全 文 ：武汉植物学研究 2001, 19 (5) : 363～ 368
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
小麦不同生理状态的幼穗和幼胚盾片与
诱导分化能力关系的研究Ξ
何勇刚　 林　刚　 刘曼西　 何光源
(华中科技大学生命科学与技术学院中英HU ST 2IA CR 作物基因工程和基因组学联合实验室, 武汉　430074)
摘　要: 用植物组织培养的方法, 研究了冬小麦品种鄂恩 1 号和品系鄂 55072 不同生理状态
的幼穗和幼胚盾片与诱导分化的关系。结果表明, 长度在 014～ 210 cm 间的幼穗和直径在
014～ 115 mm 间的盾片随生理状态不同, 其诱导和分化频率有明显的差异, 幼嫩的材料再生
频率较高。经 SA S 统计分析, 发现 015～ 110 cm 长的幼穗和直径为 014～ 111 mm 的盾片是处
于诱导分化的最佳生理时期的实验材料, 平均每个胚性愈伤组织的植株再生分别达到 3117
和 5163 株。通过比较幼穗和幼胚盾片的植物组织培养结果, 发现幼胚盾片比幼穗愈伤组织出
现早, 生长快, 植株再生绿苗率高, 这表明小麦幼胚盾片是较好的植物组织培养的材料。
关键词: 小麦; 幼穗; 幼胚盾片; 生理状态; 组织培养
中图分类号: Q 943. 1　文献标识码: A 　文章编号: 10002470X (2001) 0520363206
The Study of Rela tion between D ifferen tia tion Abil ity and
D ifferen t Physiolog ica l Sta tes of Inf loresence and
Scutellum from Bread W heat (T r iticum aes tivum L. )
H E Yong2Gang, L IN Gang, L IU M an2X i, H E Guang2Yuan
(Ch ina2U K H U S T 2IA CR C rop Genetic eng ineering and Genom ics J oin t
L abora tory , HU ST
ΞΞ
, W uhan　430074, Ch ina
IA CRΞΞΞ , U K )
Abstract: In o rder to choo se the su itab le target sou rce and developm en ta l stage
of w heat exp lan ts fo r estab lishm en t of h igh frequency of p lan t regenera t ion
system , inflo rescence and scu tellum exp lan ts w ere cu ltu red in v itro condit ion s
to study the effects of the exp lan ts physio logica l sta te on the frequencies of cal2
lu s induct ion and p lan t regenera t ion. T h ree size classes of inflo rescence (113～
210 cm , 018～ 112 cm , 014～ 017 cm in length) and imm atu re em b ryo scu tellumΞΞΞΞΞΞ Institu te of A rab le C rop s Research, U K.H uazhong U niversity of Science and T echno logy.收稿日期: 2001201204, 修回日期: 2001206201。基金项目: 国家“九五”攻关项目资助 (编号: 962002202224)。　作者简介: 何勇刚 (1975- ) , 男, 硕士生, 主要从事植物基因工程研究。
(112～ 115 mm , 018～ 111 mm , 014～ 017 mm in diam eter) w ere u sed in th is
study from tw o w in ter w heat geno types En1 and E55072. A cco rd ing to sta t ist i2
cal analysis, the resu lts ind ica ted that the exp lan ts show ed sign if ican t ly differ2
ences in term s of callu s induct ion and p lan t regenera t ion in in v itro cu ltu re from
exp lan ts w ith differen t size classes. Fo r inflo rescence, exp lan ts w ith 015～
110 cm in length give bet ter respon se, from w h ich per em b ryogen ic callu s p ro2
duced 3117 p lan t lets. Fo r scu tellum , exp lan ts w ith 014～ 111 mm in diam eter
gave bet ter respon se, from w h ich per em b ryogen ic callu s genera ted 5163
p lan t lets.
Key words: T riticum aestivum L. ; Inflo rescence; Scu tellum ; Physio logica l
sta tue of exp lan ts; In v itro cu ltu re
世界各国的科学家越来越重视通过现代生物技术手段, 特别是基因工程方法, 改良有
重要价值的农作物品质的研究工作。小麦是人类粮食和动物饲料的重要来源, 综合世界粮
农组织 (FAO ) 的统计报告[1 ] , 1999 年世界种植面积达 2114×108 (hm 2) , 1997～ 1999 三年
世界平均总产量 5188×108 t, 是世界种植面积最大, 产量最高的粮食作物。但是小麦的品
质改良工作却落后于水稻和玉米等重要粮食作物, 应用基因工程改良小麦品质取得突破
性进展是近五年的事情。这主要是由于小麦基因组复杂, 为基因转化、遗传操作和基因表
达研究带来了很大困难。另一个制约因素是小麦的植株再生频率较低, 从而导致它的遗传
转化频率较低。自 1992 年V asil 首次获得转抗除草剂基因的小麦植株以来[2 ] , 转化成功
的报告越来越多, 这方面的研究在最近 7、8 年最为活跃, 各国科学家在转化方法、转化材
料、外源基因和培养条件等许多方面做了大量的研究工作[3 9 ]。众多研究方法都要经历小
麦的组织培养过程, 因此高频率的植株再生系统是小麦转化成功的重要基础和保证[10 ]。
本实验通过比较不同来源和不同生理状态的小麦外植体诱导和分化, 以期确定小麦
最佳的组织培养材料和它的生理状态, 寻求最佳形态发生途径, 为小麦新品种选育奠定基
础。
1　材料和方法
1. 1　植物材料
冬小麦品种鄂恩 1 号 (En 1)和品系鄂 55072 (E55072)由湖北省农业科学院粮食作物
研究所提供, 在自然环境下秋播于露天试验地中, 进行常规田间管理, 越冬。第 2 年春天小
麦拔节前取幼穗, 开花 14～ 17 d 后取幼胚。
1. 2　材料处理
幼穗: 剥去幼穗外层包被的叶鞘, 截取最后一节 6～ 7 cm , 端口封 parafilm , 用 011%
的H gC l2 消毒 4～ 7 m in, 无菌水洗 3～ 5 次, 在无菌条件下将幼穗剥离出来, 按照长短将
其分为 3 组: 长 ( IFL ) 113～ 210 cm ; 中 ( IFM ) 018～ 112 cm ; 短 ( IFS) 014～ 017 cm。分别切成
长度约为 1 mm 的小段。
幼胚: 将种子剥出, 70% 乙醇消毒 30 s, 无菌水洗涤一次, 再用 011% 的 H gC l2 消毒
5 m in, 无菌水洗 3～ 5 次, 无菌条件下将幼胚剥除, 取出完整的盾片, 按照盾片的直径将其
463 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 19 卷　
分为 3 组: 大 ( IEL ) 112～ 115 mm ; 中 ( IEM ) 018～ 111 mm ; 小 ( IES) 014～ 017 mm。
1. 3　培养基
诱导培养基过滤灭菌后在超净台上和经过高压湿热灭菌后的琼脂充分混匀, 倒入培
养皿。分化培养基分装在三角瓶中, 通过高压湿热灭菌。培养基分为 3 种: ①幼穗诱导培
养基L 7+ P iclo ram 2～ 4 m göL ; ②幼胚诱导培养基M S+ P iclo ram 2～ 4 m göL ; ③分化培
养基R + KT 3 m göL + 2, 42D 011 m göL。
1. 4　培养条件
每个培养皿 (Ф9 cm ) 接种 20 个左右的幼穗切段或幼胚盾片, 在 (25±2)℃下暗培养
25～ 35 d, 转入三角瓶 (250 mL ) 中, 每瓶转入 10 个左右的愈伤组织, (25±2)℃, 光周期
12 h光ö12 h 暗下培养 30 d。
1. 5　结果观察
幼穗诱导 35 d, 幼胚诱导 25 d 后统计愈伤组织数, 计算愈伤组织诱导率。转分化培养
基 30 d 后统计生根愈伤组织数、出芽愈伤组织数以及得到的再生植株数。
2　结果与分析
2. 1　幼穗愈伤组织诱导与植株再生
幼穗接种 5 d 后, 外植体绿色消退, 变为苍白色。大段 ( IFL )穗轴伸长明显, 小穗长大,
芒继续长长; 中段 ( IFM )膨大, 伸长, 有愈伤组织出现; En 1 的小段 ( IFS)变化不明显。10 d
后愈伤组织出现较多。15 d 后 IFM 和 IFS 可见较多颗粒状愈伤组织, 周缘色浅, 有光泽, 而
IFL 的愈伤组织色浅, 皱折, 有些芒尖可见愈伤组织出现。随后愈伤组织继续长大, 颗粒状
明显, 颜色加深成乳黄色, 有些颗粒状分散开。至 35 d 转分化时, 幼穗愈伤组织的诱导率
平均达到 94% , 最低为 IFS2En 1 (7713% ) , 显著低于其它。IFM 和 IFS 的愈伤组织的直径一
般在 015～ 017 cm 之间, 已经看不到外植体, 而 IFL 主要是穗轴膨大, 愈伤组织的直径在
015 cm 左右。
表 1　小麦幼穗 ( IF)在离体条件下愈伤组织诱导与器官分化
T able 1　R esu lts of induction and regenerat ion of w heat
inflo rescence from in v itro cu ltu re
材 料
M aterial
接种数
N o. of
exp lan ts
used
愈伤组织数
N o. of calli
induced
生根愈伤
组织数
N o. of calli
w ith roo ts
出芽愈伤
组织数
N o. of calli
w ith shoo ts
再生植株数
N o. of
p lan tlets
regenerated
IFS2En 1 75 58 55 24 76
IFM 2En 1 100 96 94 28 58
IFL 2En 1 100 92 87 10 13
IFS2E55072 100 98 96 39 111
IFM 2E55072 120 120 108 13 18
IFL 2E55072 104 104 102 10 18转分化 1 d 后就有绿点出现, 5 d 后可明显看见芽点, 根状结构和花结构 (丝状雌蕊)。随后绿点增多,观察到叶和根的分化, 一般在一个愈伤组织上, 特别是由 IFS 和 IFM 诱导的愈伤组织上有几株苗同时出现。根的分化很明显, 平
均 90% 以上的愈伤组织分
化出根。结果见表 1。
2. 2　幼胚盾片愈伤组织诱导与植株再生
接种 3 d 后, 少数盾片在周围出现愈伤组织, 5 d 后除个别小盾片 ( IES) 外基本都能诱
导出愈伤组织, 外观颜色淡黄, 内容物少, 与幼穗比较愈伤组织出现早, 生长快, 但颜色浅。
563　第 5 期　　　　　　何勇刚等: 小麦不同生理状态的幼穗和幼胚盾片与诱导分化能力关系的研究
随后愈伤组织颜色加深, 继续长大, 在 15 d 时用 10 倍放大镜可观察到芽点出现。25 d 后
转分化时, 愈伤组织诱导率除 IES 是 85% 以外, 其余都达到 100%。愈伤组织一般呈比较
规则的圆形, 直径 015 cm 左右, 除 IEL 有少数盾片裸露外, 外植体都被愈伤组织包被。转
分化后已有的芽点迅速变绿, 长大成植株, 1 周内绿芽点的出现达到高峰, 由绿芽点分化
成芽。E55072 较 En 1 出芽早, 出芽多。实验中观察到了白化苗, 有的整个愈伤组织都形成
白化苗, 也有一个愈伤组织同时分化出白化苗和绿苗。根的分化情况和幼穗相比差别较
大, 从 53% 到 100% 不等, 平均为 8017%。结果见表 2。
表 2　小麦幼胚盾片 ( IE)在离体条件下愈伤组织诱导与器官分化
T able 2　R esu lts of induction and regenerat ion of w heat
imm ature em bryo scu tellum from in v itro cu ltu re
材 料
M aterial
接种数
N o. of
exp lan ts
used
愈伤组织数
N o. of calli
induced
生根愈伤
组织数
N o. of calli
w ith roo ts
出芽愈伤
组织数
N o. of calli
w ith shoo ts
再生植株数
N o. of
p lan tlets
regenerated
IES2En 1 80 69 58 8 36
IEM 2En 1 120 120 117 9 40
IEL 2En 1 100 100 76 5 20
IES2E55072 80 68 68 21 70
IEM 2E55072 120 120 112 27 152
IEL 2E55072 100 100 53 17 792. 3　结果统计分析实验结果表明, 幼嫩材料愈伤组织的诱导频率较低, 但是其胚性愈伤组织诱导率却较高, 植株再生数也相对较高。从愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织频率两方面考虑, 小麦幼穗和小麦幼胚盾片的最
佳诱导分化生理时期分别
是穗长在 015～ 110 cm 之间和盾片直径在 014～ 111 mm 之间的时候。对实验结果应用
SA S 进行D uncan 新复极差检验法 (D uncan’s M u lt ip le R ange T est)分析, 结果见表 3。
表 3　小麦幼穗和幼胚盾片的诱导分化结果统计分析
T able 3　Statist ical analysis of frequencies of induction and regenerat ion from
w heat inflo rescence and scu tellum
品 种
Geno type
愈伤组织诱导率 (% )
Percen tage of
calli induction
IFS IFM IFL
IES IEM IEL
胚性愈伤组织率 (% )
Percen tage of
Em bryogen ic callus
IFS IFM IFL
IES IEM IEL
再生植株ö胚性愈伤组织
P lan tlets regenerated per
em bryogen ic callus
IFS IFM IFL
IES IEM IEL
En 1
77. 30b 96. 00a 92. 00a
86. 25b 100a 100a
32. 00a 28. 00a 10. 00b
10. 00a 7. 50a 5. 00a
3. 17a 2. 07b 1. 30c
4. 50a 4. 44a 4. 00a
E55072 98. 00
b 100a 100a
85. 00b 100a 100a
39. 00a 10. 83b 9. 62b
26. 25a 22. 50ab 17. 00b
2. 86a 1. 39b 1. 80b
3. 33b 5. 63a 4. 65ab
注: 同一行中相同上标表示没有显著差异。D uncan 新复极差检验法, Α= 0. 05。
N o tes: M eans in a line w ith the sam e letter are no t sign ifican tly differen t. D uncan’sM ultip le Range
T est Α= 0105 p robab ility level.
3　讨论
小麦组织培养的体细胞外植体来源一般有幼穗、幼胚和成熟胚等。虽然有几种普通小
麦的幼穗培养能得到较好的再生频率[11 ] , 硬粒小麦的幼穗和幼胚盾片培养也可得到较高
频率的胚性愈伤组织和植株再生[12 ] , 用小麦成熟胚培养也有获得较高再生频率的报
道[13 ]。但是迄今为止, 在小麦的基因工程品质改良中, 大多数工作是用幼胚作为目标材
料, 资料证明小麦幼胚是对组织培养反应最好的材料[12 ]。我们的实验结果显示, 小麦品种
En 1 和品系 E55072 的幼胚是比较好的组织培养起始材料, 它们的植株再生频率高, 诱导
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分化稳定, 同样数量的外植体可得到更多的再生植株。这说明小麦幼胚在组织培养和基因
工程研究中, 都有很大的潜力。
本实验在小麦幼胚盾片的组织培养中观察到了白化苗的分化, 这是很少见的现象。一
般说来, 植物的花药培养容易产生白化苗[14 ] , 在幼胚盾片培养中极少见, 有文献[15 ]报道在
107 例中仅见 2 例, 这是否与基因型和培养条件有关, 有待进一步研究。
组织培养中, 外植体的生理状态和发育程度也是不可忽略的影响因素。本实验按幼穗
和幼胚的长度和大小, 将幼穗和幼胚分为 3 个不同的生理发育阶段。实验发现幼嫩的材料
再生频率较高, 这说明分生组织在早期发生的内在变化通过细胞分裂传递下去, 造成生理
状态处于晚期的细胞脱分化比早期细胞更难, 因而更难诱导出胚性愈伤组织。同时我们发
现, 过于幼嫩的实验材料其诱导率显著下降, 因此, 外植体的生理状态有一个最低限度。
另外, 由于外植体的来源不同, 它们的内源激素水平就不同, 需要通过调节外源激素
和改善培养条件来解决这个问题, 小麦幼穗诱导培养使用的激素水平比幼胚高, 其诱导培
养时间比幼胚长就是这个原因。即使如此, 在实验中, 我们还是观察到小麦幼胚盾片比幼
穗平均早 5～ 10 d 诱导出愈伤组织, 在排除因胚芽未除尽而发芽的情况后, 我们在幼胚诱
导的第 15 d 时用 10 倍放大镜看到淡黄色芽点, 而幼穗在整个诱导阶段未见芽点出现。
实验发现, 小麦组织培养时愈伤组织的诱导率很高 (平均可达 95% ) , 幼穗和幼胚没
有显著差别, IEM 和 IEL 诱导率都达到 100% , IFS和 IES 的诱导率显著降低, 可能和材料过
于幼嫩, 细胞内容物太少有关, 另外操作时创伤面积大也是一个可能的原因。文献[ 13 ]表
明小麦的组织培养中, 愈伤组织的诱导、分化和植株的再生是相互独立的, 因此诱导率高
并不表明分化再生频率高, 基因型是影响小麦组织培养的重要因素。本实验结果表明, 小
麦基因型对组织培养有较大的影响。有文献报道, 用通过组织培养获得的再生苗的种子进
行组织培养, 植株再生频率要比对照高 315 倍[16 ]。这是否暗示再生频率是由基因控制, 可
以通过筛选得到积累, 这有待进一步的实验证实。
参考文献:
[ 1 ]　联合国粮农组织数据库. 世界重要国家种植业产品的产量和种植面积 (1999). 世界农业, 2000 (2) : 63 64.
[ 2 ]　V asil V , Castillo A M , F romm M E, et a l. H erb icide resistan t fert ile transgen ic w heat p lan ts ob tained by m icro2
p ro jectile bom bardm ent of regenerab le em bryogen ic callus. B ioöT ech , 1992, 10: 667 674.
[ 3 ]　W eek s J T , A nderson O D , B lech l A E. Rap id p roduction of m ultip le independen t lines of fert ile transgen ic
w heat (T riticum aestivum L ). P lan t P hy sil, 1993, 102: 1 077 1 084.
[ 4 ]　Becker D , B rettschneider R , L o rz H. Fertile transgen ic w heat from m icrop ro jectile bom bardm ent of scu tellar t is2
sue. P lan t J , 1994, 5: 299 307.
[ 5 ]　N eh ra N S, Ch ibbar R N , L eung N , et a l. Self2fert ile transgen ic w heat p lan ts regenerated from iso lated scu tellar
t issues fo llow ing m icrop ro jectile bom bardm ent w ith two distinct gene constructs. P lan t J , 1994 (5) : 285 297.
[ 6 ]　Serik O , A inur I,M urat K, et a l. Silicon carb ide fiber2m ediated DNA delivery in to cells of w heat (T riticum aes2
tivum L. ) m atu re em bryo s. P lan t Cell R ep , 1996, 16 (3～ 4) : 133 136.
[ 7 ]　Cheng M , F ry J E, Pang S Z, et a l. Genetic transfo rm ation of w heat m ediated by A g robacterium tum ef aciens.
P lan t P hy sil, 1997, 115: 971 980.
[ 8 ]　H e G Y, L azzeri P A. A nalysis and op tim isation of DNA delivery in to w heat scu tellum and T rito rdeum inflo res2
cence exp lan ts by tissue electropo ration. P lan t Cell R ep , 1998, 18 (1～ 2) : 64 70.
[ 9 ]　So rok in A P, Ke X Y, Chen D F, et a l P roduction of fert ile transgen ic w heat p lan ts via tissue electropo ration.
763　第 5 期　　　　　　何勇刚等: 小麦不同生理状态的幼穗和幼胚盾片与诱导分化能力关系的研究
P lan t S ci, 2000, 156: 227 233.
[ 10 ]　V iertel K, H ess D. Shoo t tip s of w heat as an alternative source fo r regenerab le em bryogen ic callus cu ltu res.
P lan t Cell T iss O rg an Cu ltu re, 1996, 44: 183 188.
[ 11 ]　Rasco2Gaunt S, R iley A , Barcelo P, et a l. A nalysis of particle bom bardm ent param eters to op tim ise DNA deli2
very in to w heat tissues. P lan t Cell R ep , 1999, 19 (2) : 118 127.
[ 12 ]　H e G Y, Rooke L , CannellM , et a l. Curren t status of transfo rm ation in bread and durum w heats and modifica2
t ions of glu ten quality. A cta A g ron H ung , 1998, 46: 449 462.
[ 13 ]　O zgen M , T uret M , A ltinok S, et a l. Efficien t callus induction and p lan t regeneration from m ature em bryo cu l2
tu re of w in ter w heat (T riticum aestivum L. ) geno types. P lan t Cell R ep , 1998, 18 (3～ 4) : 331 335.
[ 14 ]　 Ingram H M , Pow er J B. L ow e K C, et a l. M icro spo re2derived em bryo induction from cultu red an thers of w heat.
P lan t Cell T iss O rg an Cu ltu re, 2000, 60: 235 238.
[ 15 ]　M ach ii H ,M izuno H , H irabayash i T , et a l. Screen ing w heat geno types fo r h igh callus induction and regeneration
capab ility from an ther and imm ature em bryo cu ltu res. P lan t Cell T iss O rg an Cu ltu re, 1998, 53 (1) : 67 74.
[ 16 ]　H arvey A ,M o isam L , L indup S, et a l. W heat regenerated from scu tellum callus as a source of m aterial fo r trans2
fo rm ation. P lan t Cell T iss O rg an Cu ltu re, 1999, 57: 153 156.
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