全 文 ： 人心果成熟胚离体培养及愈伤组织诱导
何　钢 1 , 文亚峰2 , 谢碧霞 3 , 雷　鲜 1 , 韩文军 1 , 何迎春 1
( 1.中南林学院生命科学与技术学院 ,湖南 株洲 412006; 2.中南林学院科学技术处 ,湖南株洲 412006;
3.中南林学院资源与环境学院 ,湖南 株洲 412006)
[摘　要 ] 对越南人心果的成熟种胚进行离体培养诱导无菌苗 ,最佳培养基是 M S,最佳激素配比是 N AA 0. 2 mg /L+ BA 5. 0
mg /L。 再以无菌苗的茎为外植体进行不定芽的诱导试验 ,其结果表明 ,不定芽诱导的最佳培养基及其激素配比为 M S+ N AA 0. 2
mg /L+ 2, 4-D 5. 0 mg /L,最佳环境条件是光照 13 h /d ,光强 2 000 lx,温度 30℃。而以无菌苗的幼叶为外植体进行愈伤组织诱导和继
代培养的最佳培养基为 MS+ 6-BA 2. 5 mg /L+ 2, 4-D 1. 0 mg /L+ IAA 0. 5 mg /L。 在继代培养过程中 , 5 mg / L或 10 mg /L的
AgNO3和 2 000 mg /L PV P可抑制愈伤组织褐变。
[关键词 ] 人心果 ; 成熟胚 ; 离体培养 ; 愈伤组织 ; 激素
[中图分类号 ] S667. 9; S604+ . 3　　　　　 [文献标识码 ] A　　　　　 [文章编号 ] 1003- 8981( 2004) 01- 0005- 03
In Vitro Culture of Mature Embryo and Callus Induction inManilkara zapota
HE Gang
1
, WEN Ya-Feng
2
, XIE Bi-Xia
3
, LEI Xian
1
, HAN Wen-Jun
1
, HE Ying-Chun
1
( 1. Co llege o f Life Science and Technolog y , CSFU , Zhuzhou 412006, Hunan, China;
2. Administra tive Division o f Resea rch and Ex tension, CSFU, Zhuzhou 412006, Hunan, China;
3. College o f Resource and Envir onment, CSFU , Zh uzhou 412006, Hunan, China)
Abstract: The matur e embryo o f V iet Nam Sapodilla was used a s explant to induce aseptic plantlet on MS w ith N AA
0. 2 mg /L+ BA 5. 0 mg /L. In the experiment, two schemes w ere car ried out in par allel. Sterile bud was induced
fr om the stem pa rt of the a septic plantlet; leav es induced fr om the em bryo w ere used to car ry out callus induction and
seconda ry cultur e. Results of the o r thogonal test indica ted that th e optimal medium fo r sterile bud genera tion is MS+
N AA 0. 2 mg /L+ 2, 4-D 5. 0 mg / L with 13 h /d and 2 000 lx lighting , room tempera ture 30℃ ; the optimal medium
fo r callus induction and seconda ry culture is MS+ 6-BA 2. 5 mg /L+ 2, 4-D 1. 0 mg /L+ IAA 0. 5 mg /L. AgNO3 with
a concentration o f 5 mg /L o r 10 mg /L and PV P o f 2 000 mg /L ar e the most effectiv e antiox idant to relief brow ning in
the subculture pro cess.
Key words: Sapodilla (Manilkara z apota) ; matur e embryo; in vitro culture; callus; ho rmone
人心果 Manilkara zapota属山榄科人心果属植物 ,是热带和亚热带常绿果树 [1 ]。原产墨西哥南部、中美洲、西
印度群岛一带、热带美洲、东南亚和印度等地区。 人心果主要供鲜食 ,也可加工制果酱、果汁、干片和果晶等 ,具清
心润肺的药效。人心果树体富含乳状汁液 ,是制造口香糖的高档环保胶料。人心果具有极大的开发利用价值 ,但生
产上良种缺乏 ,我国目前还未能形成经济栽培 ,产品加工和综合利用也没有起步。 植物组织细胞培养技术在农林
生产上的应用越来越受到人们的重视 [2 ] ,并在许多植物上有成功的报道 [3 ] ,如苹果 ,梨 ,枣 ,柠檬 ,猕猴桃 ,荔枝等 ,
国内外对人心果植物组织细胞培养的研究报道很少 [ 4] ,因此 ,开展组织细胞培养研究 ,对开发利用人心果有用次
生代谢物质和加速优良人心果品种的推广有着及其重要的意义 [ 5 ]。为此 ,我们从 2003年 3月开始以从越南引进
的人心果种子成熟胚为材料 ,进行了人心果成熟胚的离体培养及愈伤组织诱导研究 ,现将结果报道如下。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
供试材料为从越南购进的成熟的人心果种子。
1. 2　方法
经济林研究　 2004, 22 ( 1): 5-7
Nonwood　Forest　Research 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
[收稿日期 ] 2003-10-08
[基金项目 ] 中南林学院青年基金项目“用细胞悬浮法生产人心果胶研究” (编号: 0190)和国家“ 948”项目“人心果优良品种及培育技术引
进” (编号 2002- 29)的部分内容。
[作者简介 ] 何　钢 ( 1965- ) ,男 ,湖南湘潭人 ,副教授 ,硕士 ,主要从事经济林及生物技术教学和科研。
DOI : 10. 14067 /j . cnki . 1003 -8981. 2004. 01. 002
1. 2. 1　成熟胚的离体培养
把带黑色硬壳的人心果种子放入洁净的小烧杯 ,用蒸馏水配成的洗衣粉冲洗 ,再用蒸馏水冲洗 20 min,移
至超净台 ,用 70%的乙醇表面消毒 30 s,无菌水冲洗 3～ 4次 ,转入 0. 1%的升汞溶液中浸泡 10 min,用无菌水
冲洗 4次 ,每次 1～ 2 min,用解剖刀剖开种子 ,去除胚乳 ,再切下成熟胚 ,置于附加不同激素的 MS和 B5培养
基上 (蔗糖 30 g /L,琼脂 8 g /L, pH5. 8)。 培养器皿为 150 mL的三角瓶 ,用封口膜封口。按 NAA( 0. 1 mg /L,
0. 2 mg /L )和 BA( 5. 0 mg /L, 6. 0 mg /L)配比加入激素。使用空白对照 ,以确定人心果成熟胚离体培养诱导无
菌苗的最佳激素配比及后续实验的基础培养基。
1. 2. 2　不定芽的诱导
以从人心果成熟种胚离体培养获得的无菌苗茎段 ,切成长约 1 cm,接种到诱导不定芽的培养基上。培养基
为 MS培养基 ,激素配比采用 NAA( 0. 1 mg /L, 0. 2 mg /L, 0. 5 mg /L)、 2, 4-D( 1 mg /L, 3 mg /L , 5 mg /L ) 、
IAA( 0 mg /L, 0. 5 mg /L , 1 mg /L) 3因素 3水平的正交试验设计 ,每处理接种 30～ 40瓶不等。 并对温度、光照
时间和强度几个参数作对比实验 ,找到从人心果茎段诱导不定芽的最佳培养激素配比和培养条件。
1. 2. 3　愈伤组织的诱导
将无菌苗叶片切成约 0. 5 cm× 0. 5 cm大小的正方块 ,接种到诱导愈伤组织的培养基上。愈伤组织的诱导
培养基为 MS培养基 ,激素配比为 6-BA( 0. 5 mg /L, 2. 5 mg /L, 4. 0 mg /L)、 2, 4-D( 0 mg /L, 0. 5 mg /L,
1 mg /L) 、 IAA( 1 mg /L, 2 mg /L , 5 mg /L) 3因素 3水平正交试验设计。每处理接种 30～ 40瓶不等 ,接种后观
察并记录出现愈伤组织的时间 ,每隔 3 d,记录愈伤组织形成数。
1. 2. 4　愈伤组织的继代扩大培养及褐变的抑制
愈伤组织产生 20～ 30 d后 ,根据培养基的多少及干湿程度决定是否继代培养。在培养基已经消耗大部分 ,
或表面看起来比较干燥甚至开裂时 ,应准备转接 ,进行继代培养。若其生长良好 ,对继代用培养基作适当的小幅
度调整 ,否则继代用培养基应及时大幅调整。
选择疏松的愈伤组织在无菌台上进行切割 ,大块愈伤组织继续在固体培养基上培养 ,而小颗粒的愈伤组织
投入摇瓶进行液体培养 ,观察由各部分诱导出的愈伤组织的生长情况 ,每隔 3 d记录褐化数、愈伤组织颜色、生
长状况 ,比较在各种激素水平下的培养状况 ,注意影响单细胞培养的因子。
在继代培养基中分别加入活性炭 ( 2 000 mg /L, 10 000 mg /L )、 PV P(聚乙烯吡咯烷酮 ) ( 1 000 mg /L, 2 000
mg / L, 5 000 mg /L)、VC ( 1. 0 mg /L, 5. 0 mg /L, 10. 0 mg /L)、 AgNO3 ( 5 mg /L, 10 mg /L, 15 mg /L) ,对各组褐
化情况进行观察 ,并作详细记录 ,确定最佳抗褐变抑制剂及浓度。
2　结果分析
2. 1　成熟种胚离体培养结果
从人心果成熟种胚离体培养试验结果可知 (表 1) ,人心果成熟种胚离体培养无菌苗的最佳培养基是 M S,
最佳激素配比是 NAA 0. 2 mg /L+ BA 5. 0 mg /L。 此时的出苗率最高 ,达 100% ,且无菌苗生长快 ,芽体健壮、
颜色浓绿。当 NAA低于 0. 2 mg /L, BA高于 5. 0 mg /L以后 ,尽管出苗率也达到 100% ,但无菌苗生长慢 ,芽体
瘦弱 ,叶片呈黄绿色。在 MS培养基中如果不加任何激素 ,则基本不出苗。试验中还发现 ,成熟种胚在第一次离
体培养试验时 ,由于 3月份气温较低 ,组培室室温设在 23℃时 ,人心果无菌苗 25 d后才长成。人心果原产在热
带和亚热带 ,属于喜温果树 ,后通过提高培养温度到 22～ 28℃ ,无菌苗生长明显加快。
表 1　人心果成熟种胚离体培养无菌苗生长情况
激素 接种数量/个
出苗率及无菌苗生长情况
M S培养基 B5培养基
无 30 出苗率为 0 出苗率为 0
NAA 0. 2+ BA 5. 0 30 出苗率 100% ,生长快 ,芽体健壮 ,叶片翠绿 出苗率 60% ,生长慢 ,芽体较瘦小
NAA 0. 1+ BA 6. 0 30 出苗率为 100% ,生长慢 ,叶片呈黄绿色 出苗率 50% ,生长极慢
2. 2　不定芽的诱导
将无菌苗茎段接种到诱导培养基上 ,在接触培养基的部位长出少量浅黄色的愈伤组织 ,同时形成不定芽 ,
不同含量的激素对诱导不定芽的结果见表 2。由表 2可看出 ,在所有激素配比中 ,只有在 IAA处于低浓度或没
有 IAA时 ,无菌苗茎段诱导不定芽的诱导率才高 ,说明 IAA有抑制不定芽产生的作用 ,这可能是由于它本身
是一种内源激素 ,产生了拮抗作用。而 NAA以中浓度 0. 2 mg /L较适宜 , 2, 4-D以较高浓度 0. 5 mg /L较适宜。
6　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　经　　济　　林　　研　　究　　　　　 　　　　　　　　　　　第 22卷　
从整体激素配比看 ,诱导不定芽最佳的激素组合为 NAA 0. 2 mg /L+ 2, 4-D 5. 0 mg /L,不定芽诱导率达 90%。
在诱导不定芽的试验中 ,作者对不定芽诱导的温度、光照时间和强度几个参数作了对比 ,结果发现: 光照以 13
h /d和 2 000 lx为最佳 ,温度则以 30℃为宜。
表 2　不同激素含量对人心果茎段不定芽诱导的影响
实验号激素含量 /( mg· L
- 1 )
N AA 2, 4-D IAA
接种数
/个
产生不定芽的外植体数
/个
诱导率
/%
1 0. 1 1. 0 0 40 24 60. 0
2 0. 1 3. 0 0. 5 40 4 10. 0
3 0. 1 5. 0 1. 0 36 0 0. 0
4 0. 2 1. 0 0. 5 36 0 0. 0
5 0. 2 3. 0 1. 0 35 0 0. 0
6 0. 2 5. 0 0 40 36 90. 0
7 0. 5 1. 0 1. 0 30 0 0. 0
8 0. 5 3. 0 0 30 8 26. 7
9 0. 5 5. 0 0. 5 40 4 10. 0
2. 3　愈伤组织的诱导情况
用无菌苗叶片诱导愈伤组织的结果见表 3。结
果表明: 人心果愈伤组织诱导的最佳培养基是 MS
+ 6-BA 2. 5 mg /L+ 2, 4-D 1. 0 mg /L+ IAA 0. 5
mg /L。培养 10 d后开始有少量浅黄绿色半透明愈
伤组织覆盖于外植体上 ,培养 16 d后膨大成块状绿
色愈伤组织。
2. 4　继代培养及褐变情况
从表 3可知 ,第 6组愈伤组织生长情况良好 ,所
以在愈伤组织继代培养时 ,采用第 6组的最佳激素
配比。 在继代培养过程中 ,发现液体振荡培养优于固体培养 ,液体培养的愈伤组织更疏松 ,繁殖系数更大 ;且发
现光照对愈伤组织的生长有极大的促进作用 ,当光照 < 16 h /d时 ,光照时间越长 ,愈伤组织越松软 ,体积也越
大 ,但在光照和暗培养的比较试验中发现 ,在暗培养条件下 ,愈伤组织尽管生长慢 ,但褐化程度低 ,而光照培养
下褐化都较严重。 为了控制愈伤组织的褐化 ,分别在继代培养基中加入活性炭、 PV P、VC、 AgNO3 ,其结果见表
4,由表 4可知 , 2 000 mg /L的 PV P和 5 mg /L或 10 mg /L的 AgNO3具有良好的抑制愈伤组织褐变的作用。
VC也具有一定的抑制作用 ,而活性炭的效果最差。
表 3　不同激素组合对无菌苗叶片愈伤组织诱导的影响
实验号 激素含量 /( mg· L- 1 )
6-BA 2, 4-D IAA
接种数
/个 诱导数/个 诱导率/%
1 0. 5 0 0. 1 40 24 60
2 0. 5 0. 5 0. 2 40 4 10
3 0. 5 1. 0 0. 5 35 0 0
4 2. 5 0 0. 1 34 0 0
5 2. 5 0. 5 0. 2 30 0 0
6 2. 5 1. 0 0. 5 32 32 100
7 4. 0 0 0. 5 30 0 0
8 4. 0 0. 5 0. 2 30 6 20
9 4. 0 1. 0 0. 1 34 4 12
表 4　不同抗氧化剂控制愈伤组织褐变效果的比较
抗氧化剂
种类 含量
/( mg· L- 1 )
愈伤组织褐变等级 备注
V C 1. 0 3 0级: 外观鲜艳 ,
5. 0 2 淡黄色
10. 0 2 1级: 暗黄色 ,
PV P 1 000 2 轻度褐变
2 000 1 2级: 黄褐色 ,
5 000 2 褐变
AgNO3 5. 0 1 3级: 褐色 ,
10. 0 1 严重褐变
15. 0 2 4级: 黑色
活性炭 2 000 4
10 000 4
对照 3
3　结　论
人心果成熟种胚离体培养无菌苗的最佳培养基是 MS,最佳激素配比是 NAA 0. 2 mg /L+ BA 5. 0mg /L。此
时的出苗率最高 ,达 100% ,且无菌苗生长快 ,芽体健壮、颜色浓绿。无菌苗茎段诱导不定芽的最佳培养基为 NAA
0. 2 mg /L+ 2, 4-D 5. 0 mg /L,不定芽诱导率达 90% 。不定芽诱导的最佳环境条件是光照 13 h /d,光强2 000 lx ,
温度 30℃。 用无菌苗叶片诱导愈伤组织的最佳培养基为 M S+ 6-BA 2. 5 mg /L+ 2, 4-D 1. 0 mg /L+ IAA 0. 5
mg /L;在继代培养过程中 ,液体振荡培养优于固体培养 ,液体培养的愈伤组织更疏松 ,繁殖系数更大。光照对愈伤
组织的生长有极大的促进作用 ,即当光照 < 16 h /d时 ,光照时间越长 ,愈伤组织越松软 ,体积也越大。 继代培养过
程中在培养基中添加 2 000 mg /L的 PV P和 5 mg /L或 10 mg /L的 AgNO3 ,可防止愈伤组织褐化。
[参　考　文　献 ]
[1 ]　郑万均 .中国树木志 (第 2卷 ) [M ].北京:中国林业出版社 , 1985.
[2 ]　陈振光 .果树组织培养 [M ].上海:上海科技出版社 , 1987.
[3 ]　蔡建秀 ,肖华山 .植物组织细胞培养的研究进展 [ J].泉州师专学报 , 1999, 17( 6) .
[4 ]　陈菁瑛 ,陈熹 ,陈景跃 .植物组织培养研究与应用中若干问题与对策 [ J] .福建果树 , 1998( 2): 37- 382.
[5 ]　 Jams F H, Richa rd H Z. Tissue culture of t empra te and nut trees [ J]. Ho rticulture Reviews, 1987( 9): 273- 350.
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