全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(1): 29−36 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30971770), 引进国际先进农业科学技术计划(948计划)项目(2011G-3)和美国唐仲英基金会资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 张晓科, E-mail: zhangxiaoke66@126.com
第一作者联系方式: E-mail: zf2606@163.com
Received(收稿日期): 2013-05-06; Accepted(接受日期): 2013-08-16; Published online(网络出版日期): 2013-10-22.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20131022.1730.015.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00029
一个普通小麦 Trx超家族新基因 TaNRX的克隆与抗旱相关标记开发
张 帆 蒋 雷 鞠丽萍 金秀锋 王 轩 张晓科* 王宏礼 付晓洁
西北农林科技大学农学院 / 国家小麦改良中心杨凌分中心, 陕西杨凌 712100
摘 要: 抗旱相关基因的挖掘和分子标记开发对选育抗旱小麦品种有重要意义。采用同源克隆、电子克隆、RACE
技术和生物信息学分析手段 , 获得了普通小麦硫氧还蛋白 (Trx)超家族一个新基因 (TaNRX)的全长 cDNA 序列
(GenBank登录号为 KC890769), 包含 2015 bp, 其中开放阅读框 1734 bp; 预测编码 577个氨基酸, 分子量为 63.79 kD,
含 3 个 Trx 活性功能区, 其中 2 个存在典型的 Cys-X1-X2-Cys 结构, 具有催化氧化还原反应的活性。TaNRX 基因被
定位在小麦的 5B染色体短臂上, 包含 4个外显子和 3个内含子。比较该基因在两组极端相对发芽率品种中的序列差
异, 发现第 1个内含子差异明显。基于差异位点开发了 4个显性互补标记, 并用其检测 150份小麦品种(系)。检测到
TaNRX基因在普通小麦中至少存在 2种与抗旱相关的等位变异, 分别是 TaNRX-a和 TaNRX-b; TaNRX-a基因型的品种
(系)平均相对发芽率显著高于 TaNRX-b基因型(P<0.01), 说明开发的标记可被用于小麦抗旱性鉴定筛选。
关键词: 普通小麦; 抗旱性; TaNRX; 分子标记
Cloning a Novel Gene TaNRX of Trx Superfamily and Developing Its Molecular
Markers Related to Drought Resistance in Common Wheat
ZHANG Fan, JIANG Lei, JU Li-Ping, JIN Xiu-Feng, WANG Xuan, ZHANG Xiao-Ke*, WANG Hong-Li, and
FU Xiao-Jie
College of Agronomy, Northwest A&F University / Yangling Subcenter of National Wheat Improvement Center, Yangling 712100, China
Abstract: Molecular markers associated with genes for drought resistance play an important role in wheat breeding aiming at
improvement of drought resistance. In this study, we obtained the full-length cDNA of a novel gene of thioredoxin (Trx) super-
family, TaNRX (GenBank accession number KC890769), from common wheat (Triticum aestivum L.) using the protocol of gene
homology cloning, electronic cloning, RACE, and bioinformatics analysis. The open reading frame (ORF) of TaNRX is 1734 bp in
length, and the 5′ and 3′ UTRs are 99 and 182 bp, respectively. The ORF encodes a protein of 577 amino acid residues with a pu-
tative molecular mass of 63.79 kD. The TaNRX is composed of three Trx-like modules arranged as direct repeats of the classic
Trx domain. The first and third modules contain the amino acid sequence Cys-X1-X2-Cys, with the potential for Trx oxidoreduc-
tase activity. Gene TaNRX has four exons and three introns, and is mapped on chromosome 5BS of wheat. The variations of
TaNRX sequences were mainly concentrated in the first intron according to genomic sequence variances analysis between two
types of varieties with different relative germination rates (RGer). Based on the variations within the first intron of TaNRX, four
complementary dominant markers were developed. In 150 wheat varieties (lines), two genotypes on TaNRX locus, TaNRX-a and
TaNRX-b, were identified to be associated with drought resistance. As revealed by the four molecular markers, the average RGer
in TaNRX-a genotype was significantly higher than that in TaNRX-b genotype (P < 0.01). This result suggests that the molecular
markers developed in this study are effective to be used in selection of wheat varieties with drought resistance.
Keywords: Common wheat; Drought resistance; TaNRX; Molecular markers
小麦是我国重要的粮食作物, 干旱是限制小麦
生产的重要因素 [1-2]。选育和推广抗旱小麦品种是
保障国家粮食安全、促进小麦生产持续稳定发展的
有效途径之一。抗旱基因的挖掘和分子标记开发 ,
30 作 物 学 报 第 40卷


对小麦育种具有重要实践意义。
干旱胁迫会引起植物体内一系列生理生化功能
的改变, 导致呼吸增强、光合降低、生物膜结构破
坏等 [3]。应对干旱胁迫, 植物体内诱导许多基因的
特异表达, 以维持代谢平衡 [4]。干旱胁迫下植物体
内蛋白质组变化的研究, 有助于寻找抗旱相关的蛋
白和基因。Caruso等 [5]发现干旱胁迫下小麦蛋白质
组可鉴定的36个差异表达蛋白点中, 有15%与活性
氧清除功能相关, 且均显著上调表达; Peng等[6]也指
出在受到干旱胁迫时, 抗旱小麦品种可表达较多与
抗氧化有关的蛋白。活性氧的积累是导致植物在干
旱胁迫下细胞组分损伤的直接原因之一, 植物体内
活性氧的清除主要依靠一些抗氧化保护的酶类[7]。
硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)是一类广泛存在于植物
体内的多功能蛋白, 它能参与光合作用中的电子传
递、被氧化蛋白质的修复、体内活性氧的清除等生
理代谢 [8-10]。夏德习等 [11]研究发现, 拟南芥硫氧还
蛋白 M1型基因(AtTRXm1)在 H2O2的处理下大量表
达, 表明其与氧化胁迫相关。Trx 与含有二硫巯基
的许多蛋白组成一个超家族, Broin 等[12]发现1个干
旱诱导蛋白 CDSP32, 包含两个与 Trx类似的肽序列
结构, 为 Trx 超家族成员, 其 mRNA 和蛋白受氧胁
迫的诱导而大量表达, 认为该蛋白能缓解干旱引起
的氧化胁迫。Laughner 等[13]在玉米中首次分离出了
作物体内的核氧还蛋白(nucleoredoxin, NRX)基因 ,
其编码产物属于 Trx 超家族的新成员, 包含3个 Trx
活性功能区, 但其涉及的代谢途径和功能尚不清楚,
目前在其他作物中未见相关基因的报道。
本实验室在前期研究旱地小麦品种晋麦47幼苗
叶片水分胁迫蛋白质组表达差异中 , 发现一个显
著上调的蛋白质谱 , 鉴定为大麦某个预测蛋白
(GenBank登录号为 BAJ87919), NCBI数据库中暂无
小麦与之同源的序列。为进一步明确该水分胁迫差
异蛋白信息, 挖掘小麦抗旱相关基因, 本研究采用
同源克隆和 RACE 等技术, 在普通小麦中克隆到一
个 TaNRX 基因, 并基于两组极端抗旱品种该基因的
序列差异开发分子标记, 旨在为抗旱小麦品种选育
提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料及萌发期抗旱性鉴定
以旱地小麦品种晋麦47为材料进行目的基因
cDNA克隆。
按照 GB/T21127-2007“小麦抗旱性鉴定评价技
术规范 ”测定各基因型萌发期的相对发芽率
(–0.5MPa PEG-6000水溶液培养 7d发芽率与无离子
水培养 7 d 发芽率的比值 ), 并按相对发芽率
≥ 90.0%、 70.0%~89.9%、 50.0%~69.9%、 30.0%~
49.9%、≤29.9%依次划分为极强、强、中等、弱和
极弱五种抗旱等级。
1.2 总 RNA提取及目的基因 cDNA克隆
将晋麦 47 的种子放置于以滤纸为芽床的培养
皿内, 在光照培养箱中 20℃暗培养至幼苗高 20 cm
左右, 继续在光照强度 300 μmol m−2 s−1条件下培养
2 d, 然后用−0.5 MPa的 PEG-6000处理 48 h, 采集叶
片用 Trizol 试剂盒(北京百泰克生物技术公司)提取
总 RNA。
以本实验室前期所获得的水分胁迫差异蛋白点
的质谱测序结果序列(GenBank登录号为 BAJ87919)
为探针, 在 NCBI 网站上通过 BLAST 对比, 筛选出
一 致 性 (Identities) ≥ 70% 和 相 似 性 (Positives)
≥ 80%的 12个禾本科同源蛋白序列(表 1)。在保守
区设计 RT-PCR 引物 F1 (5′-ACTGTAGCTATCTATT
TCTCG-3′)和 R1 (5′-TCTTTGCGTCCGTGTTGA-3′),
扩增程序为 94 5 min℃ ; 94 30 s℃ , 55 30 s℃ , 72 ℃
2 min, 35个循环; 72 10 min℃ 。再以测序结果为探针,
在 NCBI小麦 EST数据库中 BLAST, 找到 1条 EST
片段(GenBank登录号为 HX179294), 并构建 EST跨
叠群, 设计特异引物 F2 (5′-AACAAACGGCATAAA
CCA-3′)和 R2 (5′-TCAGGACCAATCAGCACTA-3′),
以胁迫后总 RNA 反转录产物为模板扩增获得基因
的 5′端序列片段, 扩增程序同上。然后按 3′ RACE
Kit(北京百泰克生物技术公司)的使用要求设计嵌套
的 3′ RACE 异性引物 F3 (5′-GAATCCCTTCTCTG
GTCGCCATTGG-3′)和 F4 (5′-AAGACGGTCAACAC
GGACGCAAAGA-3′); 以干旱胁迫后总 RNA 为模
板, 依照试剂盒操作说明进行 3′RACE, 获得目的基
因的 3′端序列片段。回收纯化 PCR 产物, 连接至载
体 pMD18-T, 转化大肠杆菌 DH5α, 鉴定后送南京
金斯瑞生物科技公司测序。最后使用 DNAMAN 软
件拼接, 得到全长 cDNA序列。
1.3 序列的生物信息学分析
使用 NCBI数据库的 BLAST程序比对分析同源
性, DNAMAN 软件查询开放阅读框, 采用 SOPMA
(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl)在线
软件分析蛋白质的二级结构[14]; 利用 EXPASY 网站
第 1期 张 帆等: 一个普通小麦 Trx超家族新基因 TaNRX的克隆与抗旱相关标记开发 31


表 1 高相似性候选蛋白的 BLAST结果
Table 1 BLAST results of candidate proteins with high similarity
物种
Species
GenBank登录号
GenBank accession No.
一致性
Identity
相似性
Similarity
E值
E-value
大麦 Hordeum vulgare BAJ87919 577/577 (100%) 577/577 (100%) 0
XP_003557743 497/578 (86%) 536/578 (92%) 0 二穗短柄草 Brachypodium distachyon
XP_003562828 495/578 (86%) 535/578 (92%) 0
高粱 Sorghum bicolor XP_002467709 454/578 (80%) 498/566 (87%) 0
DAA45727 448/564 (79%) 496/564 (87%) 0
ACF82903 448/564 (79%) 496/564 (87%) 0
玉米 Zea mays
NP_001105407 446/564 (80%) 494/564 (87%) 0
NP_001050331 309/392 (79%) 337/392 (85%) 0
Q7Y0F2 448/580 (77%) 495/580 (85%) 0
EEC75442 448/580 (77%) 495/580 (85%) 0
NP_001050329 435/570 (76%) 487/570 (85%) 0
AAU89249 442/581 (76%) 489/581 (84%) 0
水稻 Oryza sativa
EAY90397 453/589 (74%) 487/589 (82%) 0

(http://www.expasy.org/)上的 ProtParam和 Phyre2 软
件预测编码蛋白质的理论分子量、等电点等理化性
质 [15]以及三维结构 [16], 并利用在线工具 CDD
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)
分析蛋白的保守域; 利用 SignalP 4.1 Server (http://
www.cbs.dtu.dk/services/SignalP), 及人工神经网络
算法对编码蛋白进行信号肽预测[17], 利用 TMHMM
2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)
进行跨膜结构预测 [18]; 基于序列分析结果 , 使用
CLUSTALW和 PHYLIP软件进行蛋白序列的多重比
较和进化分析[19]。
1.4 基因结构分析与标记开发
采用CTAB法[20]提取黄化苗基因组DNA。依据
cDNA序列设计 3对引物(表 2)。在利用中国春的双
体、缺体–四体和双端体对引物进行染色体定位的
基础上, 以晋麦 47和西农 2208的基因组 DNA为模
板分段扩增目标基因的基因组 DNA 序列。PCR 扩
增程序为 94℃预变性 5 min后, 94℃变性 30 s, 51、
54或 55℃退火 30 s, 72℃延长 1~2 min, 30个循环;
最后 72℃延长 10 min。回收 PCR产物并测序, 所用
方法同 1.2部分。拼接基因组 DNA序列后与 cDNA
序列进行比较分析。为明确该 DNA 序列差异与小
麦抗旱性之间的关系, 选用晋麦 47和西农 2208 (水
地品种)进行目的基因的基因组序列差异分析, 进一
步选择两个相对发芽率高于 90%的抗旱性极强品种
鲁麦 21 (97.30%)和临旱 917 (92.00%), 与 2个相对
发芽率低于 30%的抗旱性极弱品种济麦 20 (20.90%)
和陕 150 (26.00%)进行目的基因序列测序比较。依
据差异序列设计 4对引物(表 3)。
以中国春的双体、缺体–四体和双端体材料, 对
目的基因及其分子标记作染色体定位。在此基础上,
用来自全国不同地区的 150 份品种(系)进行标记验
证。PCR程序为 94 5 min℃ ; 94 30 s℃ , 52~57 30 s℃ ,
72 1℃ min, 30个循环; 72 10 ℃ min。
2 结果与分析
2.1 目标基因全长 cDNA克隆
利用引物 F1和 R1对晋麦 47进行同源克隆, 获

表 2 克隆 TaNRX基因引物
Table 2 Primers used for cloning TaNRX gene
引物
Primer
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
染色体位置
Chromosomal location
退火温度
Annealing temp. (℃)
扩增区域
Amplification region (bp)
F: AACAAACGGCATAAACCA Nra1
R: TCAGGACCAATCAGCACTA
5BS 51 1–2370
F: GCTGATTGGTCCTGATGG Nra2
R: AGTCTTTGCGTCCGTGTT
5BS 54 2356–3673
F: GAATCCCTTCTCTGGTCGCCATTGG Nra3
R: CACATAAATGTCACCACGAC
5BS 55 3611–4148
32 作 物 学 报 第 40卷


表 3 TaNRX基因分子标记
Table 3 Molecular markers for TaNRX gene
标记
Marker
序列
Sequence (5′–3′)
扩增片段大小
Size of target fragment (bp)
退火温度
Annealing temp. (℃)
等位基因
Allele
TaNRX-a1 F: CATGGCTCTTCCTGTGCG
R: CTGAATCGCTATGGAAAG
841 52 TaNRX-a
TaNRX-b1 F: TCTCCCGCACTGTGCCTG
R: CTGAATCGCTATGGAAAG
870 56 TaNRX-b
TaNRX-a2 F: TGTCACGGGCGACTACTA
R: AGAAAGGAACTGCCAACC
845 55 TaNRX-a
TaNRX-b2 F: ATCTGTTAAGACGACCACTAGGA
R: AGGAAAACAAGGTGTGGAATAC
910 57 TaNRX-b

得1270 bp 的片段。BLAST 比对结果发现, 与其同
源性最高的为大麦的一个克隆(GenBank 登录号为
AK356704), 其恰好是用于保守位点分析的蛋白探
针(GenBank 登录号为 BAJ87919)的核苷酸序列, 从
而证明该片段为目标基因 cDNA 片段。通过电子克
隆得到971 bp 含起始密码的5′端序列, 包含752 bp
的重叠区; 3′RACE获得长度为551 bp的3′端片段。
采用 DNAMAN 软件拼接, 获得全长 cDNA 序列
(GenBank登录号为 KC890769), 总长度为2015 bp, 其
中5′-UTR为99 bp, 3′-UTR为182 bp, ORF为1734 bp,
编码577个氨基酸。
2.2 TaNRX基因编码蛋白的生物信息学分析
2.2.1 蛋白的二级结构及理化性质 预测该蛋白
主要由 α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲、延伸链构成
(表 4); 理论分子量为 63.79 kD, 理论等电点为 4.82,
分子式为 C2866H4427N729O876S21, 脂肪系数为 81.47,
平均亲水性为−0.260, 可能为脂溶性蛋白 , 不稳定
系数为 31.32, 表明该蛋白为稳定蛋白[21]。

表 4 TaNRX蛋白的二级结构预测
Table 4 Secondary structure prediction of TaNRX protein
二级结构类型
Type of secondary
structure
氨基酸残基
Number of amino
acid residues
百分数
Percentage
(%)
α-螺旋 Alpha helix 213 36.92
β-折叠 Beta turn 52 9.01
无规则卷曲 Random coli 176 30.50
延伸链 Extended strand 136 23.57

2.2.2 蛋白的三级结及保守结构域 预测结果表
明在第 39~134位、第 201~294位和第 364~457位有
3 个与锥虫氧还蛋白 (tryparedoxin, TryX)类似的
Trx-like 结构域, 且 N-端的 Trx-like 结构域中存在
WCPPC结构, 说明该蛋白属于 Trx超家族中核氧还
蛋白类 , 将其基因暂定名为小麦核氧还蛋白基因 ,
以 TaNRX表示。同时, TaNRX的 C-端 Trx-like结构
域活性中心处氨基酸序列为 WCGPC, 属于 Cys-
X1-X2-Cys 结构, 推测其具备催化氧化还原反应的
活性; 在第 518~545 位存在富含半胱氨酸的 C1-like
锌指结构, 与玉米 NRX的结构一致[13]。
2.2.3 信号肽与跨膜结构 预测结果显示, 该蛋
白的 N 端至第 70 位氨基酸之间剪切位点分值
(C-value)和综合剪切分值(Y-value)无明显峰值 , 说
明该蛋白的 N 端不存在剪切位点, 表明其不包含信
号肽, 推测为非分泌蛋白。显示其不具有跨膜结构,
不是膜定位的蛋白。
2.2.4 同源分析 BALSTP 比对结果显示 ,
TaNRX及其同源相似序列在单、双子叶植物间差距
较大, 分别形成 2个进化枝; 而在单子叶植物中, 小
麦与大麦的亲缘关系最近, 同源性达 93%, 与水稻
的同源性仅为 76% (图 1)。
2.3 TaNRX 基因结构和在晋麦47与西农2208之
间序列差异分析
以中国春双体、缺体–四体和双端体系对引物
Nra1、Nra2 和 Nra3 进行染色体定位, 除缺体–四体
N5B-T5A 和双端体 DT-5BL 的基因组 DNA 的 PCR
没有扩增出预期特异条带外, 3对引物均在中国春的
双体和其余缺体–四体和双端体扩增出预期的特异
条带(图 2)。证明这 3 对引物均位于 5BS 染色体上,
说明目标基因也位于 5BS上。
以晋麦 47 基因组 DNA 为模板, 利用上述 3 对
特异性引物进行 PCR 扩增和测序, 最终克隆获得了
TaNRX 基因组的全长序列, 由 4148 bp 碱基对组成;
与 cDNA 序列比对发现, 该基因包含大小为 90、
487、489 和 668 bp 的 4 个外显子和大小为 1305、
94和 783 bp的 3个内含子(图 3)。在西农 2208基因
第 1期 张 帆等: 一个普通小麦 Trx超家族新基因 TaNRX的克隆与抗旱相关标记开发 33



图 1 TaNRX与其他物种同源序列的进化树
Fig. 1 Phylogenic tree of TaNRX and other homologous sequences from different species


图 2 扩增 TaNRX基因的 3对引物的染色体定位
Fig. 2 Chromosomal localization of three pairs of primers for amplification of TaNRX gene
M: DNA marker 2000; 1: 中国春; 2: N5A-T5B; 3: N5B-T5D; 4: N5D-T5B; 5: DT-5BL。
M: DNA marker 2000; 1: Chinese Spring; 2: N5A-T5B; 3: N5B-T5D; 4: N5D-T5B; 5: DT-5BL.


图 3 晋麦 47 (TaNRX-a)和西农 2208 (TaNRX-b)中 TaNRX基因结构和序列变异示意图
Fig. 3 Sketch map of structure and sequence variation of gene TaNRX in Jinmai 47 (TaNRX-a) and Xinong 2208 (TaNRX-b)
外显子用粗线表示; 非翻译区用细线表示, 包括内含子、5′-UTR和 3′-UTR。
The thick line shows the position of exon, and the thin line shows the position of intron, 5′-UTR, or 3′-UTR.

组中进行 TaNRX全序列克隆和测序, 并与在晋麦 47
基因组的克隆序列进行比较, 发现 TaNRX 基因全序
列在两品种间的一致性达 97.0%, 存在 63 个单核苷
酸变异(SNP)位点、6个插入(Ins)位点和 8个缺失(Del)
位点; 其中在第 1 个内含子区内存在较大差异, 包
含 43个 SNP、4个 Ins和 6个 Del (图 3)。
2.4 TaNRX与抗旱相关分子标记的开发与验证
利用相对发芽率差异明显的 2 组品种进行
TaNRX 基因组全序列测序比较, 发现在第 1 内含子
区段内, 抗旱性极强的鲁麦 21和临旱 917与晋麦 47
序列一致, 而抗旱性极弱的济麦 20和陕 150与西农
2208 序列一致。进而在第 1 内含子区 1 个 3 bp 的
Del位点(图 3)和紧邻的 3个 SNP位点, 设计两个标
记 TaNRX-a1和 TaNRX-b1 (表 3); 在第 1内含子区 1
个 28 bp的 Ins位点(图 3)设计另 2个标记 TaNRX-a2
和 TaNRX-b2 (表 3)。4 个标记引物的染色体定位结
果与克隆基因所用引物一样, 均定位于 5BS之上。
4 个标记用于全国 150 份品种(系)检测, 标记
TaNRX-a1 和 TaNRX-a2 在鲁麦 21 等 92 份品种(系)
中分别扩增出 841 bp和 845 bp的预期条带, 而在济
麦 20等 58份品种(系)中均没有扩增出预期条带, 说
明 TaNRX-a1 与 TaNRX-a2 为显性标记。标记
TaNRX-b1 和 TaNRX-b2 在济麦 20 等 58 份品种(系)
中分别扩增出 870 bp和 910 bp的预期条带, 而在鲁
麦 21等 92份品种(系)中没有扩增出任何条带, 说明
TaNRX-b1 与 TaNRX-b2 也为显性标记 , 同时
TaNRX-a1 和 TaNRX-a2 分 别 与 TaNRX-b1 和
TaNRX-b2 为互补标记。依据上述结果, 将该基因分
为 2种等位变异类型 TaNRX-a和 TaNRX-b。
在 150份品种(系)中, TaNRX-a和 TaNRX-b基因
34 作 物 学 报 第 40卷


型分别为 92 份和 58 份(表 5), 依次占 61.3%和
38.7%。TaNRX-a 基因型品种(系)平均相对发芽率
(73.08%)高于 TaNRX-b基因型(44.49%), 差异极显著
(P<0.01)。其中, 在相对发芽率≥90%的抗旱性极强
品种(系)中, 分子标记检测均为 TaNRX-a 基因型品
种(系); 在相对发芽率在 70.0%~89.9%之间的品种
(系)中, 标记检测为 TaNRX-a的品种(系)占 91%以上;
在相对发芽率≤29.9%的抗旱性极弱品种(系)中, 分
子标记检测均为 TaNRX-b 基因型品种(系); 在相对
发芽率在 30.0%~49.9%之间的品种(系)中, 检测为
TaNRX-b基因型的品种(系)占 70%以上。这一结果表
明分子标记检测为 TaNRX-a 基因型小麦的总体抗旱
性高于 TaNRX-b基因型, 4个标记可用于小麦种质资
源抗旱性的鉴定筛选。

图 4 以 4个分子标记检测小麦品种 TaNRX基因等位变异的电泳图谱
Fig. 4 Profile of electrophoresis on TaNRX allelic variants in wheat varieties using four markers
M: DNA marker 2000; 1: 济麦 20; 2: 鲁麦 21; 3: 陕 150; 4: 临旱 917; 5: 西农 2208; 6: 晋麦 47; 7: 秦麦 9号; 8: 洛麦 8918; 9: 郑麦 9023;
10: 西农 8727; 11: 武农 148; 12: 铜麦 4号; 13: 晋麦 54; 14: 天 94-3; 15: 新麦 26; 16: 中麦 9号; 17: 泰山 21。
M: DNA marker 2000; 1: Jimai 20; 2: Lumai 21; 3: Shaan 150; 4: Linhan 917; 5: Xinong 2208; 6: Jinmai 47; 7: Qinmai 9; 8: Luomai 8918;
9: Zhengmai 9023; 10: Xinong 8727; 11: Wunong 148; 12: Tongmai 4; 13: Jinmai 54; 14: Tian 94-3; 15: Xinmai 26; 16: Zhongmai 9;
17: Taishan 21.

表 5 TaNRX-a和 TaNRX-b基因型的相对发芽率(RGR)及抗旱性不同级别的品种数
Table 5 Relative germination rate (RGR) and number of cultivars with different grades of drought resistance in TaNRX-a and
TaNRX-b genotypes
RGR (%) 各抗级品种数 No of varieties in different grades of resistance 基因型
Genotype
品种数
No. of
varieties
平均值
Average
变异范围
Range
极强
Highly resistant
强
Resistant
中等
Moderately resistant
弱
Susceptible
极弱
Highly susceptible
TaNRX-a 92 73.1 39.4–98.7 13 33 37 9 0
TaNRX-b 58 44.5 14.7–89.3 0 3 19 22 14
总计 Total 150 62.0 14.7–98.7 13 36 56 31 14
抗旱性按 RGR分级, 从极强至极弱 RGR依次为≥90.0%、70.0%–89.9%、50.0%–69.9%、30.0%–49.9%和≤29.9%。
Drought resistance is classified based on RGR, and the criteria of RGR for drought resistance from highly strong to weak are ≥90.0%,
70.0%–89.9%, 50.0%–69.9%, 30.0%–49.9%, and ≤29.9%, respectively.

3 讨论
3.1 小麦 TaNRX及其编码蛋白的结构特点分析
核氧还蛋白(NRX)最早由 Kurooka 等[22]发现并
命名, 因其包含 Trx-like结构域 Cys-X1-X2-Cys活性
区而被认定为 Trx 超家族的新成员, 并将其定位于
细胞核, 植物的NRX最早在玉米中被发现[13]。所有
的 NRX 蛋白在其 Trx-like 结构域中至少有 1 个
WCPPC 结构。相对于 Trx 典型的结构域而言 ,
Ta N R X 中的 T r x - l i k e 结构与锥虫氧还蛋白
(tryparedoxin, TryX)结构更为接近[23]。本研究中得
到的小麦目标基因编码的蛋白序列具备 NRX 结构
特征 , 以 TaNRX 表示。NCBI 数据库中与小麦
Ta N R X 编码蛋白有较高同源性的二穗短柄草
(XP_003557743) 、 水 稻 (NP_001050329) 、 高 粱
(XP_002467709)等序列其相应的基因结构均为 4 个
外显子和 3个内含子, 与 TaNRX基因结构一致, 它们
分别位于二穗短柄草的第 1染色体、水稻的第 3染色
体、高粱的第 1 染色体上。前人对比较基因组学的
研究指出小麦的第 5染色体与二穗短柄草的第 1、水
稻的第 3染色体等存在良好的共线性关系[24-25], 本文
克隆的 TaNRX基因恰好定位在小麦的第 5染色体上,
说明本文分离得到的基因确为小麦 TaNRX基因。
小麦 TaNRX 编码蛋白的第 2 个 Trx-like结构域
的中心序列为 GYPPV, 与玉米中发现的 NRX
(ZmNRX)第 2 个 Trx-like结构域的中心序列 GFPPL
类似, 两者均无 Cys-X1-X2-Cys 结构而无法形成可
逆的二硫键氧化还原中心[13]。TaNRX 的 C-端的半
第 1期 张 帆等: 一个普通小麦 Trx超家族新基因 TaNRX的克隆与抗旱相关标记开发 35


胱氨酸能形成锌指结构, 与 ZmNRX 结构一致, 而
明显区别于哺乳动物类的 NRX, 这可能与动植物的
生理代谢方式及所涉及的功能差异有关[13,23]。小麦
TaNRX的 C-端 Trx-like结构域中心序列为WCGPC,
不同于 ZmNRX 在其 N-端与 C-端均为 WCPPC, 拟
南芥 NRX相似蛋白(GenBank登录号 AAM64954)的
N-端 Trx-like 结构域中心序列为 WCGPC, C-端
Trx-like结构域中心序列为WCPPC结构, 与 TaNRX
结构恰好相反。上述差异可能是具种属间差异的不
同物种体内的不同代谢环境所引起的。
3.2 小麦 TaNRX的等位变异与抗旱性关系
基于小麦 TaNRX第 1内含子区两处差异位点设
计的 4 对引物, 检测结果相同或互补, 可以相互验
证, 进一步说明设计标记所涉及的区段序列在变异
上具有同步性。真核 mRNA内含子能在转录与翻译
等多个过程调控基因表达, 推测 TaNRX 在第 1 内含
子区的等位变异可能与调控该基因的表达有关。He
等[26]基于黄色素合成相关的 PSY基因在内含子区的
差异开发了功能分子标记 , Fu 等 [27]研究春化基因
VRN-1 认为 Vrn-B1、Vrn-D1 在第 1 个内含子区的 1
个大片段缺失包含了介导开花抑制的识别位点, 并
开发了识别不同等位变异类型的功能分子标记。本
文基于两组极端抗旱品种第 1 内含子区之间的差异
序列开发了分子标记, 用 150 份抗旱性存在明显差
异的品种(系)验证表明, 标记所划分的不同等位变
异基因型材料的相对发芽率存在显著差异, 所开发
的标记能在一定程度上区分材料的萌发期抗旱性强
弱。本文标记检测为 TaNRX-a基因型品种 (系)萌发
期的总体平均相对发芽率明显高于 TaNRX-b基因型,
可能与其在干旱胁迫下大量表达, 参与逆境下的胁
迫信号传递和活性氧清除等功能有关。但在所检测
的品种(系)中, 有 6%的 TaNRX-a基因型材料萌发抗
旱性较弱, 2%的 TaNRX-b基因型材料萌发抗旱性较
强, 一方面干旱胁迫下种子萌发可能还受其它生化
物质的调控, 另一方面可能与小麦适应干旱胁迫途
径的多样性有关, 也许 TaNRX 基因还存在与抗旱相
关的其他等位变异类型。
目前对植物 NRX功能的研究报道较少, 对其参
与的代谢途径也不甚清楚。本研究基于基因型间萌
发期抗旱性差异显著性分析, 表明 TaNRX 基因很可
能参与了小麦调控干旱胁迫的生理适应过程, 但涉
及的调控机理有待进一步试验研究。干旱胁迫应答
包含多个生理生化过程, 小麦在生长发育的不同阶
段对干旱的耐受性差异使其抗旱性的研究更为复杂,
随着对小麦抗旱机理研究的深入, 在明确不同生育
期抗旱相关主效基因的基础上开发多个功能标记 ,
能弥补单个基因标记的不足, 更全面地指导抗旱品
种的选育。
4 结论
从普通小麦中克隆了一个位于5BS 染色体的
Trx 超家族新基因 TaNRX, 其开放阅读框由1734 bp
组成, 编码577个氨基酸。小麦 TaNRX基因与抗旱相
关的等位变异包括 TaNRX-a和 TaNRX-b基因型。基
于萌发期相对发芽率极端品种第1内含子区域的差
异序列, 开发了4个显性互补的分子标记, 用其检测
表明 TaNRX-a 基因型品种萌发期的平均相对发芽率
明显高于 TaNRX-b 基因型, 说明开发的标记可以用
于小麦抗旱性筛选鉴定。
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