全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(2): 231−239 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31171590)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 郭旺珍, E-mail: moelab@njau.edu.cn
Received(收稿日期): 2013-06-17; Accepted(接受日期): 2013-09-24; Published online(网络出版日期): 2013-12-05.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20131205.1101.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00231
棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立
李妮娜 丁林云 张志远 郭旺珍*
南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 / 教育部杂交棉创制工程研究中心, 江苏南京 210095
摘 要: 以棉花幼嫩子叶为材料, 分析影响棉花叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素, 以棉花叶肉原生质
体为受体, 建立了稳定、高效的目标基因瞬时表达与鉴定体系。技术体系包括, 选择自然生长 12 d 的棉花幼嫩子叶
为材料, 混合 1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、0.5 mol L–1甘露醇、20 mmol L–1 KCl、20 mmol L–1 MES、0.1 mol L–1 CaCl2
和 1.0 g L–1 BSA, 在 28℃黑暗条件下振荡酶解 8 h, 可游离出浓度达 1.0×106 mL–1以上的纯净棉花叶肉原生质体。利
用该方法将棉花锌指蛋白基因 GhZFP2 整合到 pJIT166-GFP 质粒载体, 构建了 GhZFP2:GFP 融合载体, 采用 40%
PEG-4000介导转化, 获得高转化率的棉花叶肉原生质体。对目标基因瞬时表达产物检测表明, GhZFP2蛋白清晰定位
在细胞核上。
关键词: 棉花; 原生质体; PEG介导; 转化; 目标基因; 瞬时表达
Isolation of Mesophyll Protoplast and Establishment of Gene Transient Ex-
pression System in Cotton
LI Ni-Na, DING Lin-Yun, ZHANG Zhi-Yuan, and GUO Wang-Zhen*
State Key Laboratory of Crop Genetics & Germplasm Enhancement / Hybrid Cotton Research & Development Engineering Research Center, Minis-
try of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: This paper aimed to set up a stable and efficient transient expression system based on cotton mesophyll protoplasts
produced from cotyledon. We analyzed the key factors related to isolating effectively cotton mesophyll protoplasts and used it as a
vehicle to express transfected genes for functional studies. The optimized techniques are as follows: (1) the healthy 12-day-old
cotyledon grown naturally was selected to isolate cotton protoplasts; (2) the digestion system contained 1.5% cellulose, 0.4%
macerozyme, 0.5 mol L–1 mannitol, 20 mmol L–1 KCl, 20 mmol L–1 MES, 0.1 mol L–1 CaCl2, and 1.0 g L–1 BSA; and (3) the di-
gestion was conducted in the dark under 28 for 8 h with gentle shaking. The protoplast yield was higher than 1.0 × 10℃ 6 mL–1.
Using this system, we integrated a cotton zinc finger protein gene (GhZFP2) into pJIT166-GFP plasmid vector and constructed
the GhZFP2:GFP fusion vector. The target gene was then transformed into purified cotton mesophyll protoplast mediated with
40% PEG-4000. As a result, cotton mesophyll protoplast with high transformation frequency was obtained. The transient expres-
sion assay showed that the GhZFP2 protein was clearly located in the cell nucleus of cotton.
Keywords: Cotton; Protoplast; PEG-mediated; Transformation; Target genes; Transient expression
基因瞬时表达系统具有检测快速、通量高等特
点, 结合报告基因的使用, 该技术已被广泛用于目
标基因表达、蛋白亚细胞定位、启动子及蛋白活性
检测、蛋白与蛋白互作等基因功能分析研究[1-2]。为
了使基因的表达产物正确折叠、修饰并精确定位在
相应的亚细胞结构上, 受体细胞的选择非常关键[3]。
烟草 BY-2 (Bright Yellow-2)细胞, 洋葱表皮细胞均
被作为受体材料, 成功用于功能基因的瞬时表达分
析[4-5]。特别是洋葱表皮细胞, 由于其细胞大、无色
素, 容易观察与转化, 通过农杆菌介导法转化该类
细胞, 已明确多个目标基因的亚细胞定位信息[6]。然
而, 由于洋葱表皮细胞没有叶绿体, 会使在叶绿体
中表达的基因错误表达在细胞的其他位置, 造成研
究结果的假阳性。相比于上述受体细胞, 利用原生
232 作 物 学 报 第 40卷


质体进行瞬时表达分析可大大增加研究的准确性。
目前, 已在拟南芥[7]、烟草[8]、小麦[9]、水稻[10-11]等
作物中建立基于原生质体瞬时表达遗传转化体系 ,
并广泛用于目标基因表达分析。
棉花是世界性重要的经济作物。随着棉花基因
组序列信息释放, 大量棉花重要基因的功能特征需
进一步鉴定。最近, 二倍体雷蒙德氏棉种基因组序
列已分布 [12-13], 利用这些序列信息, 建立基于棉花
原生质体的基因瞬时表达体系, 将加速棉花功能基
因组学研究进程, 快速获得目标性状的候选功能基
因。然而, 到目前为止, 关于利用棉花原生质体遗传
转化开展目的基因功能验证的报道还较少。本文运
用酶解法游离与纯化棉花叶肉原生质体, 系统分析
影响分离与目标基因转化的因素, 建立了以棉花原
生质体为受体, PEG 介导的遗传转化体系和目标基
因瞬时表达检测技术, 为高通量开展棉花候选基因
的功能分析奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料 选取陆地棉遗传标准系(Goss-
ypium hirsutum L. acc. TM-1)饱满的种子播种于蛭石
与营养土质量比为 2 1∶ 的土壤中, 置光照培养箱自
然生长(28 , 12 h℃ 光培养/12 h暗培养) 2周左右, 选取
完全伸展子叶作为提取棉花原生质体的外植体材料。
1.1.2 质粒载体 含有绿色荧光蛋白基因的植物
表达载体 pJIT166-GFP (4700 bp), 表达框由花椰菜
花叶病毒(CaMV) 35S 启动子、绿色荧光蛋白(GFP)
基因、胭脂碱合成酶终止子(NOS)构成, 由南京农业
大学生命科学学院王心宇博士构建并惠赠, 本实验
室繁殖保存。在大肠杆菌 DH5α菌株中扩增质粒, 大
量提取纯化制备质粒 DNA, 以电泳鉴定。利用 One
Drop OD-1000+(NanoDrop Thermo, USA)测定质粒
DNA 的纯度和浓度, OD260/OD280=1.6~1.8, DNA 浓
度为 1 µg µL–1, –20℃保存备用。
1.1.3 试验试剂 纤维素酶 Cellulase Onzuka
R10 (Yakult, Japan)、离析酶 Mecerozyme Onozuka
R10 (Yakult, Japan)、甘露醇(Sigma)、MES (Sigma);
PEG-4000 等主要国产生化试剂均购于南京奥斌生
物科技有限公司。
1.2 外植体的制备
分别选取自然生长 8、10、12和 14 d的棉花幼
苗子叶, 进行高质量原生质体最佳外植体生长周期
筛选。每个试验设置 3 个重复, 分别统计原生质体
的数量与活性。
1.3 棉花原生质体游离与纯化
配制含有 1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、0.5 mol
L–1甘露醇、20 mmol L–1 KCl、20 mmol L–1 MES、
0.1 mol L–1 CaCl2、1.0 g L–1 BSA的混合酶液 10 mL,
经 0.45 μm 纤维素微孔滤膜过滤待用。选取生长健
壮的棉花子叶, 平展于培养皿中, 用单面保险刀切
割叶片, 令其宽度为 0.5~1.0 mm 左右。将约 1.0 g
叶片细丝与酶液充分混合, 28℃避光, 20转 min–1轻
摇 5~10 h。使叶肉完全酶解, 叶片只剩表皮, 至酶解
混合液呈现绿色为止。
酶解终止后, 加入等体积的 W5 溶液(4 mmol
L–1 MES、154 mmol L–1 NaCl、125 mmol L–1 CaCl2、
5 mmol L–1 KCl, pH 5.7)轻柔冲洗酶解混合液, 用枪
头吸取混合液至孔径为 30 μm 的尼龙网过滤至
50 mL离心管中, 100×g离心 2 min。弃上清液, 加入
W5溶液 2 mL轻轻悬浮, 冰上放置 30 min沉淀原生
质体。
1.4 棉花叶肉原生质体的产量与活性检测
用 0.1 mm血球记数板统计棉花原生质体数, 用
0.02%荧光素双醋酸(FAD)测定原生质体活力。收集
2 mL 分离纯化后的原生质体悬浮液, 取 10 μL, 滴
在载玻片上, 加盖 18 mm × 18 mm的盖玻片, 在 10
倍物镜下镜检。原生质体数(mL–1) = 80小格内细胞
个数/(80×400×104×稀释倍数)。取浓度 0.02% FDA
溶液(FDA母液: 5 mg L–1 FDA丙酮) 1滴, 加 1滴原
生质体悬浮液慢慢混合均匀, 室温静止 5~10 min。
取混合液滴于载玻片上, 在荧光显微镜(Leica, DM
IRB, Germany)下检查 , 荧光激发光波长为 450~
490 nm, 发射波长 250 nm。此时, 活力高的原生质
体具有黄绿色荧光。用 Leica DFE300FX 采集图片,
统计每一视野中具有活性的原生质体数及总原生质
体数。共取 2~3滴, 观察视野 10~20个, 计算原生质
体存活率(%)。原生质体活力=发黄绿色荧光的原生
质体数/观察的原生质体总数×100%。
1.5 目标基因瞬时表达载体构建
pJIT166-GFP 质粒载体中含有绿色荧光蛋白 ,
在真核细胞中高水平表达。将本实验室克隆的 1 个
ORF全长为 1005 bp的棉花锌指蛋白基因GhZFP2 [14],
采用 Primer Premier 5.0软件(Premier, Canada)设计
两端带有 Xba I 和 BamH I 酶切接头的引物 (F:
5′-GCTCTAGAATGGCTTTAGAAGCTCTCAA-3′; R:
第 2期 李妮娜等: 棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立 233


5′-GCGGGATCCATTTGTTTCGTTGACTTG-3′), 将目
的基因片段转入 pJIT166-GFP中, 插入位置在 35S-P
(启动子)与 Nos-T (终止子)之间, 构建融合蛋白表达
载体 pJIT166-GhZFP2-GFP。
1.6 遗传转化
将沉淀后原生质体重悬浮于 MMG (0.4 mol L–1
甘露醇、15 mmol L–1 MgCl2、4 mmol L–1 MES, pH
5.7), 浓度稀释至 2.0×105 mL–1。将浓度为 1 μg μL–1
质粒 DNA 15 μL加入 2 mL离心管, 与 200 μL原生
质体-MMG 悬混液混合, 轻弹管底混匀, 室温放置
5~10 min。加入 40% PEG-4000 (0.2 mol L–1甘露醇、
100 mmol L–1 CaCl2, pH 8.0) 220 μL, 轻弹管底混匀,
室温放置 15 min。用 W5溶液 880 μL重新悬浮, 轻
弹管底混匀, 转化终止。100×g 离心 2 min, 弃上清
液。加入 WI (0.5 mol L–1甘露醇、4 mmol L–1 MES、
20 mmol L–1 KCl) 1 mL重悬浮, 并转移至经 BSA预
冲洗过的培养皿中, 24℃过夜培养。共转化原生质体,
以激光共聚焦显微镜(Leica, TCS SP2, Germany)观
察鉴定。
2 结果与分析
2.1 制备棉花叶肉原生质体体系的优化
借鉴拟南芥已建立的叶片原生质体分离及遗传
转化标准方法[15], 制备棉花叶肉原生质体, 获得活力
达 75%左右的原生质体。为了进一步提高棉花原生质
体的产量和质量, 针对棉花叶片特点, 对外植体培养
时间、渗透压大小、酶解时间等不同处理进行优化,
使原生质体数量达到 1.0×106 个 mL–1 以上, 活力由
75%提高到 90%以上, 而且大小一致, 状态良好。
2.1.1 叶龄对棉花原生质体分离的影响 在保持
渗透压和酶解时间一定的前提下, 选用不同叶龄的
棉花幼苗获得的原生质体得率存在显著差异。培养
8 d的棉花子叶, 产生极少量的原生质体, 且细胞比
较小; 当幼苗培养时间达到 10 d 时, 获得的原生质
体大小合适, 且产量显著增加。同时在合适的渗透
压下, 细胞碎片少, 获得有活性的细胞数逐步上升;
培养 12 d获得原生质体的数量和活性达到最高。随
着培养时间延长, 原生质体存活率开始下降(图 1)。
综合上述分析, 棉花自然培养 12 d的幼嫩子叶为最
佳外植体材料 , 能获得纯净、有活性原生质体量
1.0×106 mL–1以上。
2.1.2 渗透压对棉花原生质体分离的影响 渗透
压过高会造成原生质体胀裂, 降低产量。选取生长
状态相近, 培养 12 d的棉花子叶, 酶解 8 h, 调节不

图 1 不同叶龄下原生质体细胞的产量
Fig. 1 Protoplast yield when sampling cotyledon leaves in
different developmental stages
不同的大写字母表示样本之间存在极显著差异。
Different capital letters mean the significant difference at the 0.01
probability level among samples.

同甘露醇浓度梯度, 筛选制备原生质体的最佳渗透
压。结果表明, 随着甘露醇浓度增大到 0.4 mol L–1,
棉花原生质体的得率逐步增加(图 2-a); 甘露醇浓度
为 0.5 mol L–1时, 获得原生质体的数量较多, 且大
小基本一致(图 2-b); 当甘露醇浓度达到 0.6 mol L–1,
原生质体的活性开始下降, 原生质体量也逐渐减少
(图 2-c); 当甘露醇浓度达到 0.8 mol L–1, 仅获得极
少量棉花叶肉原生质体(图 2-d)。因此, 不同渗透压
处理下原生质体得率存在差异, 0.5 mol L–1甘露醇浓
度下获得的原生质体数量和活力均显著高于其在
0.4、0.6 mol L–1渗透压下的得率(图 3)。综上所述, 酶
解液中最适的甘露醇浓度为 0.5 mol L–1。
2.1.3 不同酶解时间对棉花原生质体分离的影响
叶龄一致的外植体, 在一定渗透压下, 不同的
酶解时间对原生质体的产量有明显影响。随着酶解
时间延长, 棉花叶片细丝切口处会分离出原生质体
(图 4-a), 酶解 5 h 后游离出原生质体数量已逐渐增

图 2 不同渗透压下对原生质体细胞的活性影响
Fig. 2 Protoplast activity under different mannitol
concentration
a: 0.4 mol L–1; b: 0.5 mol L–1; c: 0.6 mol L–1; d: 0.8 mol L–1.
234 作 物 学 报 第 40卷



图 3 不同渗透压下对原生质体细胞的产量影响
Fig. 3 Protoplast yield under different mannitol concentration
不同的大写字母表示样本之间存在极显著差异。
Different capital letters mean the significant difference at the 0.01
probability level among samples.

图 4 不同酶解时间对原生质体细胞的产量影响
Fig. 4 Protoplast yield with different enzymolysis time
a: 5 h; b: 6 h; c: 8 h; d: 9 h.

多(图 4-b)。酶解 8~9 h 时, 酶液的酶解效率达到最
高, 原生质体的数量达到 1.0×106 mL–1以上, 产量显
著高于酶解 5~6 h的结果(图 4-c)。酶解时间超过 9 h
后, 因最初游离出的原生质体会随着时间延长而破
裂 , 细胞碎片增多 , 原生质体的得率开始下降 (图
4-d)。随着酶解时间增加, 棉花叶片原生质体的活性
变化也呈现抛物线趋势。酶解初期受影响不大, 酶
解时间延长至 8 h 达到活力最高峰, 随后开始下降
至 50%以下(图 5)。综上所述, 棉花叶片最适酶解条
件为黑暗轻柔振荡培养 8 h。
2.2 分离高质量棉花叶肉原生质体细胞体系的
建立
综合分析影响棉花叶肉原生质体制备的主要因
素, 建立了分离棉花叶肉原生质体的优化体系。酶
液组合为 1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、0.5 mol L–1
甘露醇、20 mmol L–1 KCl、20 mmol L–1 MES、0.1 mol
L–1 CaCl2和 1.0 g L–1 BSA, 酶解 8 h。实验流程为: 自
然生长 12 d 的棉花健壮植株为一叶一心期(图 6-a),
取其幼嫩子叶作为外植体(图 6-b), 切割叶片到足够
纤细且均匀, 酶解约 1.0 g叶片量, 使棉花叶片细丝
充分接触酶解混合液(图 6-c)。酶液进入受体组织后
破碎细胞 , 充分消化叶肉组织释放原生质体 (图
6-d)。对棉花叶片原生质体进行沉淀和纯化, 消除分
离过程中产生的破裂细胞和未酶解碎片(图 6-e), 获


图 5 不同酶解时间对原生质体细胞的活性影响
Fig. 5 Protoplast activity at different enzymolysis time
不同的大写字母表示样本之间存在极显著差异。
Different capital letters mean the significant difference at the 0.01
probability level among samples.

图 6 棉花叶片原生质体的分离与纯化
Fig. 6 Isolation and purification of cotton mesophyll
protoplast
a: 自然生长 12 d的棉花植株; b: 棉花子叶; c: 酶解前物理处理
后的棉花叶片; d: 酶解结束后酶解混合液; e: 重悬浮原生质体;
f: 沉淀后原生质体(箭头所示); g: 物镜下的镜检原生质体(×10)。
a: Healthy 12-day-old cotton plant; b: Cotton cotyledon for proto-
plast isolation; c. Cotton leaves after physical cutting; d. Mixed
solution after enzymatic digestion; e: Resuspension of cotton pro-
toplast; f: Precipitation of cotton protoplast (marked with arrow);
g: The purified mesophyll protoplast (×10).
第 2期 李妮娜等: 棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立 235


得明显的原生质体分层带(图6-f)。基于上述流程, 获
得的棉花叶片原生质体大 , 碎片少 , 量多 , 活性强
(图6-g)。原生质体达1.0×106 mL–1以上, 其数量和活
性完全满足进一步遗传转化研究。
2.3 棉花原生质体的遗传转化
将制备好的棉花叶肉原生质体与 pJIT166-GFP
载体质粒 DNA, 在 24℃条件下共培养 12~16 h, 检
测棉花原生质体中绿色荧光蛋白的表达丰度。经激
光共聚焦显微镜扫描检测, 视野中遍布含绿色荧光
信号的原生质体细胞(图 7)。进一步与红色自发荧光
的叶绿体信号叠加, 原生质体显示叠加部分的黄色
荧光和未叠加部分的绿色荧光。说明带有 GFP荧光
蛋白的质粒DNA可高通量转入棉花原生质体, 并使
GFP荧光蛋白稳定表达。
进一步利用构建的转录因子 GhZFP2:GFP融合
载体 , 进行目标基因的原生质体表达研究。以
pJIT166-GFP 质粒载体为对照, 将含有目标基因和
报告基因的融合表达载体与空载体的质粒 DNA 分
别转入棉花原生质体细胞, 通过荧光检测观察到空
载体质粒 DNA转化棉花原生质体后, 其细胞核、细
胞质和细胞膜等部位均有明显荧光信号 , 而转化
GhZFP2:GFP 融合载体质粒 DNA 仅在原生质体细
胞核上具有明显的绿色荧光信号。利用棉花叶肉原
生质体进行目标基因亚细胞定位, 结果显示, 与空
载体对照相比, 转录因子 GhZFP2 编码产物被定位
于植物细胞的细胞核上行使功能(图 8)。

图 7 pJIT166-GFP载体转化棉花原生质
Fig. 7 Cotton protoplast transformed by using pJIT166-GFP vector
pJIT166-GFP: GFP荧光; Chlorophyll: 叶绿体自发荧光; Merge: 自发荧光与 GFP荧光叠加; Bright field: 明场下细胞状态。
pJIT166-GFP: transformed cells with GFP fluorescence; Chlorophyll: autofluorescence of chloroplast; Merge: overlapping between
autofluorescence and GFP fluorescence; Bright field: cotton protoplast cells in bright field.

图 8 35S:GFP与 35S:ZFP2:GFP质粒 DNA在棉花原生质体细胞瞬时表达
Fig. 8 Transient expression of plasmid DNAs of 35S:GFP and 35S:ZFP2:GFP in cotton protoplast
GFP: GFP荧光; Chlorophyll: 叶绿体自发荧光; Merge: 自发荧光与 GFP荧光叠加; Bright field: 明场下细胞状态; 35S:GFP:GFP空载体;
35S:ZFP2: GFP: 带有 ZFP2目的基因的质粒。
GFP: transformed cells with GFP fluorescence; Chlorophyll: autofluorescence of chloroplast; Merge: overlapping between autofluorescence and GFP
fluorescence; Bright field: cotton protoplast cells in bright field; 35S:GFP: GFP empty vector; 35S:ZFP2: GFP: plasmid with ZFP2 target gene.


3 讨论
3.1 高质量作物原生质体获得与应用
在植物细胞内瞬时表达目标基因可快速、高效
地分析其可能功能。它与基因重排、病毒诱导基因
沉默和 RNA干扰等新兴技术一起, 在植物功能基因
组研究中扮演非常重要的角色[3]。原生质体是植物
细胞脱去细胞壁的裸露细胞, 以原生质体为受体转
236 作 物 学 报 第 40卷


化目标基因并使之表达, 在阐明功能基因在细胞内
的定位和生物学机制等研究中发挥重要作用[16]。
原生质体的分离研究始于 20世纪 60至 70年代。
Cocking[17]以及 Nagata和 Takebe [18]分别报道用酶解
法从番茄根尖与烟草叶片中分离得到大量有活性、
稳定的原生质体。以拟南芥为代表的大多数植物都
建立了有效的原生质体瞬时表达体系, 可以多角度分
析细胞内外源基因的表达特征及可能行使的功能[19]。
通过与根癌农杆菌共培养, 周颖等[20]将 z108基因整
合到烟草原生质体的核基因组中, 建立了普通烟草
的瞬间表达转化体系。Yang等[21]建立了简单、高效
的水稻绿色组织原生质体瞬时表达体系, 并用于蛋
白免疫及蛋白互作研究。
棉花是重要的经济作物, 开展原生质体的分离
与应用研究较早。在原生质体培养、体细胞融合以
及植株再生等方面已取得较好研究进展[22-24]。前人
已将棉花原生质体从愈伤组织[25]、子叶[26]、悬浮细
胞[27]等组织中成功分离, 但分离棉花原生质体存在
植板率低、不同基因型对棉花原生质体的得率和活
性影响差异较大等问题[28]。利用棉花原生质体进行
目标基因瞬时表达, 开展功能研究的报道也较少。
基于烟草、拟南芥等原生质体瞬时表达系统进行棉
花基因功能研究 , 存在异源系统中蛋白表达异常 ,
假阳性定位等弊端。因此, 建立棉花原生质体培养
技术, 利用棉花原生质体研究其目标基因可能行使
功能, 将更科学和准确。在本研究中, 我们建立的棉
花高效原生质体分离与纯化技术体系, 既可用于棉
花功能基因的表达与亚细胞定位研究, 又能直观分
析目标启动子的活性, 蛋白与蛋白间的互作等。结
合 RNA干扰等技术, 将为棉花功能基因组学研究提
供更为广阔的前景。
3.2 高质量棉花原生质体的制备
获得植物高质量原生质体, 需要优化酶液组合
与酶解浓度、酶解时间和酶解渗透压等几个关键因
素 [29]。本文采用酶解法制备棉花叶肉的原生质体 ,
对上述因素进行优化分析, 获得了高质量棉花原生
质体。
自然生长的幼嫩外植体是游离原生质体的最佳
选择。植物叶片生理状态和生长周期对原生质体的
产量有一定影响。利用生长 3~4 周的拟南芥幼苗第
5~7 片真叶提取原生质体, 其产量和活性达到最佳
水平[15]。本试验利用棉花叶片作为外植体分离原生
质体, 选用生长 12 d 左右, 生长状态良好的棉花子
叶提取原生质体, 获得了 1.0×106 mL–1 以上的原生
质体数量, 能满足多次转化后续实验。
酶的种类和浓度的选择应根据植物材料来源和
生理状态而定, 应针对不同的外植体材料选择合适
酶液组合[30]。目前, 分离植物叶片原生质体, 最快、
效果最佳的是酶解法, 多采用纤维素酶和离析酶组
合。叶肉原生质体分离的最佳酶液组合对于水稻为
纤维素酶2.0%和离析酶0.7%; 对于玉米、小麦叶均
为纤维素酶1.5%和离析酶0.5% [9]; 对于烟草为1.0%
纤维素酶和0.5%离析酶, 配合0.5 mol L–1甘露醇渗
透压更可获得理想纯净的原生质体[31]。以拟南芥子
叶为外植体分离原生质体, 其酶液组合为1.5%纤维
素酶和0.4%离析酶[32]。棉花原生质体细胞分离已有
较多研究。李仁敬等[26]利用4.0%纤维素酶, 0.4%果
胶酶, 酶解6 h 分离出棉花子叶叶肉原生质体。Sun
等[33]利用3.0%纤维素酶, 0.5%半纤维素酶, 1.5%果
胶酶, 酶解20 h, 获得棉花高质量的原生质体, 其活
力达到90%。近年来, 棉花原生质体提取的方法进一
步得到改良。汪静儿等[28]运用纤维素酶3.0%、离析
酶1.0%, 酶解20~24 h 获得棉花悬浮细胞高质量原
生质体。付莉莉等[24]采用1.5%纤维素酶, 1.0%离析
酶和2.0%半纤维素酶组合, 酶解12~14 h, 成功分离
棉花悬浮细胞系原生质体 , 并实现体细胞融合培
养。最近, Gao 等[34]利用棉花子叶作外植体, 使用
1.5%纤维素酶和0.4%离析酶组合, 酶解3~12 h, 成
功分离棉花原生质体并进行了基因瞬时表达分析。
本研究采用1.5%纤维素酶和0.4%离析酶组合, 酶解
6~8 h, 进行棉花叶肉原生质体分离, 缩短了棉花叶
片的酶解时间, 获得高质量的棉花叶肉原生质体。
该流程可彻底去除细胞壁纤维素残留物, 降低酶液
产生的毒害作用对叶肉细胞原生质体的损伤, 加快
了实验进程。
在适当的渗透压下, 植物原生质体可保持完整
的形态。在建立模式作物拟南芥叶肉原生质体分离
体系时, 选择 0.4 mol L–1甘露醇为最适渗透压环境,
获得了高效的拟南芥原生质体, 并成功进行基因瞬
时表达研究[35]。拟南芥与棉花叶片相比较厚实, 叶
脉组织较多, 需要更高的渗透压维持细胞稳定性。
前人在对不同来源的棉花叶片进行原生质体分离时,
选用 0.6 mol L–1甘露醇, 获得的绝大部分原生质体
呈现饱满的鲜绿色[26]。我们的研究发现, 当甘露醇
浓度在 0.5 mol L–1时, 棉花原生质体不会吸水膨胀,
细胞碎片少。如果低于 0.5 mol L–1, 棉花原生质体会
第 2期 李妮娜等: 棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立 237


因部分失水变瘪。而过高的渗透压则导致细胞过分
吸水膨胀而破裂, 细胞碎片和亚原生质体增多, 直
接影响有效原生质体细胞的产量。
针对棉花叶片的生理特性, 调整其他可控因素
进一步获得棉花原生质体分离的优化体系。为了充
分酶解棉花叶肉细胞, 对酶解液进行 45℃水浴预处
理 10 min, 增加酶液活性, 充分破碎植物细胞壁且
缩短酶解时间, 减少细胞碎片的产生, 从而提高原
生质体的产量。棉花子叶的宽度和均一性亦是影响
酶解时间和效率的重要因素之一, 相比于模式植物
拟南芥 , 棉花叶片叶肉组织较多 , 叶片较厚 , 切取
子叶宽度足够纤细, 会缩短酶解时间, 减少细胞毒
害造成的细胞破碎和亚细胞数量, 有利于获得高产
量和大小均匀的原生质体。解离后的棉花原生质体
极易受渗透压变化的影响而导致质膜破裂, 影响转
化效率 , 因此在原生质体的制备过程中 , 添加
125 mol L–1 CaCl2酶解液, 可起到较好的稳定质膜、
减少破损的作用, 有利于原生质体的转化。
3.3 利用棉花原生质体高效表达目标基因
在目标基因瞬时表达研究中, 借助细胞融合剂
诱导原生质体摄取外源 DNA, 无种属特异性, 可诱
导不同来源原生质体的融合与转化。以 PEG介导的
原生质体转化法是一种成熟的植物细胞瞬间表达技
术, 已广泛应用[36-37]。Kirschner等[38]利用 PEG介导
的烟草叶肉细胞原生质体瞬间表达系统, 结合瞬间
表达产物的免疫印迹、免疫荧光技术和电镜技术 ,
研究了热胁迫诱导条件下两种类型的异源热激蛋白
多聚化、凝集形成热胁迫颗粒过程中相互作用及诱
导前后产物亚细胞定位的变化。黄瑾等[39]利用 PEG
介导外源基因转化甘蓝型油菜叶肉原生质体, 建立
了稳定高效的油菜瞬时表达系统。
在原生质体转化过程中, PEG浓度、质粒 DNA
浓度、原生质体数量是影响转化效率的关键因素。
在 PEG 处理过程中, 由于细胞质浓度不均匀或细胞
体积过小, 特别是新生细胞胞质脆弱, 容易使原生
质体破碎。因此在原生质体细胞 PEG 转化过程中,
受体原生质体的质量和活性, 以及细胞渗透压环境
的稳定性是转化成功的决定性因素。随着 PEG浓度
升高, 转化效率逐渐增加, 转化的细胞数增多。但是,
过高的 PEG 浓度会影响细胞稳定性, 对细胞产生一
定的毒害作用, 导致细胞碎片增多, 破碎的细胞量
增加。利用 PEG法转化原生质体时, PEG分子量与
来源非常重要[35], 不同作物原生质体转化所要求的
PEG浓度亦不同。研究表明, 拟南芥叶肉细胞 PEG-
4000介导的最适浓度为 20%[35]; 转化水稻栽培品种
的愈伤组织原生质体 , 其最适浓度为 40% PEG-
6000[40]; 转化烟草叶片原生质为 40% PEG-4000[8]。
本研究中 , 我们获得转化棉花叶肉原生质体 PEG-
4000介导的最适浓度为 40%。为了确保目的基因成
功转化原生质体, 质粒DNA浓度过高或过低都不能
有效瞬时表达目的蛋白。梁大伟等[35]建立拟南芥瞬
时表达体系, 将 20 μg 质粒 DNA 转化 2.0×104个拟
南芥原生质体, 获得最佳的转化效率。在本研究中,
将质粒 DNA浓度稀释至 15 µg, 棉花原生质体浓度
为 2.0×105 mL–1, 获得高转化率的原生质体, 成功转
化目的基因。
为了更好利用原生质体研究基因的相关功能特
征, 其他与原生质体转化效率有关的实验条件也需
综合考虑。当酶解植物细胞壁后, 随着培养时间的
增加, 原生质体 RNase 酶活性异常升高, 加入抗氧
化剂 BSA 可降低 RNase 酶活, 保持原生质体活力。
为了提高质粒DNA转化效率, 加入MES维持转化体
系的 pH值; 加入 CaCl2以稳定质膜、减少破损; 将转
化后的棉花原生质体转移至经 BSA 冲洗过的培养皿
中, 24℃过夜培养, 均对提高转化率起到促进作用。
4 结论
建立了棉花叶肉原生质体的分离与目标基因瞬
时表达鉴定体系。选择自然生长 12 d的棉花幼嫩子
叶为外植体, 在 1.5%纤维素酶和 0.4%离析酶液组合,
0.5 mol L–1渗透压下, 28℃黑暗振荡消化 8 h, 获得
大小均匀、产量达 1.0×106 mL–1、活力达 90%以上
的棉花原生质体。通过 40% PEG-4000 介导 15 µg
目的质粒 DNA 转化 2.0×105 mL–1 棉花原生质体,
24℃过夜培养 , 获得高转化率的原生质体 , 并将转
录因子 GhZFP2蛋白清晰定位在细胞核上。利用该
体系 , 可大规模开展棉花关键基因功能验证分析 ,
提高棉花目标性状关键基因发掘效率并有效用于
育种研究。
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