全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(8): 12011211 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31260358)和国家转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08005-005)项目资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 张薇, E-mail: zhw_agr@shzu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: hanzegang501706851@126.com, Tel: 13779593063
Received(收稿日期): 2014-11-06; Accepted(接受日期): 2015-05-04; Published online(网络出版日期): 2015-05-15.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150515.1542.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.01201
枯萎病菌诱导感、抗陆地棉品种的基因表达谱分析
韩泽刚 赵曾强 李会会 张 析 李潇玲 张 薇*
石河子大学农学院 / 棉花分子育种实验室, 新疆石河子 832000
摘 要: 选用陆地棉抗枯萎病品种中棉所 12和感枯萎病品种新陆早 7号, 利用 Solexa高通量测序技术分析棉花幼苗
受到枯萎病菌侵染后 3 h和 6 h根部组织的基因表达谱。中棉所 12受病菌侵染后 3 h与 0 h相比, 6 h与 0 h相比以及
6 h与 3 h相比, 分别鉴定出 4447、5481和 2559个差异表达基因; 新陆早 7号分别鉴定出 8615、6727和 2078个差
异表达基因; 2个品种比较, 在 3 h和 6 h分别鉴定出 1879个和 500个差异表达基因。基因功能分析表明, 差异表达
基因划分为生物学过程、细胞组分和分子功能注释本体, 并进一步细分为 48 个功能类别。代谢通路分析显示, 中棉
所 12和新陆早 7号在枯萎病菌侵染后的 6 h与 0 h相比鉴定出的代谢通路(Pathway)最多, 均有 126条; 在枯萎病菌
侵染后 6 h, 2个品种相比鉴定出的代谢通路最少, 仅有 89条。各个比对组的代谢通路涉及的基因可被划分为次生代
谢产物的生物合成、多糖的生物合成和代谢、环境适应和免疫系统等 13类。在环境适应和免疫系统分类中存在着植
物与病原菌相互作用代谢通路, 涉及到 996个已知功能的差异表达基因, 有 444个基因上调表达, 552个基因下调表
达。其中, 差异表达基因最多的是 WRKY 转录因子家族基因, 其次为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因, 而 DNA 损伤修
复/耐受性蛋白, JAZ1、RAR1和 RPM1互作蛋白, S位点的特异性糖蛋白 S6前体以及钙牵引蛋白等 6类基因参与该
代谢通路的数目最少。最后随机抽取 6个基因进行实时荧光定量 PCR验证, 其结果与测序结果一致。
关键词: 陆地棉; 枯萎病; Solexa; 基因表达谱
Expression Profiling Analysis between Resistant and Susceptible Cotton Culti-
vars (Gossypium hirsutum L.) in Response to Fusarium Wilt
HAN Ze-Gang, ZHAO Zeng-Qiang, LI Hui-Hui, ZHANG Xi, LI Xiao-Ling, and ZHANG Wei*
Agricultural College of Shihezi University / Laboratory of Cotton Molecular Breeding, Shihezi 832000, China
Abstract: Fusarium Wilt resistant cotton cultivar Zhongmiansuo 12 and susceptible cultivar Xinluzao 7 were used to analyze the
gene expression profiling of root tissues at three hours and six hours after the seedlings infection by Fusarium Wilt using Solexa
sequencing technology. Compared with no infection, 4447 and 5481 differential genes after three hours and six hours infected by
Fusarium Wilt were identified, and compared six hours with three hours, 2559 differential genes were identified in Zhongmiansuo
12; while 8615, 6727, and 2078 was respectively identified in Xinluzao 7. There were 1879 and 500 differential genes in three
hours and six hours after infection when the two cultivars were compared. According to the Gene Ontology, these genes were
divided into these groups of biological process, cellular component and molecular function; then further subdivided into 48 func-
tional categories. By analyzing the pathways, the most of them were identified in 6 h/0 h after infection between Zhongmiansuo
12 and Xinluzao 7, which were 126 each in the two cultivars; the least of pathways were at 6 h after infection in two cultivars,
which was 89 only. However, all the pathways in each comparison group could be classified into 13 categories, such as biosynthe-
sis of other secondary metabolites, glycan biosynthesis and metabolism, environmental adaptation, and immune system. A path-
way, named plant-pathogen interaction in the environmental adaptation and immune system category, was involved in 996 differ-
ential genes; and the number of up regulated genes was 444 and that of down regulated genes was 552. The most differential
genes were in WRKY transcription factor family, the serine/threonine kinase had the medium number of differential genes, while
DNA damage-repair/toleration protein, JAZ1, RAR1, RPM1-interacting protein, S locus specific glycoprotein S6 precursor and
caltractin had the least genes. Finally, six random genes were subjected to RT-PCR and the results validated the Solexa sequencing
1202 作 物 学 报 第 41卷


conclusions.
Keywords: Gossypium hirsutum; Fusarium wilt; Solexa; Expression profiling
棉花枯萎病是一种危害严重的世界性病害。病
菌侵染棉花后, 前期往往大量死苗, 后期叶片及蕾
铃大量脱落, 甚至造成棉花植株的死亡, 严重影响
棉花的品质及产量[1-2]。在植物体内存在极其复杂和
完善的自我防卫系统。当植物受到病原菌侵染, 植
物抗病基因编码蛋白与病原无毒基因编码蛋白相互
识别和作用, 激活信号传导途径, 导致下游一系列
抗病防卫反应基因的启动 , 产生快速的抗病代谢 ,
这一过程涉及大量相关基因表达量的改变。刘坤[3]
利用 qPCR 技术分析棉花受到黄萎病菌侵染后, 29
个 ERF 家族基因的表达变化, 发现除一个基因基本
没有变化外, 其余基因均明显改变, 有的基因表达
水平甚至增加 7 倍以上。韩庆典等[4]利用基因芯片
技术对水稻细菌性条斑病感抗品种分别进行检测 ,
共检测到 956 个差异表达基因, 其中 12 个基因在 2
个品种中一致上调, 54 个基因在 2 个品种中一致下
调, 20个基因在 2个品种中表达变化方向相反。此外,
一些研究发现, 植物受到病原菌侵染后, 同一基因
在感抗品种中的表达存在明显差异。何兰兰等[5]发
现 ERF-B3 亚组转录因子基因 GhB301, 在受到枯萎
病菌诱导后, 其表达量在抗病品种与感病品种中均
明显增加, 但在抗病品种中表达量的增加显著高于
感病品种; 在抗病品种中, 病菌处理后 3 h表达量达
到最大, 早于感病品种的 6 h。
近年来, 人们在棉花抗病分子机制方面已做了
大量研究工作, 并克隆了多个抗病相关基因。但由
于陆地棉尚没有完成基因组测序, 对完整的转录组
信息了解不足, 前人的研究多是对单个基因相对独
立地分析, 难以获得系统的认识。Solexa 测序技术
通过对样品中数以百万计的 mRNA标签进行序列测
定, 捕获样品中低表达的基因, 克服了以往 DNA 微
矩阵芯片等技术的不足, 在研究差异表达基因方面
显示出强大的优势[6]。Wu等[7]通过 Solexa高通量测
序对葡萄霜霉病侵染和对照样品进行转录组测序 ,
发现了大量的差异表达基因, 并找到参与调控与核
糖体结构、光合作用、氨基酸和糖代谢途径有关的
基因 , 初步揭示了葡萄霜霉病病程发展的调控机
制。Bai等[8]利用 Solexa测序技术研究感抗香蕉枯萎
病品种在枯萎病菌诱导后不同时间的基因表达谱 ,
发现抗病品种对香蕉枯萎病的防御响应更快, 并且
在代谢通路(Pathway)分析中发现了大量抗病相关基
因 , 初步揭示了香蕉抗枯萎病的抗病机制。目前 ,
Solexa 高通量测序技术在研究植物的逆境胁迫方面
得到广泛应用[9-14], 本研究利用 Solexa 高通量测序
技术构建感、抗棉花品种在枯萎病菌诱导后不同时
间的基因表达谱, 分析枯萎病菌侵染早期不同时间
及不同感、抗品种间基因在转录组水平上的差异表
达, 旨在为揭示棉花抗枯萎病的分子调控机制及筛
选抗枯萎病相关基因奠定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料和培养条件
陆地棉抗病品种中棉所12和陆地棉感病品种新
陆早7号由石河子大学棉花所提供。挑选经浓硫酸脱
绒后的籽粒饱满的种子, 经0.1%氯化汞浸泡15 min
消毒, 无菌水冲洗4~5遍, 种植于无菌蛭石, 待棉苗
长至3 cm左右移入盛有Hoagland营养液的塑料盒(用
带有孔洞的泡沫板漂浮棉苗), 于25℃、光照16 h、黑
暗8 h的培养箱中继续培育, 每周换一次培养液[15]。
1.2 枯萎病菌和接种方法
将生长于 PDA 培养基的枯萎病菌 [Fusarium
oxysporum f. sp. vasinfectum (Atk.) Snyder & Hansen]
菌落(菌种为枯萎病 7 号生理小种的强致病力菌系
F430, 由石河子大学植保系张莉老师提供)接种到装
有已灭菌的查氏培养液中, 28℃振荡培养 4 d, 配制
成浓度为 7×106个 mL–1的孢子悬浮液。将长至二叶
一心的棉花幼苗根部浸泡到孢子悬浮液接种病菌 ,
处理 45 min后转入 Hoagland营养液中, 采集中棉所
12和新陆早 7号两品种接菌后 0、3和 6 h的棉花根
部组织, 并分别标记为 Z-0、Z-3、Z-6和 X-0、X-3、
X-6。液氮速冻后保存于–80℃冰箱。
1.3 RNA提取及 cDNA的合成
采用改良的CTAB法[16]提取棉花根部组织RNA,
用 ND-100 Nanopo spectrophotometer and Agilent
2100 Bioanalyzer检测 RNA样品的质量。检测合格
的 RNA样品, 加热打开二级结构后用带有 Oligo(dT)
的磁珠富集 mRNA, 向得到的 mRNA中加入适量打
断试剂 , 高温条件下使其片段化 , 再以片段后的
mRNA 为模板 , 合成 cDNA, 利用磁珠纯化双链
cDNA。
1.4 标签文库的构建及 Solexa测序
对所得的双链 cDNA 经过末端修复、3末端加
第 8期 韩泽刚等: 枯萎病菌诱导感、抗陆地棉品种的基因表达谱分析 1203


碱基 A及加测序接头后, 进行 PCR扩增富集测序样
本 , 从而完成整个文库制备。对构建好的文库用
Agilent 2100 Bioanalyzer 和 ABI Step One Plus
Real-time PCR System进行质量和产量检测, 合格后
使用 Illumina HiSeq 2000测序, 得到 Raw reads。
1.5 测序数据的生物信息学分析
将测序得到的 Raw reads, 去除含有接头的序
列、未知序列的比例大于10%的以及低质量的 reads,
得到 clean reads, 以备后续试验。再使用短 reads比
对软件 SOAPalingner/soap 2将 clean reads比对到最
新雷蒙德氏棉参考基因序列及雷蒙德氏棉参考基因
组序列, 最多允许2个碱基错配。对测序结果进行饱
和度分析, 随机性分析及在参考基因组上的分布分
析, 合格后运用 RPKM法(Reads per kb per million
reads)计算基因表达量[17]。
基于Audic和 Claverie[18]描述的方法, 对表达谱
中每个基因进行显著性分析。错配率(false discovery
rate, FDR)则被用于确定 P 值的阈值 [19]。符合
P<0.005, FDR≤0.001以及│log2 ratio│≥1的基因被
定义为差异表达基因, 对所有差异表达基因进行 GO
功能注释及分类, 并利用 KEGG (Kyoto Encyclopedia
of Genes and Genomes)数据库定位分析 Pathway。
1.6 实时荧光定量 PCR的检测
从 Solexa 测序获得的差异表达基因中, 随机挑
选 6 个差异表达明显的基因进行实时荧光定量 PCR
测定 , 采用改良 CTAB 法提取总 RNA。按照
Fermentas公司生产的第一链 cDNA合成试剂盒说明
书上的步骤合成 cDNA。依据数字化基因表达谱测
序所得序列库对应的代表序列, 使用 Primer premier
5.0 软件设计实时荧光定量 PCR 引物 , 以棉花的
GhUBQ7 (DQ116441)基因作为内参基因(表 1)。引物
由北京六合华大基因科技有限公司合成, 所用染料
为 TaKaRa 公司的 SYBR, 实时荧光定量 PCR 的反
应体系及程序参见 TOYOBO 公司的 SYBR Green
Realtime PCR Master Mix (QPK-212)说明书, 设 3个
重复, 采用 2–∆∆Ct法计算基因相对表达量。

表 1 用于实时荧光定量 PCR的引物
Table 1 Primers for real-time PCR
编号
Code
基因
Gene
正向引物
Forward primer (5–3)
反向引物
Reverse primer (5–3)
1 Gorai.005G258100.1 TCCACCGTAACGACCCG CTCCTCCTTGAAGCAGTAGCC
2 Gorai.004G241400.1 ACCGCCCAACACTAAGCC GACAGCGTTTCGAGCACC
3 Gorai.013G220800.1 GCTGATGGTTTGCGAGGATTA TGAACTGCCACTGTTGCCTTA
4 Gorai.007G008500.1 GGCAGAACTGCTTCAACACCC GCGAGCCCTTTGGGATAGTGT
5 Gorai.009G396600.1 AAGTGAGAAGGCAGTGAGGAT GAAGATAGAAGATTTGCAGGTATG
6 Gorai.009G038900.1 CGGACCCACCCAACACTACAT CATTTGCTTGCACCAACCACT
7 GhUBQ7 GAAGACCTACACCAAGCCCAAG CGGACTCTACTCAATCCCCACC
GhUBQ7 (GenBank登录号为 DQ116441)为内参基因。
GhUBQ7 (GenBank accession number: DQ116441) was the internal reference.

2 结果与分析
2.1 测序饱和度分析
测序饱和度是用来衡量样品测序量的多少是否
能够达到分析标准。当测序量(reads数量)增加时, 所
能检测到的基因数量也随之增多, 但是当测序量达
到某一阈值后, 检测到的基因数量增加的趋势趋于
平缓, 证明检测到的基因趋于饱和。以 Z-3 为例(图
1, 其他处理时间的测序饱和度趋势与之类似), 当
测序样品的 clean reads的数目达到 2M时, 检测到的
基因数目趋于饱和, 说明测序量已基本覆盖细胞中
表达的全部基因, 可用于后续的研究分析。

图 1 Z-3的 Solexa测序饱和度分析
Fig. 1 Solexa sequencing saturation analysis of Z-3
1204 作 物 学 报 第 41卷


2.2 差异表达基因统计分析
经 Solexa测序后, 对差异表达基因统计分析(表
2)表明, 2个品种在枯萎病菌侵染后的 3 h和 6 h, 分
别与对照相比, 差异表达基因中的下调基因均明显
多于上调基因, 且感病品种的差异表达基因明显多
于抗病品种。在中棉所 12 中, 与对照(Z-0)相比, 枯
萎病菌侵染后 3 h (Z-3)差异表达基因数目为 4447
个。其中上调基因数目为 1300个, 下调基因数目为
3147个。枯萎病菌处理后 6 h (Z-6), 与对照相比, 差
异表达基因数目为 5481 个。其中上调基因数目为
1494个, 下调基因数目为 3987个。而 Z-6与 Z-3相
比, 差异表达基因的数目较少, 为 2559 个。其中上
调基因数目为 1020 个, 下调基因数目为 1539 个。
在新陆早 7 号中, 与对照(X-0)相比, 枯萎病菌侵染
后 3 h (X-3)的差异表达基因数目为 8615个。上调基
因数目为 2118 个, 下调基因数目为 6497 个。枯萎
病菌处理后 6 h (X-6)与 X-0相比, 差异表达基因数
目为 6727 个。上调基因数目为 2038 个, 下调基因
数目为 4689个。而 X-6与 X-3相比, 差异表达基因
的数目为 2078个。其中上调基因数目为 1010个, 下
调基因数目为 1068个。
比较 2 个品种在枯萎病菌侵染同一时间点的差
异表达基因(表 2)表明, 下调基因数目依然多于上调
基因, 但是差异表达基因的总数迅速下降。其中, 在
受到枯萎病菌侵染后的 3 h (Z-3 vs. X-3), 抗病品种
相对于感病品种的差异表达基因数目为 1879个。上
调基因数目为 874个, 下调基因数目为 1005个。而
在受到枯萎病菌侵染后的 6 h (Z-6 vs. X-6), 抗病品
种相对于感病品种的差异表达基因数目为 500 个。
上调基因数目为 314个, 下调基因数目为 186个。

表 2 差异表达基因
Table 2 Number of differentially expressed genes
上调基因 Up-regulated 下调基因 Down-regulated 比对组
Contrasting
group
差异表达基因
Number of differentially
expressed genes
已知(百分比)a
Known (percentage) a
未知(百分比) a
Unknown (percentage) a
已知(百分比) a
Known (percentage) a
未知(百分比) a
Unknown (percentage) a
Z-3 vs. Z-0 4447 865(19.45%) 435(9.78%) 2209(49.67%) 938(21.09%)
Z-6 vs. Z-0 5481 1076(19.63%) 418(7.63%) 2947(53.77%) 1040(18.97%)
Z-6 vs. Z-3 2559 717(28.02%) 303(11.84%) 885(34.58%) 654(25.56%)
X-3 vs. X-0 8615 1398(16.23%) 720(8.36%) 4732(54.93%) 1765(20.49%)
X-6 vs. X-0 6727 1351(20.08%) 687(10.21%) 3633(54.01%) 1056(15.70%)
X-6 vs. X-3 2078 661(31.81%) 349(16.79%) 771(37.10%) 297(14.29%)
Z-3 vs. X-3 1879 596(31.72%) 278(14.80%) 755(40.18%) 250(13.30%)
Z-6 vs. X-6 500 188(37.60%) 126(25.20%) 153(30.60%) 33(6.60%)
a已知基因为 Gene Ontology中有注释的基因; 未知基因为 Gene Ontology中没有注释的基因。
a Known stands for genes with Gene Ontology annotation; Unknown stands for genes without annotation.

2.3 差异表达基因 GO功能分析
GO分析将 104 610个差异表达基因分为 3个功
能注释本体, 分别描述基因的生物学过程、细胞组
分和分子功能。中棉所 12比对组 Z-3 vs. Z-0、Z-6 vs.
Z-0和 Z-6 vs. Z-3分别有 15 578、21 581和 9683个,
而新陆早 7号比对组分别有 33 462、27 728和 7377
个 unigene至少含有一种功能注释。2个品种相同处
理时间的比对组 Z-3 vs. X-3和 Z-6 vs. X-6分别有
7052个和 1750个 unigene至少含有一种功能注释。
生物学过程、细胞组分和分子功能又可被进一步划
分为 48个类别(表 3), 依次为 23、14和 11个类别。
其中催化活性, 代谢过程和蛋白结合注释到的差异
表达基因最多, 分别为 12 397、12 158和 11 678个,
而翻译调控活性类别最少, 仅有 1个差异表达基因。
2.4 差异表达基因 Pathway分析
利用 KEGG数据库代谢途径对差异表达基因进
行功能注释和分类。通过 Solexa测序, 中棉所 12和
新陆早 7号比对组 Z-6 vs. Z-0和 X-6 vs. X-0鉴定出
的 Pathway最多, 均有 126条, 且名称一致, 注释到
的差异表达基因数目分别为 5313 个和 6107 个。经
对比分析, 发现其余各个比对组的 Pathway 均少于
126 条 , 且都在 126 条的基础上缺少一条或多条
Pathway。Z-6 vs. X-6的 Pathway数量最少, 仅有 89
条, 注释到的差异表达基因为 456 个; 缺少 37 条
Pathway, 涉及到脂质代谢、能量代谢、氨基酸代谢、
多糖的生物合成和代谢、碳水化合物代谢、辅助因
子和维生素的代谢、萜类化合物和多酮类化合物代
谢、次生代谢产物的生物合成以及遗传信息处理等
第 8期 韩泽刚等: 枯萎病菌诱导感、抗陆地棉品种的基因表达谱分析 1205


表 3 差异表达基因的功能分类
Table 3 Functional categorization of the differentially expressed genes
基因数量 The number of genes 功能类别
Class Z-3 vs.
Z-0
Z-6 vs.
Z-0
Z-6 vs.
Z-3
X-3 vs.
X-0
X-6 vs.
X-0
X-6 vs.
X-3
Z-3 vs.
X-3
Z-6 vs.
X-6
合计
Total
生物学过程 Biological process
代谢过程 Metabolic process 1560 2139 977 3155 2686 773 703 165 12158
细胞过程 Cellular process 1333 1822 869 2686 2273 643 578 144 10348
刺激反应 Response to stimulus 682 913 429 1244 1085 333 316 91 5093
单生物过程 Single-organism process 633 870 418 1345 1083 272 282 71 4974
定位 Localization 341 470 218 648 575 149 161 43 2605
定位建立 Establishment of localization 332 456 213 630 557 147 158 43 2536
生物调节 Biological regulation 286 407 194 610 507 126 126 33 2289
发育过程 Developmental process 232 337 170 585 471 122 127 26 2070
生物过程调控 Regulation of biological process 208 318 147 487 402 95 103 28 1788
细胞组分组织生物合成 Cellular component organization or biogenesis 176 247 124 438 340 72 82 13 1492
多细胞有机体过程 Multicellular organismal process 175 244 113 419 336 81 90 26 1484
信号相关 Signaling 170 240 116 354 304 69 75 21 1349
复制 Reproduction 115 156 85 294 227 59 77 11 1024
复制过程 Reproductive process 108 146 78 280 217 56 72 9 966
多/有机进程 Multi-organism process 61 80 41 114 104 28 32 5 465
生长 Growth 25 36 22 54 56 16 14 0 223
免疫系统过程 Immune system process 21 28 17 38 39 13 15 2 173
生物过程负调节 Negative regulation of biological process 14 29 18 46 31 11 14 0 163
生物过程正调节 Positive regulation of biological process 14 15 6 24 24 7 5 2 97
节律性过程 Rhythmic process 9 6 2 18 14 4 0 3 56
生物粘连 Biological adhesion 0 0 0 2 2 0 0 0 4
细胞死亡 Cell killing 0 1 1 0 1 1 0 0 4
运动 Locomotion 0 0 0 1 1 0 0 0 2
细胞组分 Cellular component
细胞 Cell 1395 1957 793 3236 2635 634 573 152 11375
细胞部分 Cell part 1395 1957 793 3236 2635 634 573 152 11375
细胞器 Organelle 1010 1400 555 2340 1876 459 404 108 8152
细胞膜 Membrane 647 975 444 1352 1169 287 325 77 5276
细胞器部分 Organelle part 325 491 175 890 710 168 144 40 2943
细胞膜组成 Membrane part 307 457 238 631 531 152 162 34 2512
大分子复合体 Macromolecular complex 167 296 83 752 588 81 81 28 2076
膜附着腔 Membrane-enclosed lumen 45 58 21 165 114 18 24 4 449
胞外区 Extracellular region 54 79 35 97 83 25 36 9 418
胞外区部分 Extracellular region part 5 4 4 6 6 2 5 2 34
细胞连接 Cell junction 5 6 3 6 6 2 1 1 30
胞外基质 Extracellular matrix 1 3 1 5 4 2 0 0 16
胞外基质部分 Extracellular matrix part 0 1 0 1 1 0 0 0 3
类核 Nucleoid 1 1 0 0 0 0 0 0 2
分子功能 Molecular function
催化活性 Catalytic activity 1687 2198 1053 3027 2570 863 816 183 12397
蛋白结合 Binding 1519 2028 952 3067 2528 752 658 174 11678
转运活性 Transporter activity 196 277 142 358 308 95 97 24 1497
1206 作 物 学 报 第 41卷


(续表 3)
基因数量 The number of genes 功能类别
Class Z-3 vs.
Z-0
Z-6 vs.
Z-0
Z-6 vs.
Z-3
X-3 vs.
X-0
X-6 vs.
X-0
X-6 vs.
X-3
Z-3 vs.
X-3
Z-6 vs.
X-6
合计
Total
结构分子活性 Structural molecule activity 51 96 9 314 243 13 8 3 737
分子转导活性 Molecular transducer activity 86 120 44 184 150 32 42 8 666
核酸结合转录因子活性 Nucleic acid binding transcription factor activity 95 99 37 153 115 31 24 8 562
抗氧化活性 Antioxidant activity 49 55 18 62 49 27 18 3 281
酶调节活性 Enzyme regulator activity 30 38 17 74 47 12 25 4 247
受体活性 Receptor activity 8 19 6 27 19 6 5 0 90
蛋白结合转录因子活性 Protein binding transcription factor activity 5 6 1 7 6 5 1 0 31
翻译调控活性 Translation regulator activity 0 0 1 0 0 0 0 0 1
合计 Total 15578 21581 9683 33462 27728 7377 7052 1750 124211

9个方面。Z-6 vs. Z-3的 Pathway有 120条, 注释到
的差异表达基因为 2405个; 与 126条相比缺少 6条
Pathway, 涉及到辅助因子和维生素的代谢, 氨基酸
代谢, 脂质代谢以及遗传信息处理 4个方面。X-6 vs.
X-3的 Pathway有 118条, 注释到的差异表达基因为
2282个; 与 126条相比缺少 8条 Pathway, 涉及到辅
助因子和维生素的代谢, 能量代谢, 次生代谢产物
的生物合成以及遗传信息处理。Z-3 vs. X-3 的
Pathway 有 117 条, 注释到的差异表达基因为 2034
个; 与 126条相比缺少 9条 Pathway, 涉及到辅助因
子和维生素的代谢, 次生代谢产物的生物合成以及
遗传信息处理。此外, Z-3 vs. Z-0的 Pathway有 123
条, 注释到的差异表达基因为 4060个, X-3 vs. X-0
的 Pathway 有 125 条, 注释到的差异表达基因为
7281个。
各比对组的 Pathway 总数不同, 注释到的差异
表达基因数目不同, 但是除去无法具体分类的代谢
途径 Pathway (ko01100)后, 剩余的 125 条 Pathway
均可划分为 13类别, 将它们在 6个比对组中涉及基
因占注释基因的平均百分比作图(图 2)。次生代谢产
物的生物合成涉及基因占注释基因的百分比最高 ,
平均值为 21.36%; 遗传信息处理相关基因所占比例
次之, 平均值为 15.36%; 而辅助因子和维生素的代
谢的相关基因所占比例最少, 其平均值仅为 1.73%。
除上述代谢相关基因外, 环境信息处理相关基因平
均百分比为 10.11%; 萜类化合物和多酮类化合物的
代谢相关基因平均值仅为 4.95%; 还有平均百分比
为 8.70%的基因参与环境适应和免疫系统; 而这几
类 Pathway 可作为后续研究重点, 分析这些基因在
感抗品种对枯萎病菌不同抗性表现中的作用。
2.5 植物-病原菌相互作用 Pathway分析
在环境适应和免疫系统分类中存在着植物与病
原菌相互作用 Pathway (ko04626), 并且在 Z-3 vs. Z-0;
Z-6 vs. Z-0; Z-6 vs. Z-0; X-3 vs. X-0; X-6 vs. X-0;

图 2 13类代谢通路在 6个比对组中涉及基因占注释基因的平均百分比
Fig. 2 Percentage of genes in the total annotated genes of 13 pathways in six comparison groups
图例括号中数字表示涉及基因占注释基因的平均百分比。
The number in brackets of legend stands for average percentage of genes against the total annotated genes.
第 8期 韩泽刚等: 枯萎病菌诱导感、抗陆地棉品种的基因表达谱分析 1207


X-6 vs. X-3; Z-3 vs. X-3以及 Z-6 vs. X-6比对组中分
别涉及到 232、290、159、421、323、133、113 和
34个差异表达基因(含重复), 去除未知、预测及未命
名基因后统计汇总(表 4)表明, 该 Pathway 中的 996
个差异表达基因有 444个基因上调表达, 552个基因
下调表达; 共涉及到 61 类差异表达基因, 其中差异
表达基因最多的是WRKY转录因子家族基因, 共有
162个(79个上调表达, 83个下调表达), 所占比例为
16.3%; 其次为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因 , 共有
82 个(38 个上调表达, 44 个下调表达), 所占比例为
8.2%; 而 DNA损伤修复/耐受性蛋白, JAZ1、RAR1、
RPM1互作蛋白, S位点的特异性糖蛋白 S6前体以及
钙牵引蛋白等 6类基因参与该 Pathway的数目最少,
分别只有 1 个, 所占比例仅为 0.1%。此外, 值得注
意的是 , 在这些差异表达基因中有 38个与 NBS-
LRR类抗病蛋白相关, 25个与 bHLH转录因子相关,
22个与 bZIP转录因子相关, 22个与抗病相关蛋白相
关, 7个与抗黄萎病蛋白相关。

表 4 植物–病原菌相互作用 Pathway中涉及的差异表达基因
Table 4 Differentially expressed genes of plant–pathogen interaction Pathway
上调 Up regulation 下调 Down regulation 基因名称
Gene name 数目
Number
log2 Ratio平均值
Mean of log2 Ratio
数目
Number
log2 Ratio平均值
Mean of log2 Ratio
总数
Total
WRKY转录因子 WRKY transcription factor 79 2.29 83 –2.56 162
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 Serine/threonine protein kinase 38 2.32 44 –3.62 82
钙结合蛋白 Calcium binding protein 43 2.31 23 –2.83 66
LRR受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶
LRR receptor serine/threonine protein kinase
30 2.31
17
–3.09 47
ATP 结合蛋白 ATP binding protein 14 2.02 29 –3.05 43
富含亮氨酸重复蛋白 Leucine rich repeat protein 16 1.93 23 –3.42 39
有丝分裂活化蛋白激酶 Mitogen activated protein kinase 12 2.05 27 –2.63 39
NBS-LRR类抗病蛋白 NBS-LRR resistance protein 9 2.71 29 –3.10 38
蛋白激酶 Kinase 26 2.36 12 –1.98 38
钙依赖型蛋白激酶 Calcium dependent protein kinase 19 1.64 13 –2.15 32
油菜素甾醇不敏感型 1相关受体激酶前体
Brassinosteroid insensitive 1 associated receptor kinase precursor
14 3.40
13
–4.25 27
bHLH转录因子 bHLH transcription factor 3 1.56 22 –2.46 25
热激蛋白 Heat shock protein 14 2.95 11 –1.75 25
调钙蛋白 Calmodulin 17 2.52 8 –1.68 25
bZIP转录因子 bZIP transcription factor 11 2.77 11 –2.54 22
抗病相关蛋白 Disease resistance protein 8 2.78 14 –2.46 22
受体蛋白激酶 Receptor kinase 10 2.25 11 –2.89 21
呼吸爆发氧化酶 Respiratory burst oxidase 9 2.49 6 –4.32 15
OCS元件结合因子 Ocs element binding factor 13 1.81 1 –1.88 14
钾离子通道蛋白 Potassium channel 4 2.13 10 –2.20 14
铁螯合还原酶 Ferric chelate reductase 0 0.00 14 –5.65 14
TIFY蛋白 TIFY protein 7 3.26 6 –2.85 13
受体丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶 Receptor serine-threonine protein kinase 3 1.64 10 –2.08 13
呼吸爆发氧化酶同源蛋白 Respiratory burst oxidase homolog protein 4 2.29 8 –1.76 12
LRR受体蛋白激酶 LRR receptor protein kinase 0 0.00 11 –5.88 11
DNA结合蛋白 DNA binding protein 1 1.21 8 –2.96 9
环核苷酸门控离子通道 Cyclic nucleotide-gated ion channel 0 0.00 9 –1.70 9
LRR类受体蛋白激酶 EXS前体
LRR receptor protein kinase EXS precursor
0 0.00
8
–3.60 8
多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 Polygalacturonase-inhibiting protein 5 1.91 3 –7.52 8
抗黄萎病蛋白 Verticillium wilt resistance protein 4 3.45 3 –4.93 7
1208 作 物 学 报 第 41卷


(续表 4)
上调 Up regulation 下调 Down regulation 基因名称
Gene name 数目
Number
log2 Ratio平均值
Mean of log2 Ratio
数目
Number
log2 Ratio平均值
Mean of log2 Ratio
总数
Total
壁相关受体蛋白激酶 Wall associated receptor kinase 5 3.61 1 –1.27 6
GbVe 3 1.53 2 –2.28 5
SGT1同源蛋白 SGT1 homolog protein 0 0.00 5 –1.45 5
SRF蛋白 SRF protein 0 0.00 5 –4.83 5
富含半胱氨酸受体蛋白激酶 Cysteine rich receptor like protein kinase 4 1.52 1 –1.27 5
bmk蛋白激酶 Big map kinase/bmk 3 1.87 1 –1.50 4
丙三醇激酶同工酶 Glycerol kinase isoform 0 0.00 4 –1.41 4
受体蛋白 Receptor protein 1 1.50 3 –1.83 4
体细胞胚胎发育受体蛋白激酶 Somatic embryogenesis receptor kinase 2 1.53 2 –2.12 4
细胞附着蛋白 Cytohesin 0 0.00 4 –1.28 4
型态形成蛋白 Pattern formation protein 0 0.00 4 –1.38 4
油菜素甾醇 LRR受体激酶前体
Brassinosteroid LRR receptor kinase precursor
0 0.00 4 –3.03 4
C型凝集素受体样酪氨酸蛋白激酶
C-type lectin receptor-like tyrosine protein kinase
0 0.00 3 –2.67 3
GHDEL61 0 0.00 3 –5.58 3
LysM结构域蛋白前体 LysM domain protein precursor 3 2.54 0 0.00 3
壁相关蛋白激酶 Wall associated kinase 0 0.00 3 –1.72 3
蛋白结合蛋白 Protein binding protein 0 0.00 3 –4.96 3
蛋白磷酸酶 Phosphoprotein phosphatase 0 0.00 3 –2.22 3
富含脯氨酸受体蛋白激酶 Proline rich receptor protein kinase 2 1.18 1 –1.49 3
硝酸盐诱导蛋白 Nitrate induced NOI protein 1 2.25 2 –2.90 3
叶绿体茉莉酸 ZIM结构域蛋白 Plastid jasmonates ZIM-domain protein 2 1.24 1 –1.27 3
诱导响应蛋白 Elicitor responsive protein 2 2.51 1 –1.91 3
L型凝集素结构域的受体激酶
L-type lectin domain containing receptor kinase
0 0.00 2 –1.47 2
酪氨酸蛋白激酶 Tyrosine protein kinase 0 0.00 2 –2.27 2
油菜素甾醇不敏感型 1前体 Brassinosteroid insensitive 1 precursor 1 2.64 1 –1.47 2
DNA损伤修复/耐受性蛋白 DNA damage-repair/toleration protein 0 0.00 1 –4.40 1
JAZ1 1 1.44 0 0.00 1
RAR1 0 0.00 1 –1.18 1
RPM1互作蛋白 RPM1 interacting protein 1 1.05 0 0.00 1
S位点的特异性糖蛋白 S6前体
S locus specific glycoprotein S6 precursor
0 0.00 1 –3.39 1
钙牵引蛋白 Caltractin 0 0.00 1 –1.29 1
合计 Total 444 552 996

2.6 实时荧光定量 PCR验证分析
以中棉所 12和新陆早 7号的在枯萎病菌侵染后
3 h和 6 h的 4个 cDNA作为样本, 从 Solexa测序中
随机挑选的 3 个上调和 3 个下调的差异表达基因进
行实时荧光定量 PCR检测。并根据所得数据以 2为
底的对数值进行标准化处理后。结果如图 3所示, 黑
色柱形图为 Solexa 测序数据结果, 白色柱形图为实
时荧光定量 PCR验证数据结果。可以看出, 这 6 个
基因相对表达量与 Solexa 测序的结果趋势是相同的,
说明基因表达谱测序获得的信息具有较高的可靠性。
3 讨论
近年来, Solexa 测序技术的迅猛发展给生物基
因组学的研究带来了深刻的影响, 为从整体水平研
第 8期 韩泽刚等: 枯萎病菌诱导感、抗陆地棉品种的基因表达谱分析 1209



图 3 Solexa测序和 Real-time PCR的表达量比对
Fig. 3 Validation of Solexa sequencing data by Real-time PCR
1: Gorai.005G258100.1; 2: Gorai.004G241400.1;
3: Gorai.013G220800.1; 4: Gorai.007G008500.1;
5: Gorai.009G396600.1; 6: Gorai.009G038900.1.

究作物的基因表达变化, 阐明作物对病原菌的抗性
机制提供了有力的技术支持。本试验利用 Solexa高
通量测序技术建立了高抗枯萎病品种中棉所12和高
感枯萎病品种新陆早7号在枯萎病菌侵染后3 h和6 h
的棉花根部表达谱, 在受到枯萎病菌诱导后, 探索
感病品种和抗病品种在转录组水平上的差异。尽管
中棉所12和新陆早7号在遗传背景上存在着区别 ,
但在缺少近等基因系的情况下, 选用2个对枯萎病抗
性存在明显差异的陆地棉品种作为研究材料, 利用
Solexa 测序技术研究不同侵染时间后基因的表达谱
差异, 对进一步阐明棉花与枯萎病互作的分子调控
机制仍具有指导意义。
通过对感抗品种差异表达基因分析表明, 与对
照相比, 2个品种在枯萎病菌侵染后3 h和6 h, 许多
基因的表达量发生改变; 其中下调基因的数目明显
多于上调基因。这一结果与王刚等的研究类似[20-22]。
此外, 感抗品种在枯萎病菌侵染后相同时间, 其差
异表达基因中下调基因仍多于上调基因, 但差异表
达基因总数迅速下降。这些差异表达基因是否与这2
个品种对于枯萎病表现出不同抗性有关仍需要后续
试验验证。另外, 在差异表达基因中有一部分是没
有功能注释、没有报道的基因, 推测可能是棉花全
基因组测序未完成, 可供参考的数据信息比较有限,
加之很多数据信息来自于棉花纤维发育, 抗病相关
信息还非常缺乏, 但它们的重要性不可忽略。
通过 GO 功能分析发现 6 个比对组中的差异表
达基因在 3个注释本体中所占的比例大致相同, 即
分子功能约占 20%, 生物学过程约占 40%, 细胞组
分则约占 30%。同时大部分基因富集在分子功能本
体中的蛋白结合和催化活性 , 细胞组分中的的细
胞、细胞部分、细胞器上, 并主要参与细胞过程和
代谢过程等生物学过程; 这与陈欢等[21]关于大豆籽
粒不同发育时期表达谱研究的结果类似。仅从分子
功能的转录因子活性类别中就找到了许多目前已证
实与抗病相关的 bZIP 类、WRKY 类、AP2/EREBP
类、NAC类等以及研究不多的 homeodomain和 HSF
等转录因子调控的基因[23], 这为后续抗病相关基因
的挖掘工作指明方向。
Pathway 中可以找到许多已证实与抗病相关的
萜类、黄酮类, 生物碱类等小分子化合物的合成[24]。
如萜类骨干生物合成 (ko00900), 单萜的生物合成
(ko00902), 倍半萜类和三萜类生物合成 (ko00909),
黄酮类的生物合成(ko00941、ko00944 等)以及多种
生物碱的合成(ko00950、ko00960等)。此外, 已有研
究表明, 植物内源激素在植物受到生物胁迫和非生
物胁迫时发挥重要作用, 多种植物激素曾被报道参
与调控植物对病原菌的抗性[25-26], 而环境信息处理
中恰好存在植物激素信号转导 Pathway (ko04075),
其涉及到的差异表达基因也具有重要的研究意义。
在植物与病原菌相互作用 Pathway中涉及到996
个已知功能的差异表达基因, 其中 WRKY、bHLH
及 bZIP 三类转录因子家族分别有162、25和22个差
异表达基因参与, 而已经证实它们与植物的抗病反
应有关, 其可以与相应基因启动子中的顺式作用元
件发生 DNA-蛋白的特异性互作, 从而激活防卫反
应基因的转录表达[23]。另有82个丝氨酸/苏氨酸蛋白
激酶基因, 47个 LRR受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基
因, 38个蛋白激酶基因, 38个 NBS-LRR类抗病蛋白,
13个受体丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因, 11个 LRR受
体蛋白激酶基因以及3个蛋白磷酸酶基因参与该
Pathway。大量研究表明, 蛋白激酶和蛋白磷酸酶对
植物-病原菌互作反应起调节作用, 并且与抗病基因
也存在联系[27]。Song等[28]曾克隆水稻抗白叶枯病基
因 Xa21, 其结构与拟南芥中的受体蛋白激酶类似,
属于丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶家族。蛋白质序列分析
表明在其氨基端含有 LRR区(leucine-rich region), 参
与蛋白质相互作用, 表明 LRR蛋白与蛋白激酶可以
在植物抗病信号传递过程中相互作用, 参与植物的
抗病反应[29]。还有22个与抗病相关蛋白基因, 7个抗
黄萎病蛋白基因, 上述结果表明植物与病原菌相互
作用 Pathway 中涉及到的差异表达基因具有重要的
研究意义, 除重点研究单个基因对棉花枯萎病抗性
的功能外, 更应该分析多个基因之间的相互作用以
深入了解植物的抗病机制。同时剩余的大量未知、
未命名基因也可作为后续研究的重点。
1210 作 物 学 报 第 41卷


实时荧光定量 PCR检测 Solexa测序后 6个基因
的相对表达量, 发现二者上调或者下调的趋势是相
同的, 但其结果并不完全一致, 主要由 2个技术在检
测灵敏性上的差异造成[30], 依然可说明 Solexa 测序
获得的结果具有较高的可靠性。
本研究利用 Solexa高通量测序技术对枯萎病菌
侵染早期不同时间、不同感抗品种的基因的表达变
化进行了全面、深入的检测, 无论是差异基因的筛
选, GO功能分析以及 Pathway分析等都表明感抗枯
萎病品种在枯萎病菌诱导后抗性机制有差别, 而大
量的差异表达基因也为筛选抗枯萎病相关基因提供
丰富的数据资源, 为进一步研究棉花抗枯萎病的分
子调控机制奠定了基础。
4 结论
选用中棉所 12和新陆早 7号, 利用 Solexa高通
量测序技术分析棉花幼苗受到枯萎病菌侵染后 3 h
和 6 h 根部组织的基因表达谱, 从中筛选出大量差
异表达基因。已注释的差异表达基因依据功能, 可
划分为生物学过程、细胞组分和分子功能 3 个功能
注释本体, 进一步细分为 48个功能类别。代谢通路
分析鉴定出从 89 条到 126 条不等的 Pathway, 涉及
到的基因可以划分为次生代谢产物的生物合成, 多
糖的生物合成和代谢 , 环境适应和免疫系统等 13
类。996个已知功能的差异表达基因参与植物与病原
菌相互作用 Pathway, 涉及差异表达基因最多的是
WRKY 转录因子家族基因, 其次为丝氨酸/苏氨酸
蛋白激酶基因 ; 而 DNA 损伤修复 /耐受性蛋白、
JAZ1 及钙牵引蛋白等 6 类基因参与该 Pathway 的
数目最少。
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