全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(6): 850859 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由江苏省农业科技自主创新项目[CX(15)1015]和江苏省科技支撑计划项目(BE2013429)资助。
The study was supported by the Independent Innovation Fund for Agricultural Science and Technology of Jiangsu Province [CX(15)1015],
and the Science-technology Support Program of Jiangsu Province (BE2013429).
* 通讯作者(Corresponding author): 胡春梅, E-mail: jjjhcm@njau.edu.cn
Received(收稿日期): 2015-11-11; Accepted(接受日期): 2016-03-14; Published online(网络出版日期): 2016-03-21.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160321.1056.016.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00850
紫色不结球白菜花色苷合酶基因 BrcANS的克隆与表达分析
许玉超 1 侯喜林 1 徐玮玮 1 沈露露 2 张仕林 1 刘世拓 1 胡春梅 1,*
1 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095; 2 安徽省合肥市肥西县农业委员会, 安徽合肥 230001
摘 要: 以不结球白菜紫色品系 NJZX1-3和其绿色突变体 NJZX1-0及其后代 F2的 2个株系 NJZX2-1和 NJZX2-2为
材料, 研究花色苷合酶基因在紫色不结球白菜叶片花色苷合成途径中的作用。利用同源克隆的方法, 分别在 NJZX1-3
及 NJZX1-0 中克隆到花色苷合酶基因; 经序列比对发现, 花色苷合酶基因的核苷酸和氨基酸序列在 2 种材料和大白
菜中完全一致, 长度为 1077 bp, 编码 358个残基, 第 211~第 307肽段具有 2OG-Fe(II)双加氧酶家族基因的结构域, 被
命名为 BrcANS。BrcANS 蛋白与同科芥菜的同源性高达 99%, 进化关系亦与其最相近。在全部 4 种材料鲜叶中, 总
花色苷的含量(TAC)与叶片紫色程度是一致的, 其中, NJZX1-3 叶片中总花色苷含量最高, 达到 80.15±5.74 mg 100
g–1 FW; BrcANS表达量为 NJZX1-0 < NJZX2-1 < NJZX2-2 < NJZX1-3, 与其总花色苷含量呈正相关。BrcANS的 mRNA
在 NJZX1-3 和 NJZX1-0 两种材料的不同组织中特异性表达: 在叶片中高度表达, 而在其他组织中表达较弱; 另外,
在两种材料间的表达亦存在显著差异, 在 NJZX1-3 叶片中的表达丰度显著高于 NJZX1-0。随着叶龄的增大, 紫色不
接球白菜叶片紫色变浅, BrcANS的表达量下降, 且在 NJZX1-3和 NJZX1-0间的表达差异亦明显减小。以上结果表明,
BrcANS基因是紫色不结球白菜中花色苷合成的关键基因之一, 其mRNA表达量与叶片紫色直接相关, 可能在其转录
水平上调控叶片中紫色的形成。
关键词: 不结球白菜; 花色苷合酶; 同源克隆; 序列分析; 总花色苷含量; 基因表达
Cloning and Expression Analysis of Anthocyanidin Synthase Gene BrcANS
from Purple Non-heading Chinese Cabbage
XU Yu-Chao1, HOU Xi-Lin1, XU Wei-Wei1, SHEN Lu-Lu2, ZHANG Shi-Lin1, LIU Shi-Tuo1, and HU
Chun-Mei1,*
1 State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2 Agriculture
Committee of Feixi County, Hefei 230001, China
Abstract: Purple non-heading Chinese cabbage cultivar NJZX1-3, its green leaf mutant line NJZX1-0, and their progeny F2:
NJZX2-1 and NJZX2-2 were used to study the function of anthocyanidin synthase gene in the anthocyanin biosynthesis of
non-heading Chinese cabbage leaf. Homology-based cloning was used and anthocyanidin synthase gene was respectively cloned
from two cultivars (NJZX1-3 and NJZX1-0). The gene nucleotides and amino acids sequences found in the two materials and
Chinese cabbage were exactly the same, with a length of 1077 bp and encoding a peptide with 358 residues. Furthermore, a
2OG-Fe(II) dioxygenase super family domain was found in the amino acid sequence from the 211th to the 307th amino acids and
the gene was named as BrcANS. The homology between BrcANS protein and BjANS protein was up to 99%, in accordance with
the close relationship between them. Their total anthocyanin content (TAC) was consistent with the degree of purple in fresh
leaves of the four materials, of which total anthocyanin content in cultivar NJZX1-3 leaves was the highest, up to 80.15±5.74 mg
100 g–1 FW. Simultaneously, the expression level of BrcANS (NJZX1-0 < NJZX2-1 < NJZX2-2 < NJZX1-3) was positively corre-
lated with the increasing trend of TAC. The mRNA of BrcANS exhibited tissue-specific expression in both materials, showing high
level in leaves and lower level in other organs. In addition, the expression of two materials was significantly different, indicating
that the expression of BrcANS in cultivar NJZX1-3 leaves was obviously higher than that in mutant line NJZX1-0. With the in-
第 6期 许玉超等: 紫色不结球白菜花色苷合酶基因 BrcANS的克隆与表达分析 851


creasing of leaf age, the leaf color became shallow and the expression of BrcANS reduced. Meanwhile, the difference of expres-
sion between NJZX1-3 and NJZX1-0 decreased significantly. These results indicated that BrcANS gene is one of the key genes in
the anthocyanin biosynthesis of non-heading Chinese cabbage leaf, and its expression level is directly related to the purple color
of leaves, thus the gene might regulate the formation of the purple color in leaves at transcriptional level.
Keywords: Non-heading Chinese cabbage; Anthocyanidin synthase; Homology-based cloning; Sequence analysis; Total
anthocyanin content; Gene expression
不结球白菜(Brassica campestris ssp. chinensis
Makino)为十字花科芸薹属白菜甘蓝类蔬菜, 在中国
广泛栽培。近年来, 东南亚、日本、欧美等地也引
种, 逐渐成为一种世界性蔬菜[1]。紫色小白菜作为不
结球白菜的一个品种类型, 因其色彩鲜艳和富含花
色苷而极具营养价值, 引起越来越多人的注意。
花色苷, 是一类水溶性有色黄酮类化合物, 主
要存在于液泡中, 是植物次生代谢产物三环类黄酮
化合物的主要成员 [2], 广泛分布于种子植物 , 在植
物花、叶片、果实、种子和其他组织中响应深色到
蓝色的变化[3-4]。花色苷具有较强的抗氧化活性, 其
合成路径是植物次生代谢中被最广泛研究的途径之
一 [5-6]。其中 , 花色苷合酶 (anthocyanidin synthase,
ANS, 又称 leucoanthocyanidin dioxygenase, LDOX)
是花色苷合成后期的关键酶 ,催化无色花色苷转化
为有色花色苷[7](图1)。目前, 已先后从拟南芥、芥
菜、葡萄、马铃薯和洋葱等植物分离了ANS基因[8-12]。
此外, R2R3-MYB (MYB)、MYC (bHLH)和WD40三
类转录因子通常以WD-repeat/Mybs/bHLH复合物的
形式来调节花色苷合成途径中结构基因的表达进
而调控花色苷的合成 [13]。在拟南芥中 , WD-repeat
蛋白TTG1通过结合bHLH转录因子 (GL3、TT8或
EGL3)和 R2R3-MYB转 录 因 子 (MYB75/PAP1或
MYB90/PAP2)形成WD-repeat/Mybs/bHLH复合物
来上调花色苷合成后期基因 (DFR、ANS或UF3GT)
的表达[7,14-18] (图1)。但关于这些转绿因子对紫色不
结球白菜中花色苷合成后期关键基因方面的研究 ,
还未见报道。

图 1 拟南芥中花色苷的生物合成途径[7]
Fig. 1 The biosynthetic pathway of anthocyanidins in Arabidopsis[7]
852 作 物 学 报 第 42卷

本研究利用大白菜BrANS1 (Bra013652) (BRAD;
http://brassi cadb.org/brad/)同源基因设计引物, 从紫
色不结球白菜和其绿色突变体的叶片中分别得到花
色苷合成相关的花色苷合酶基因cDNA全长 , 利用
生物信息学方法分析该基因序列, 推测BrcANS基因
的功能, 为研究紫色不结球白菜中花色苷合成的分
子调控机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以南京农业大学白菜系统生物学实验室提供的
紫色不结球白菜品系 NJZX1-3, 其绿色突变系
NJZX1-0、NJZX2-2 [母本 NJZX1-3和父本 NJZX1-0
杂交的 F1代自交得到的深色单株(F2深)]和 NJZX2-1
[母本 NJZX1-3 和父本 NJZX1-0 杂交的 F1代自交得
到的浅色单株(F2 浅)]为材料, 将种子用蒸馏水冲洗
干净, 室温催芽 3 d左右, 播种至穴盘, 移至大棚温
室 , 待材料长到适于本试验时 , 按试验设计取样 ,
置–80℃保存备用。
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株 DH5α由本实验
室保存; 质粒载体 PMD19-T easy、Prime STAR GXL
DNA 聚合酶(高保真聚合酶)、TaKaRa RNAiso Re-
agent (RNA提取试剂盒)、Prime Script RT Reagent
Kit (第 1 链 cDNA 合成试剂盒)、PrimeScript RT
Reagent Kit with gDNA Eraser (单链 cDNA的合成试
剂盒)、SYBR Premix Ex Taq和 DNA胶回收试剂盒
等均购自 TaKaRa 公司, 2×HiQPCR MIX 购自欧科
(南京)生物技术有限公司。
1.2 第 1链 cDNA的合成
用RNA提取试剂盒 (TaKaRa RNAiso Reagent,
TaKaRa, 大连 , 中国)分别提取NJZX1-3和NJZX1-0
十叶期叶片的总RNA。使用反转录试剂盒 (Prime
Script RT Reagent Kit, TaKaRa)合成第一链cDNA。
1.3 单链 cDNA的合成
用RNA提取试剂盒(同上)分别提取下列材料的
总RNA: (1) NJZX1-3、NJZX1-0、NJZX2-1和NJZX2-2
七叶期叶片; (2) NJZX1-3和NJZX1-0 的根、茎、叶
片、心叶和花蕾; (3) NJZX1-3和NJZX1-0四叶期、七
叶期、十五叶期和抽薹期叶片。使用反转录试剂盒
(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser, Ta-
KaRa), 合成单链cDNA。
1.4 ANS基因的克隆
以反转录得到的第1链cDNA为模板, PCR 总体
系20 μL, 包含模板1 μL、dNTPs混合物2 μL、Prime
STAR GXL DNA聚合酶 0.5 μL、5×Prime STAR GXL
缓冲液5 μL、引物BrcANS-F/R各1 μL (表1)、ddH2O
14.5 μL。反应程序为96℃ 2 min; 96℃ 30 s, 57℃ 30
s, 72℃ 2 min, 35个循环; 72℃ 10 min。PCR产物经
1.2% (w/v)凝胶电泳检测后, 用DNA凝胶回收试剂
盒 (TaKaRa)回收 , 将回收的目的片段与 PMD-19
Teasy载体(TaKaRa)连接, 转化大肠杆菌, 挑取单克
隆, 送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。
1.5 生物信息学分析
用 Cluster1.8 和 DNAMAN6.0 对该基因的核苷
酸序列及其推定的氨基酸序列进行序列比对。利用
MEGA5.20软件的 Neighbor-Joining方法, 自展值设
定为 1000, 进行物种间进化树分析。
1.6 半定量 PCR
根据 BrcANS 的 cDNA 全长序列, Actin 基因[19]
作为内参, 利用 Beacon Designer v7.9软件设计引物
BrcANS-S/A和 Actin-S/A (表 1)。以单链 cDNA作为
模板, 体系 20 μL, 包括 2×HiQPCR MIX 10 μL、引
物各 1 μL、模板 1 μL、ddH2O 7 μL。反应程序为 96
℃ 2 min; 96℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 30 s 28个循
环; 72℃ 10 min。每个反应设 3次重复。
1.7 实时荧光定量 PCR
采用 SYBR Premix Ex Taq剂盒, 以稀释 10 倍
的单链cDNA作为模板, 体系20 μL, 含Taq 10μL、模
板2 μL、引物各0.4 μL (表1), 相对定量使用参照基
因的ΔCT法[19], 表达差异等于2–ΔCT, ΔCT = CT目标基因
– CT actin。SYBR Premix Ex Taq 10 μL, ddH2O 7.2 μL。
每个反应设3次生物学重复。采用Microsoft Excel
2007和IBM SPASS20.0分析基因表达情况及显著性。
1.8 总花色苷含量的测定
总花色苷的提取略有改动[21], 将新鲜组织加入
液氮研磨成粉末 , 加入0.1% HCl甲醇(v/v)溶液 15
mL; 用超声波(40 kHz, 100 W, T < 35℃, KQ-500DE
型数控超声波清洗器, 中国昆山)浸提 25 min; 4℃,
10 621 × g离心 10 min, 上清液经真空浓缩机
(Eppendorf Concentrator Plus, 中国)富集; 加入等体
积V (提取液体积 )的 0.1% HCl水 (v/v)溶液 , 经
0.22 μm滤膜过滤, 备用。
采用pH值示差法测定[22], 取滤液1 mL, 分别用
pH 1.0的KCl (0.2 mol L–1)缓冲液和pH 4.5的NaAc
(0.45 mol L–1)缓冲液, 定容至10 mL, 分别测定520
nm和700 nm处吸光值A, 每个反应设3次重复。
第 6期 许玉超等: 紫色不结球白菜花色苷合酶基因 BrcANS的克隆与表达分析 853


表 1 试验引物及其序列
Table 1 Sequence of primers used in this study
引物名称
Primer
序列
Sequence (5′→3′)
用途
Purpose
BrcANS-F/R F: ATGGTTGCAGTTGAAAGAGTT; R: TCAGACTTCATCCTTTTTCTCAG ORF cloning
BrcANS-S/A F: CTCTGACCTTCATTCTAC; R: CCTTACCTTCTCCTTATTC RT-PCR or qRT-PCR
Actin-S/A F: GTTGCTATCCAGGCTGTTCT; R: AGCGTGAGGAAGAGCATAAC RT-PCR or qRT-PCR

总花色苷含量(mg 100 g–1) = [(A520–A700) pH1.0 –
(A520–A700) pH4.5]449.2DFV100/(269001W)
式中449.2 g mol–1为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相
对分子质量; 26 900为摩尔吸光系数(L mol–1 cm–1);
DF为稀释倍数; 1为比色皿光程(cm); V为提取液体
积(L); W为鲜重(g)。
2 结果与分析
2.1 BrcANS的克隆与序列比对
分别以 NJZX1-3和 NJZX1-0成熟期叶片的
cDNA为模板 , 克隆得到 4条片段 , 片段 1和 2为
NJZX1-3的ANS扩增图谱 , 片段3和4为NJZX1-0的
ANS扩增图谱; 测序结果表明, ANS基因在NJZX1-
3和NJZX1-0中片段大小一致 , 长度都为1077 bp
(图2)。核苷酸和氨基酸序列比对结果表明, NJZX1-
3和NJZX1-0的ANS基因核苷酸碱基和推测的氨基
酸序列完全一致 , 编码 358个残基 , 且与大白菜
BrANS1核苷酸和氨基酸序列亦完全一致(图3)。保
守域分析 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/-
wrpsb.cgi)结果表明 , 不结球白菜花色苷合酶蛋白
属于2OG-Fe(II)双加氧酶超家族 , 因此被命名为
BrcANS基因。
2.2 BrcANS蛋白的同源性比较及进化树分析
将不结球白菜的 BrcANS 氨基酸序列与其他物

图 2 不结球白菜NJZX1-3和NJZX1-0中BrcANS的全长 cDNA
扩增结果
Fig. 2 Full cDNA amplification of BrcANS in non-heading
Chinese cabbage NJZX1-3 and NJZX1-0
M: DNA marker DL2000; 1 to 2: NJZX1-3 ANS; 3 to 4: NJZX1-0 ANS.
种的 ANS氨基酸序列同源比对发现, 不同物种花色
苷合酶序列之间具有相同的活性中心和较多的高度
保守序列, 包含典型的 2-酮戊二酸铁依赖型双加氧
酶的保守功能域, 其中包括与 2-OG 特异结合的精
氨 酸 (Arg) 2 个 (R288,297) 和 丝 氨 酸 (Ser) 5 个
(S236,265,278,284,299), 与 Fe2+ 特异结合的组氨酸(His) 4
个(H232,243,269,287)和天冬氨酸(Asp) 2 个(D234,272), 这
几个位点在不同物种的 ANS序列中高度保守, 其中,
BrcANS与芥菜(Brassica juncea, ACH58397.1)、结球
甘蓝(Brassica oleracea var. capitata, AAO73440.1)、
萝 卜 (Raphanus sativus, AIM48928.1) 、 拟 南 芥
(Arabidopsis thaliana, AEI99590.1)、苹果 (Malus
domestica, AAZ79374.1)、蓝莓(Vaccinium corymbo-
sum, AFA53722.1)、马铃薯(Solanum tuberosum, NP_
001274859.1)、大豆(Glycine max, NP_001239794.1)
的 ANS基因序列同源性分别为 99%、97%、92%、
92%、80%、77%、75%和 80%, 表明花色苷合酶基
因序列在进化上具有较高的保守性(图 4)。
系统进化树分析表明 , 在十字花科的5种主要
植物中, 不结球白菜与芥菜亲缘关系最近; 在不同
科属间, 不结球白菜BrcANS与蔷薇科的苹果的关系
较近(图5)。
2.3 BrcANS在不同叶色材料中的表达
2.3.1 不同材料叶片的表型观察 根据上表皮叶
色差异可以把 4 个材料分为 3 类 , 即绿色的
NJZX1-0、浅紫色的 NJZX2-1 和深紫色的 NJZX2-2
和 NJZX1-3。绿色材料的下表皮呈绿色, 浅紫色材
料的下表皮中部分靠近叶缘的叶脉为紫色, 而深紫
色材料的下表皮中靠近叶缘的叶脉和叶肉都呈紫色,
特别是叶尖部位(图 6)。NJZX2-2和 NJZX1-3鲜叶中
总花色苷含量较高, 分别为 69.30±5.06 mg 100 g–1
FW 和 80.15±5.74 mg 100 g–1 FW, 且极显著高于
NJZX2-1 和 NJZX1-0; NJZX1-0 鲜叶中总花色苷含
量最低且极低于 NJZX2-1; 提取液颜色的色度与总
花色苷含量呈正相关(图 7和图 8)。
854 作 物 学 报 第 42卷


图 3 NJZX1-3、NJZX1-0和大白菜 ANS的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列比对结果
Fig. 3 Comparison of ANS nucleotide (a) and amino acid (b) sequences of NJZX1-3, NJZX1-0, and Chinese cabbage

2.3.2 BrcANS 的表达分析 实时定量 PCR 结果
表明, BrcANS 在不同叶色的叶片中均有表达, 在绿
色叶片 NJZX1-0 中表达量仅为 0.095, 而在深紫色
叶片 NJZX2-2和 NJZX1-3中的表达量最高, 分别为
1.94 和 1.99, 其次是浅紫色叶片 NJZX2-1, 其表达
量为 0.98。NJZX1-3、NJZX2-2和 NJZX2-1中 BrcANS
表达量分别是 NJZX1-0的 208.79、203.63和 103.01
倍(图 9)。说明 BrcANS 的表达量随着叶片紫色的加
深而增加。
2.4 BrcANS 在 NJZX1-3 和 NJZX1-0 材料不同
组织中的表达情况
半定量 PCR检测花色苷合酶基因表达的结果表
明 , 2 种不结球白菜均为心叶中转录水平最高。
NJZX1-3 各组织表达丰度为心叶>叶>叶柄>花蕾>
第 6期 许玉超等: 紫色不结球白菜花色苷合酶基因 BrcANS的克隆与表达分析 855



图 4 BrcANS和其他已知 ANS蛋白同源性比较
Fig. 4 Homologous alignment of amino acid sequences of BrcANS and other known ANS
●: Fe2+结合位点; ▼: 2-酮戊二酸结合位点。黑框代表 2-酮戊二酸铁依赖型双加氧酶的保守功能域; I: 不结球白菜; II: 芥菜; III: 结球
甘蓝; IV: 萝卜; V: 拟南芥; VI: 苹果; VII: 蓝莓; VIII: 马铃薯; IX: 大豆。图中黑色阴影表示完全相同的位点, 灰色阴影表示部分相同
的位点。
●: Fe(II) atom binding sites; ▼: 2-OG binding sites. I: Brassica campestris ssp. chinensis Makino; II: Brassica juncea; III: Brassica oleracea
var. capitata; IV: Raphanus sativus; V: Arabidopsis thaliana; VI: Malus domestica; VII: Vaccinium corymbosum; VIII: Solanum tuberosum;
IX: Glycine max. Black shadow indicates exactly the same sites, gray shadow indicates the part of the same site. Black frame represents
2OG-Fe(II)-dependent dioxygenase conserved functional region.

图 5 BrcANS与其他植物中 ANS蛋白的系统进化分析
Fig. 5 Phylogenetic analysis of BrcANS and ANS protein in other species
856 作 物 学 报 第 42卷


图 6 不同材料不结球白菜叶色间比较
Fig. 6 Comparison of leaf color in non-heading Chinese
cabbage
a: NJZX1-0; b: NJZX2-1; c: NJZX2-2; d: NJZX1-3.

图 7 不结球白菜叶色中总花色苷提取液颜色
Fig. 7 Color of total anthocyanin extracted from non-heading
Chinese cabbage leaves

图 8 不结球白菜叶中总花色苷含量
Fig. 8 Total anthocyanin content of non-heading Chinese
cabbage leaves
表中数据为 3重复的平均值±SD, 大写字母表示在 P<0.01水平上
差异性。
The data are means (n=3) ± SD, anthocyanin content with different
capital letters are significantly different at P<0.01.

茎>根; 而 NJZX1-0 的表达情况为心叶>根, 叶柄>
茎>叶>花蕾; 其中, BrcANS的表达量在 NJZX1-3的
叶片中显著高于 NJZX1-0, 其他组织中表达量的差
异则不明显(图 10)。
2.5 BrcANS 在 NJZX1-3 和 NJZX1-0 两材料不
同时期叶片中的表达
花色苷合酶基因 BrcANS在 2种材料的 4个叶期

图 9 BrcANS基因在不同不结球白菜叶片中表达水平
Fig. 9 Relative expression levels of BrcANS gene in different
non-heading Chinese cabbage leaves
标以不同大写字母的柱值差异显著(P<0.01)。
Bars superscribed by different letters are significantly different at
P <0.01.

中表达趋势是一致的, 四叶期表达量最高, 十五叶
期其次, 七叶期表达量较低, 至抽薹期表达量显著
降低, 即从苗期到抽薹期 BrcANS表达量总体呈现降
低趋势; 在 NJZX1-3 不同叶期中 BrcANS 的表达量
显著高于 NJZX1-0, 其差异随着叶龄的增大而减小,
由四叶期为 NJZX1-0的 633.09倍, 降至抽薹期为于
NJZX1-0的 63.43倍(图 11)。
3 讨论
紫色白菜类叶片中所含色素为花青苷类化合物[23],
有研究发现, 在包括红叶芥菜、紫红色大白菜、红
菜薹、紫色小白菜和紫结球甘蓝5种芸薹属新鲜叶片
中总花色苷含量介于13.00~71.90 mg 100 g–1 FW[24],
在本研究中紫色不结球白菜鲜叶中总花色苷含量介
于27.29~80.15 mg 100 g–1 FW, 说明本研究结果与前
人研究具有可比性。并且在紫色不结球白菜NJZX1-
3鲜叶中总花色苷含量高于红叶芥菜(71.90 mg 100
g–1 FW)。在3种不同叶色的观赏海棠中, 常紫叶类品
种“王族”中, 其 McANS的表达量始终较高, 绿叶色
类“火焰”中, McANS的表达量始终较低。在新叶有色
类品种“绚丽”中, 幼叶紫色期其McANS的表达量也
较高, 功能叶变为绿色后, 表达量随之降低[25]。本研
究的4种材料中 , BrcANS的表达量为NJZX1-0 <
NJZX2-1 < NJZX2-2 < NJZX1-3, 总花色苷含量也为:
NJZX1-0 < NJZX2-1 < NJZX2-2 < NJZX1-3, 说明
BrcANS的表达量随着紫色的加深而增加, 并且与总
花色苷的含量呈正相关; 在水母雪莲中, SmANS1在
红细胞系的细胞培养物和苗中大量表达, 在黄色细
胞系的细胞培养物中表达很弱, 但在根部不表达[26]。
在马铃薯植株中, ScANS 在茎、叶和顶芽中表达较
第 6期 许玉超等: 紫色不结球白菜花色苷合酶基因 BrcANS的克隆与表达分析 857



图 10 BrcANS基因在不结球白菜不同组织中表达量的差异
Fig. 10 Expression of BrcANS gene in different tissues of non-heading Chinese cabbage


图 11 BrcANS基因在不结球白菜叶期中表达水平
Fig. 11 Expression levels of BrcANS gene at leaf-stage in
non-heading Chinese cabbage
两材料间比较时*表示差异在 P < 0.05水平显著, **表示在
P < 0.01水平极显著。同一材料不同叶期间比较时, 标以不同大
写字母的柱值在 P < 0.01水平差异显著。
* and ** show the siginificant at P < 0.05 and P < 0.01, respectively.
Bars superscribed by different letters are significantly different at
P < 0.01.

高, 在根中表达微弱, 在匍匐茎和块茎中无表达[10]。
在本研究中, BrcANS在2种材料不同组织中均有表达,
但转录水平存在一定差异 , 说明在不结球白菜中
BrcANS基因的表达存在组织特异性 ; 在2种材料心
叶中BrcANS的表达丰度较高且基本相同, 但在突变
体NJZX1-0中BrcANS的表达丰度在心叶中明显高于
叶, 这与心叶中有花色苷的积累结果一致, 说明在
突变体中BrcANS的表达水平随着叶片的生长被抑制;
另外, 在NJZX1-3叶片中BrcANS的表达水平显著高
于NJZX1-0叶片。在NJZX1-3和NJZX1-0叶片中, 随
着叶龄的增加 , BrcANS的表达量都在减小 , 且
BrcANS在2种材料叶片中表达量差异亦在减小 , 特
别是在抽薹期时, 从外观上, NJZX1-3叶片的紫色褪
去很多(图片未展示), 这与BrcANS表达量的降低相
对应。以上结果表明BrcANS的表达量与不结球白菜
花色苷的积累呈正相关, 两者关系密切。
花色苷含量是评价植物花色、叶色、果色等经
济器官色泽及营养品质的重要指标, 其合成过程复
杂。花色苷的生物合成由包括苯丙氨酸解氨酶(PAL),
查尔酮合酶(CHS), 查尔酮异构酶(CHI), 黄烷酮3-
羟化酶(F3H)和类黄酮3’-羟化酶(F3’H), NADPH依
赖性二氢黄酮醇还原酶(DFR), 花色苷合酶/无色花
色苷双加氧酶(ANS/LDOX), 类黄酮-3-O-葡糖基转
移酶(UF3GT)等合成基因参与完成[7,13]。花色苷合酶
是花色苷合成途径后期的酶 , 通过Fe2+和2-酮戊二
酸离子将无色花色苷催化为花色苷 [27]。本研究在2
种材料中克隆得到BrcANS基因, 其核苷酸序列和氨
基酸序列比对结果完全一致, 且与大白菜BrANS1亦
完全一致, 长度分别为1077 bp和358个残基, BrcANS
与同科的芥菜、芜菁和紫菜薹[9,28-29]中ANS基因的大
小相同。BrcANS蛋白属于2OG-Fe(II)双加氧酶超家
族, 该家族被认为参与乙烯和赤霉素等植物激素的
合成, 也参与色素(如3-羟基花青素和花青素)和次
生代谢产物(如黄酮)的羟基化和去饱和步骤[30]。本
研究结果表明, 不结球白菜BrcANS在紫色材料中高
度表达, 形成的BrcANS蛋白可能作用于黄烷-3,4-二
醇 , 进而促进3-羟基花青素类次级代谢物的生成 ,
最后, 导致紫色不结球白菜中花色苷的积累, 这可
能是造成叶色泽差异的重要原因。
4 结论
从紫色不结球白菜品系 NJZX1-3和其绿色突变
系 NJZX1-0 的叶片中克隆得到的 BrcANS 基因序列
完全一致, 但其表达量在 2 种材料中存在明显差异,
说明 BrcANS 基因对花色苷合成积累的影响可能主
要发生在其转录水平上, BrcANS 蛋白通过调节 3-羟
基花青素类次级代谢物的生成, 使叶片呈现深紫色。
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