6-BA0. 5 ～ 2. 0mg /L+NAA0 ～ 0. 1
对外植体诱导率较高 , MS和 N 6最差 。 DCR +6-
BA2. 0 mg /L是美国花旗松离体培养和不定芽形成
的最佳组合;活性炭对不定芽的分化影响不显著 ,但
有利于芽的生长和伸长 。
在试验中发现 ,已形成愈伤组织或有不定芽分
化的胚必须转移到另一种培养基中 ,用于转移的培
养基不含任何生长调节剂 ,同时降低蔗糖的浓度 ,若
继续保持在原来的培养基上 ,愈伤组织容易褐化而
诱导出的不定芽容易干枯死亡。
为使诱导产生的芽进一步生长或伸长 ,可利用
去掉植物激素 、降低矿质盐 、维生素及蔗糖浓度等方
法 ,附加一些吸附剂如活性炭等 ,对芽的伸长也有促
进的作用 [ 14] 。但在本试验中 ,不定芽的持续伸长形
成有效苗尚有一定的困难 ,用降低蔗糖浓度 (由 3%
降至 1%)、添加活性炭促使不定芽伸长效果也不理
想;另外 ,还存在愈伤组织及不定芽褐化 、干枯 ,切割
转接后易于死亡及生根较难等问题 ,类似的问题吴
若菁在马尾松离体胚组织培养中也曾经报道过 [ 9] 。
这也是下一步工作亟待解决的。
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