全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(6): 881888 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31101190)和中国科学院“国际人才计划”项目(2015VEB069)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 郭志鸿, E-mail: guozhhong@hotmail.com
第一作者联系方式: E-mail: renqin12@mails.ucas.ac.cn
Received(收稿日期): 2015-01-07; Accepted(接受日期): 2015-03-19; Published online(网络出版日期): 2015-03-30.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150330.1618.006.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00881
植物介导的 RNA干扰引起马铃薯晚疫病菌基因的沉默
任 琴 1 王亚军 1 郭志鸿 1,* 李继平 2 谢忠奎 1 王若愚 1 王 立 2
惠娜娜 2
1中国科学院寒区旱区环境与工程研究所, 甘肃兰州 730000; 2甘肃省农业科学院, 甘肃兰州 730070
摘 要: 由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的晚疫病是最具毁灭性的马铃薯病害。为明确植物介导的 RNAi 沉
默致病疫霉基因的有效性, 本研究采用重叠延伸 PCR技术克隆同时与晚疫病菌 4个 ces基因均同源的融合基因 C1234,
构建内含子连接的 C1234反向重复序列植物表达载体, 采用农杆菌介导法转化晚疫病易感马铃薯品种大西洋, 经 PCR
和 Southern杂交检测, 获得 129个转基因株系。离体叶片接种病原菌后, 有 97个转基因株系发病速度明显慢于野生
型, 接种 6 d后病斑大小和霉层厚度均明显小于对照, 并且叶片感病部位没有出现失绿斑, 而野生型产生了明显的失
绿斑。实时定量 RT-PCR分析发现, 发病延缓的叶片上致病疫霉 4个纤维素合酶基因的表达水平明显低于野生型。本研
究表明, 转基因植株中产生的以晚疫病菌 ces基因为靶标的 dsRNA能够沉默致病疫霉相应基因表达, 延缓发病进程。
关键词: 植物介导的 RNAi; 马铃薯; 致病疫霉; 基因沉默
Gene Silence of Phytophthora infestans Induced by Plant-mediated RNA Inter-
ference in Potato
REN Qin1, WANG Ya-Jun1, GUO Zhi-Hong1,*, LI Ji-Ping2, XIE Zhong-Kui1, WANG Ruo-Yu1, WANG Li2,
and HUI Na-Na2
1 Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China; 2 Gansu
Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070, China
Abstract: Potato late blight caused by Phytophthora infestans is the most devastating disease in potato. The objective of this
study was to test the efficiency of plant-meidated RNAi in silencing genes in P. infestans and to find a new way to breed potato
resistant to late blight. Over-lap PCR was employed to amplify a fused-gene C1234 simultaneously homologous to four cellulose
synthase genes in P. infenstans. Then, a plant expression vector containing inverted repeat of C1234 was constructed and transferred
to Atlantic, a potato variety severely susceptible to late blight by agrobacteria-mediated genetic transformation. A hundred and
twenty nine regenerated lines were confirmed to be transgenic plants with PCR and Southern blot. When detached leaves were
inoculated with P. infestans, 97 out of 129 transgenic lines delayed disease symptoms with smaller lesions and less hyphae com-
pared to the wild type at six days after inoculation. Chlorotic spots did not appeared on leaves from transgenic lines while deve-
loped severely on leaves from the wild type at the same day. mRNA accumulation of the four cellulose synthase genes from P.
infestans colonized on leaves from transgenic plants with delayed symptoms was significantly lower compared to the wild type
with Real-time RT-PCR. The results demonstrated that dsRNA of C1234 generated in transgenic potato could induce homologous
genes silence and delay the process of infection in intimately touched P. infestans.
Keywords: Plant-mediated RNAi; Potato; Phytophthora infestans; Gene silence
致病疫霉 [Phytophthora infestans (Mont.) de
Bary]引起的晚疫病是马铃薯最具毁灭性的病害, 其
防治难度远超水稻稻瘟病和小麦锈病, 是当前世界
农业生产中危害最为严重的病害之一。晚疫病的发
生和流行给马铃薯生产造成巨大损失, 并严重威胁
着世界农业生产及粮食安全[1]。目前, 应对马铃薯晚
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疫病的策略主要有改进栽培措施、化学控制和使用
抗病品种 3 种途径。栽培措施的改进对晚疫病发生
和流行的影响十分有限, 而化学控制在一定程度上
可以减轻致病疫霉的危害, 但费用极高, 并且使用
的往往是一些非环境友好型农药, 造成巨大的生态
风险[1]。使用抗病品种被实践证明是最为经济有效
的马铃薯晚疫病控制途径。但由于致病疫霉具有极
强的进化潜力[2-3], 在不到 5 年时间里相继克服了作
为马铃薯抗晚疫病育种主要抗性来源的 11个R基因
和多个新近开发、并被育种家寄予厚望的持久抗性
基因[4-6]。随着致病疫霉 A2 交配型的出现及 A2 与
A1 交配型间有性繁殖的发生使得致病疫霉的变异
速度更快、毒力变化更加复杂, 成为名副其实的抗
性基因“摧毁者”, 导致马铃薯抗晚疫病育种举步维
艰[3-4]。针对这一现状, 有学者提出了利用抗病基因
多样性持久防治晚疫病的策略[7]。尽管这一策略在
水稻病害控制中得到成功应用[8-9], 但马铃薯抗病基
因多样化的实现需要导入大量的抗性基因, 以构建
晚疫病抗性基因近等混合系。这是一个漫长的过程,
目前开发的马铃薯晚疫病抗病基因资源仍然十分有
限, 使得该策略短期内难以应用于抗晚疫病育种实
践。所以, 探索新的更有效的马铃薯抗晚疫病育种
策略显得尤为重要。
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种双链
RNA(double-stranded, dsRNA)介导的序列特异的基
因沉默技术, 能够高频、高效、高度特异地引起与
dsRNA 同源的基因的沉默[10], 并且 RNAi 信号可以
在密切接触的物种间相互转移[11]。该技术已在增强
植物抵抗病毒[12-13]、细菌[14]、真菌[15-17]、杂草[18]及
虫害[19-21]研究中得到成功应用, 但在增强植物对卵
菌抗性的研究方面尚无成功报道。本研究拟克隆同
时与致病疫霉 4 个纤维素合酶基因同源的融合片段
C1234, 转化 ihpRNA 载体至易感马铃薯品种大西洋,
观察检测转基因植株叶片接种病原菌后的发病情况,
以期探索植物介导的 RNAi 能否干扰致病疫霉基因
的表达。
1 材料与方法
1.1 试验材料
马铃薯(Solanum tuberosum L.)品种大西洋脱毒
试管苗由甘肃农业大学张金文教授提供, 致病疫霉
由甘肃省农业科学院植物保护研究所分离 , 载体
pHANNIBAL 和 pART27 由澳大利亚 Peter M
Waterhouse 博士惠赠[12], 大肠杆菌 DH5α、农杆菌
LBA4404 由本实验室保存, 植物 RNA 提取试剂盒
Concert Plant RNA Reagent和反转录试剂盒购自 Life
Tech 公司 , 克隆载体 pGEM-T easy vector 购自
Promega公司, 限制性内切酶、T4 DNA连接酶和高
保真 DNA聚合酶购自 TaKaRa, DNA Marker、凝胶
回收试剂盒购自 TIANGEN 公司 , 尼龙膜 (nylon
membrane, positive geladen)和 Southern blot探针标
记及检测系统均购自 Roche 公司。其他试剂均为国
产分析纯。
1.2 靶标基因融合片段克隆
根据 GenBank中公布的致病疫霉纤维合成酶编
码基因 ces1 (GenBank 登录号为 EF563993)、ces2
(GenBank登录号为 EF563994)、ces3 (GenBank登录
号 为 EF563995) 和 ces4 (GenBank 登 录 号 为
EF563996)碱基序列, 采用生物学软件 Oligo 6 设计
重叠延伸 PCR 引物, 为方便后续载体构建, 在 ces1
干扰片段上游引物和 ces4干扰片段下游引物 5段分
别引入酶切位点(表 1)。然后, 参照 Goodwin 等[22],
采用 CTAB法提取晚疫病菌基因组 DNA, 以其为模
板采用重叠延伸 PCR技术扩增 4个干扰片段及融合
基因。具体操作流程为: 分别配置以 1u和 1l2u、2u1l
和 2l3u为引物对的 PCR反应液, 先进行 5个循环的
扩增, 然后将 2 种反应液等体积混合后继续扩增 25
个循环, 琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的条带, 得
到 ces1 和 ces2 基因干扰片段的融合基因 C12; 分别
以 3u2l和 3l4u、4u3l和 4l为引物采用同样方法得到
ces3和 ces4基因干扰片段的融合基因 C34。最后, 以
等量的C12和C34为模板, 以 1u和 4l为引物进行 PCR,
琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物, 切胶回收目的条带
C1234。将 C1234与 pGEM-T easy vector连接, 连接产
物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 得到含有 4个纤
维素合成酶基因干扰片段融合基因的重组质粒
pTC1234, 送交基因测序公司进行序列分析。
1.3 融合基因 ihpRNA载体构建
先用限制性内切酶 Xho I/ EcoR I消化 pTC1234,
琼脂糖凝胶电泳后回收小片段(C1234), 与经同样酶
切并回收的载体 pHANNIBAL 连接, 转化大肠杆菌
DH5α, 得到重组质粒 pHCS; 再用 Xba I/ Hind III消
化 pTC1234 并回收小片段(C1234), 与经同样酶切的
pHCS 载体相连 , 得到中间载体 pHIVC; 最后 , 用
Not I消化 pHIVC, 回收大片段, 与经同样酶切并回
收的 pART27 载体相连, 得到具有融合基因 C1234反
向重复序列的植物表达载体 pRNAiC。
第 6期 任 琴等: 植物介导的 RNA干扰引起马铃薯晚疫病菌基因的沉默 883


表 1 重叠延伸 PCR扩增引物
Table 1 Primers of over-lap PCR
编号
Code
引物序列
Primer sequence (5–3)
扩增产物长度
Length of amplified product (bp)
1u tctagactcgagAGTCTGGTGATCTACGGCAAGAA
1l2u GCACCTGACCAGTGTAGCAATCTCATGTCCGAGTCCAGTAGGAGC
323
2u1l GCTCCTACTGGACTCGGACATGAGATTGCTACACTGGTCAGGTGC
2l3u GTCTCGGGCTTCATACGTCCAGGATAGCCGTGATCGAGCC
328
3u2l GGCTCGATCACGGCTATCCTGGACGTATGAAGCCCGAGAC
3l4u CAGACTCGGGCACAGCACGTACCGTAGCAGATTCCACCAA
420
4u3l TTGGTGGAATCTGCTACGGTACGTGCTGTGCCCGAGTCTG
4l aagcttgaattcGTAGTTCCATGATGCTGTTGCC
513
引物序列中下画线部分为酶切位点。The sequences underlined are restriction sites.

1.4 马铃薯遗传转化及植株再生
采用直接导入法 [23]将 pRNAiC 导入农杆菌
LBA4404, 获得用于进行马铃薯遗传转化的工程菌,
以大西洋试管苗叶片为受体材料参照Gustafson等[24]
进行转化。当获得的 Kan 抗性苗长到 2 cm左右时,
将其切下转入附加 80 mg L–1 Kan的MS培养基进行
生根筛选。
1.5 再生株系的 Southern杂交
采用 CTAB 法 [25]提取能在生根培养基上形成
完整根系、生长旺盛的转化再生苗叶片基因组
DNA。以提取的基因组 DNA 为模板, 1u 为正向引
物、4l为反向引物进行 PCR扩增, 筛选转基因株系,
然后在对 PCR 检测呈阳性的株系进行 Southern 杂
交, 亦即将 PCR 检测呈阳性的植株基因组 DNA 经
Not I 过夜消化后用 0.8%的琼脂糖凝胶分离, 再用
20×SSC 转移到尼龙膜, 80℃固定 2 h 后与探针杂
交。探针制备以纯化的 C1234为模板, 采用随机引物
标记法标记 , 杂交及检测的其他步骤均按照 DIG
High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I
所述方法进行。
1.6 转基因植株晚疫病抗性鉴定
转基因植株移栽后 50 d左右鉴定抗病性。参照
Grenville-Briggs 等[26]方法接种, 采用悬浮液滴接种
法接种离体叶片 , 接种 3 d 后统计病斑生长速率
(lesion growth rate, 简称 LGR)。即测量接种点的病斑
大小, 连测 4 d。测量每个病斑最长和最宽处(两者成直
角), 其面积 A = 1/4×π×长×宽, 根据病斑面积, 将病斑
划为成功与非成功侵染 2 种情况。如果病斑大小局限
于接种点内, 即 0果病斑面积在几次测量中都小于接种点面积, 则视为
过敏性反应; 如果病斑面积有一次超过 16 mm2, 即被
视为成功侵染, 对成功侵染的病斑, 根据其面积计算
病斑的平均半径, 以时间(d)为横坐标, 以病斑平均半
径为纵坐标, 通过线性回归, 估计 LGR[27]。
1.7 转基因植株纤维素合成酶基因表达分析
随机选取 3 株转基因植株进行实时 RT-PCR 分
析纤维素合成酶基因 ces1、ces2、ces3 和 ces4 基因
mRNA积累水平, 实时 RT-PCR采用 SYBR Green I
法[Premix Ex Taq (Perfect Real Time)试剂盒], 引物
序列、分析方法参照 Grenville-Briggs等[28]。
2 结果与分析
2.1 融合基因 C1234克隆
以马铃薯晚疫病菌基因组 DNA 为模板, 以 1u
和 1l2u、2u1l 和 2l3u 为引物对进行重叠延伸 PCR
扩增后电泳分析, 在 650 bp 左右处出现条带(图 1,
泳道 1), 大小与 ces1和 ces2干扰片段之和相符, 初
步说明成功扩增了 ces1和 ces2干扰片段的融合基因
C12; 以 3u2l 和 3l4u、4u3l 和 4l 为引物对扩增后在
940 bp 左右处出现电泳条带(图 1, 泳道 2), 与 ces3
和 ces4 干扰片段之和相符, 初步说明成功扩增了
ces3和 ces4干扰片段的融合基因 C34; 以等量 C12和
C34为模板, 1u和 4l为引物扩展后在 1600 bp左右处
出现电泳条带(图 2, 泳道 1和泳道 2), 初步说明成功
扩增了 ces1、ces2、ces3 和 ces4 干扰片段融合基因
C1234。将 C1234与克隆载体 pGEM-T easy vector连接
后分析碱基序列表明, 组成融合基因的 4个片段碱
基序列与 GenBank 中公布的相应序列完全相符, 说
明获得了含有同时以 4 个致病疫霉 ces 为靶标的干
扰片段的载体 pTC1234。
884 作 物 学 报 第 41卷



图 1 C12和 C34的重叠延伸 PCR扩增结果
Fig. 1 Results of over-lap PCR amplification for C12 and C34
M: trans2K Plus II DNA marker; 1: C12重叠延伸 PCR扩增产物;
2: C34重叠延伸 PCR扩增产物。
M: trans2K plus II DNA marker; 1: over-lap PCR for C12;
2: over-lap PCR for C34.

图 2 C1234重叠延伸 PCR扩增
Fig. 2 Results of over-lap PCR amplification for C1234
M: trans2K plus II DNA marker; 1~2: C1234重叠延伸 PCR扩增
产物。
M: trans2K plus II DNA marker; 1: over-lap PCR for C1234.

图 3 pRNAiC酶切分析
Fig. 3 Restriction analysis of pRNAiC
M: trans2KTM plus II DNA marker; 1: Xba I/ Hind III酶切;
2: Xho I/ EcoR I酶切; 3: Not I/ Xho I酶切; 4: Not I酶切。
M: trans2K plus II DNA marker; 1: Xba I/ Hind III digestion; 2: Xho I/
EcoR I digestion; 3: Not I/ Xho I digestion; 4: Not I digestion.
2.2 以 4个 ces基因为靶标的 RNAi载体构建
根据构建的 pRNAiC载体上 C1234反向重复序列
表达框架的限制性酶切位点分布特点对其进行酶切
分析, 经 Xba I/ Hind III消化后, 在 1600 bp处出现
特异条带(图 3, 泳道 1), 说明 C1234反向插入 pdk 内
含子和 OCS终止子之间。经 Xho I/ EcoR I消化后分
别在 1600 bp 和 740 bp 左右处出现特异条带(图 3,
泳道 2), 分别与 C1234和 pdk 内含子的大小相符, 并
且 1600 bp处条带亮度是相邻泳道 1600 bp处条带的
2倍左右, 说明经该内切酶组合消化, 既切下了正向
的 C1234, 也切下了反向的的 C1234, 也说明 pdk 内含
子两端分别连接了正向和反向的 C1234。经 Not I/ Xho
I消化, 分别在 4000、1300和 740 bp左右处出现特
异条带(图 3, 泳道 3), 其大小与“C1234+pdk 内含子+
反向 C1234”、CaMV 35S 启动子和 OCS 终止子大小
相符, 进一步说明 C1234以正确的方向分别插入到了
pdk内含子的上游和下游, 构建了以 CaMV 35S为启
动子、OCS为终止子的内含子连接的 C1234反向重复
序列表达框架。经 Not I消化, 在 6000 bp左右处出
现特异条带(图 3, 泳道 4), 其大小与“CaMV 35S+
C1234+pdk 内含子+反向 C1234+OCS 终止子”相符, 进
一步说明成功构建了 pdk内含子连接的 C1234反向重
复序列表达框架 , 并插入到了植物表达载体
pART27的 Not I位点之间。C1234反向重复序列表达
框架结构如图 4所示。
2.3 转化株系的获得及 Southern blot检测
转化大西洋叶片, 获得 278株 Kan抗性再生苗。
将抗性再生苗转接到含 Kan 的生根筛选培养基上,
有 166株形成了完整根系。对这 166株植株进行 PCR
鉴定, 其中有 129株在 1600 bp左右处出现特异条带,
而作为阴性对照的非转化植株则未出现相应条带
(图 5), 说明融合基因 C1234 反向重复序列整合到受
体品种基因组中, 进一步对部分 PCR 检测呈阳性的
植株的 Southern杂交发现, 基因组 DNA经 Not I消
化后杂交, 所有株系均在相同大小处出现杂交条带,
由于植物表达载体 pHIVC左右边界内 2个 Not I位
点之间是 C1234反向重复序列表达框架和Kan抗性标
记基因表达框架, Southern 杂交均出现大小一致的
条带, 说明 C1234反向重复序列表达框架和 Kan抗性

图 4 pRNAiC表达框架示意图
Fig. 4 Structure map of pRNAiC expressing framework
第 6期 任 琴等: 植物介导的 RNA干扰引起马铃薯晚疫病菌基因的沉默 885


标记基因表达框架均整合到了马铃薯基因组中, 获
得了转基因植株, 也进一步说明 Kan 抗性生根筛选
具有较强可靠性。

图 5 再生植株 PCR检测
Fig. 5 PCR analysis of regenerated plants
M: trans2K plus II DNA marker; 1: 阳性对照; 2~7: 再生植株;
8: 阴性对照。
M: trans2K plus II DNA marker; 1: positive control;
2–7: regenerated plants; 8: negative control.

图 6 转基因马铃薯株系 Southern杂交
Fig. 6 Southern blotting of the transgenic lines
1~6: PCR检测为阳性的转基因植株; 7: 非转基因植株。
1–6: transgenic lines detected by PCR; 7: non-transgenic plant.

2.4 转基因植株晚疫病抗性鉴定
离体叶片接种致病疫霉后, 从第4天开始逐渐在
叶片的接种部位及附近出现白色菌丝, 随着时间延
长, 产生大量菌丝体, 并且病斑范围不断扩大, 形成
不规则的覆盖白色霉层的病斑; 从第5天开始, 叶片
的病斑部位及其周围逐渐失绿。与非转基因的野生型
对照相比, 转基因植株中有97个株系发病速度明显
慢, 占总转基因株系75.2%, 病斑生长速率显著小于
野生型对照(图7)。发病过程中, 菌斑明显小于对照,
霉层也明显比对照薄(图8), 并且失绿斑比对照晚出
现2 d以上。说明转基因植株中形成的同时与致病疫
霉 ces1、ces2、ces3和 ces4基因同源的 dsRNA诱导了
晚疫病菌相应基因表达的下调, 延缓了发病进程。

图 7 马铃薯部分转基因株系的抗病性鉴定
Fig. 7 Resistant determination against late blight of transgenic
potato clones
不同的小写字母表示转基因系与对照间在 0.05的水平上达极显
著差异。
Different letters above the curve mean significant difference for
lesion growth rate at the 0.05 probability level between transgenic
lines and CK.

2.5 转基因植株纤维素合成酶基因表达水平分析
从 97个发病延缓的转基因株系中选取 3个独立
株系采用实时 RT-PCR 分析纤维素合酶基因 ces1、
ces2、ces3和 ces4的 mRNA积累水平(图 9), 发现侵
染这 3 个转基因株系的晚疫病菌相应基因的 mRNA
积累水平显著低于对照, 其中, 侵染 Line 8 的 ces3
基因mRNA表达量下调最显著, 侵染Line 30的致病
疫霉 ces1和 ces3基因mRNA表达量也显著下调, 侵
染 Line 31的 ces2和 ces4基因的 mRNA表达量也下
调明显, 并且不同的转基因株系同一基因的 mRNA
下调幅度水平不同 , 同一株转基因株系不同基因
mRNA下调幅度水平也不完全一样。

图 8 离体叶片接种致病疫霉 6 d后病斑和失绿斑
Fig. 8 Lesions and chlorotic spots on detached leaves six days after P. infestans inoculation
A: 转基因株系; B: 野生型。A: transgenic lines; B: wild type.
886 作 物 学 报 第 41卷



图 9 转基因株系纤维素合酶基因表达水平分析
Fig. 9 Expression levels of cellulose synthase genes in transgenic lines
A: ces1基因表达水平分析; B: ces2基因表达水平分析; C: ces3基因表达水平分析; D: ces4基因表达水平分析。不同的小写字母表示转
基因系与对照间在 0.05的水平上达极显著差异。
A: expression levels of ces1; B: expression levels of ces2; C: expression levels of ces3; D: expression levels of ces4. Bars subscripted by
different letters are significantly different at the 0.05 probability level between transgenic lines and CK.

3 讨论
3.1 马铃薯介导的 RNAi沉默致病疫霉基因表达
的有效性
植物介导的有害真核生物 RNAi 是通过在植物
中形成 dsRNA或 siRNA等RNAi信号分子, 经寄生、
取食等途径传递到有害真核生物中, 激发入侵有害
真核生物的 RNAi机制, 引起相应基因的沉默, 作为
一种类似“报复”的行为给予入侵有害生物以精确打
击[29-31], 已经在植物抗虫、抗真菌、抗寄生杂草研
究中得到了成功应用。采用该策略沉默入侵生物基
因的关键是作为干扰信号的 dsRNA 或 siRNA 的在
植物中必须有一定的积累, 由于 RNAi 干扰存在剂
量效应, 只有植物细胞中积累的 RNAi 信号分子量
足够多或病原物入侵后寄主细胞仍然能够持续产生
RNAi 信号, 才能保证传递到入侵真核生物中 RNAi
信号的量达到触发 RNAi 的阈值, 所以目前该策略
主要成功应用于病原物和寄主长期共存的活体营养
型病原菌引起的病害研究[15-16]。而晚疫病菌为半活
性营养型病原菌 , 入侵植物后会杀死细胞 , 终止
RNAi 信号的持续产生, 采用该策略实现对致病疫
霉基因的沉默目前尚未有报道, 而已有的关于植物
介导的 RNAi 沉默另一种卵菌类病原菌寄生疫霉的
研究发现转基因植株产生的 dsRNA 不足以触发其
RNAi 机制而引起相应基因的沉默[32]。本研究构建
了双子叶植物中的强启动子 CaMV 35S启动子驱动
的同时与马铃薯晚疫病菌 4 个纤维素合成酶基因同
源的 C1234反向重复序列表达载体, 转化马铃薯获得
了 129个转基因株系, 其中有 97个转基因株系接种
晚疫病菌后延缓发病, 病斑生长速率显著低于对照,
并且发病延缓的叶片上寄生的晚疫病菌 4 个纤维素
合成酶基因 mRNA 积累水平也显著低于野生型, 说
明对致病疫霉这种半活体营养型病原菌采用植物介
导的 RNAi 能够沉默其基因表达, 并且转基因植株
中能够引起致病疫霉基因沉默的株系出现频率较高,
本研究中引起其基因沉默的转基因株系占总转基因
株系的 75.2%。这说明马铃薯介导的 RNAi能够有效
沉默入侵致病疫霉基因表达。植物介导 RNAi 能够
引起致病疫霉基因沉默, 而对寄生疫霉却没有作用,
引起这一差异的原因可能是不同卵菌间对环境
RNAi信号吸收能力存在差异。
3.2 马铃薯介导的 RNAi增强马铃薯对致病疫霉
抗性的靶标基因选择
本研究以致病疫霉纤维合酶家族的 4 个纤维素
第 6期 任 琴等: 植物介导的 RNA干扰引起马铃薯晚疫病菌基因的沉默 887


合成酶基因同时为靶标 , 这些基因为非致死基因 ,
但其沉默会引起致病疫霉细胞壁纤维含量下降, 影
响正常附着孢的产生和萌发管的形成, 一定程度上
影响了致病疫霉的致病性[28]。由于植物介导的 RNAi
干扰对基因的沉默是不完全的, 只是一定程度下调
了相应基因的表达, 不足以彻底阻止病菌侵染, 而
晚疫病菌一旦侵染马铃薯, 纤维合酶基因表达水平
就不会对病菌致病能力产生强烈影响。故本研究中
转基因株系接种致病疫霉后仅仅延缓了发病进程 ,
而没有产生强烈抗性。故后续采用植物介导的 RNAi
增强对晚疫病的抗性研究中, 在靶标基因选择上应
借鉴在抗真菌研究中的成功经验[15-17], 选择致病疫
霉致死基因或对其生长发育至关重要的关键基因 ,
使植物的“报复”行为更有效。
4 结论
通过在马铃薯中表达与致病疫霉基因同源的
dsRNA 能够下调入侵晚疫病菌相应基因表达, 赋予
马铃薯对入侵病菌特定基因精确打击的能力。通过
马铃薯介导的致病疫霉 RNAi 同时沉默晚疫病菌 4
个纤维素合酶基因表达能够延缓马铃薯晚疫病发病
进程。
References
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