全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(7): 1148−1154 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08009-001, 003)和国家自然科学基金项目(31071379)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 江光怀, E-mail: ghjiang@genetics.ac.cn, Tel: 010-64807622
第一作者联系方式: 陈红霖, E-mail: hlchen@genetics.ac.cn, Tel: 010-64807622; 向阳海, E-mail: mainsun@163.com, Tel: 010-64807622
** 同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2012-12-17; Accepted(接受日期): 2013-03-11; Published online(网络出版日期): 2013-04-23.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130423.1336.015.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01148
水稻类病变突变体 c5的遗传分析与目标基因的精细定位
陈红霖 1,2,** 向阳海 1,** 赵纪莹 1,2 尹德东 1,2 梁国华 3 翟文学 1
江光怀 1,*
1 中国科学院遗传与发育生物学研究所, 北京 100101; 2 中国科学院大学, 北京 100049; 3 扬州大学农学院, 江苏扬州 225009
摘 要: 水稻类病变突变体 c5是由粳稻品种中花 11种子经化学诱变剂 EMS (甲基磺酸乙酯)诱变处理得到的。该突
变体叶片在三叶期开始出现近似圆形褐色斑点, 经 DAB 和台酚蓝染色显示这些斑点积累了过多的 H2O2并引起程序
性细胞死亡。与野生型相比, 突变体 c5的成熟期株高从 110.4 cm减少到 74.6 cm, 有效分蘖数和每穗着粒数分别减
少 23.7%和 28.5%, 千粒重和结实率都显著降低, 此外, c5还表现出对白叶枯病菌的广谱抗病性, 对 10个菲律宾生理
小种都有强烈的抗性反应。遗传分析表明, c5 的突变性状受单隐性核基因控制。利用 c5 和明恢 86 配组形成的包含
6269个单株的 F2群体和 18个分子标记, 将 c基因限定在水稻第 5染色体长臂 STS标记 S41和 S47之间大约 102 kb
的遗传距离内。序列分析发现该区间内其中有 11个编码基因, 且它们与现已报道的类病变基因都不同, 暗示 c5可能
是一个新型类病变性状控制基因。
关键词: 水稻(Oryza sativa L.); 抗病; 类病变; 遗传分析; 基因定位
Genetic Analysis and Gene Fine Mapping of Rice Lesion Mimic Mutant c5
CHEN Hong-Lin1,2,**, XIANG Yang-Hai1,**, ZHAO Ji-Ying1,2, YIN De-Dong1,2, LIANG Guo-Hua3, ZHAI
Wen-Xue1, and JIANG Guang-Huai1,*
1 Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China; 2 University of Chinese Academy of Sci-
ences, Beijing 100049, China; 3 Agricultural College of Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
Abstract: The lesion mimic mutant c5 was obtained by treating the seeds of japonica variety Zhonghua 11 with chemical
mutagen EMS (ethyl methane sulfonate). The phenotypes and main agronomic traits of the c5 mutant were investigated. There
were many nearly circular brown spots began to appear on c5 leaves at 3-leaf stage. These leaves were stained further with DAB
and trypan blue respectively and indicated that there were excessive H2O2 production and clusters of dead cells in the lesion tis-
sues. Compared with the wild-type, the height of c5 plant decreased from 110.4 cm to 74.6 cm, the number of effective tiller per
plant and spikelet per panicle were reduced by 23.7% and 28.5% respectively, thousand-grain-weight and seed setting rate were
significantly dropped. In addition, c5 is endowed a broad-spectrum resistance to bacterial blight resistance to ten Philippine races
of X. oryzae pv. oryzae (Xoo). Genetic analysis showed that the lesion mimic mutant c5 was controlled by a single recessive nu-
clear gene. Minghui 86 was crossed with c5 and 6269 individuals of F2 population and 18 pairs of molecular markers were used
for gene mapping. And the gene was further mapping to rice chromosome 5 in a 102 kb region between STS markers S41 and S47.
Sequence analysis of the 102 kb region revealed that there were 11 candidates for c5 gene. All the 11 candidate genes were dif-
ferent from those lesion mimic genes reported previously, which suggested that the phenotype of c5 may be controlled by a novel
gene.
Keywords: Rice (Oryza sativa L.); Resistance; Lesion mimic; Genetic analysis; Gene mapping
类病变突变在植物中普遍存在, 人们已从拟南
芥[1]、大麦[2]、玉米[3]、花生[4]和水稻[5]等植物中发
现了这类突变体。尽管水稻中报道了大量的类病变
突变体, 但是大部分突变体还没有进行遗传分析。
第 7期 陈红霖等: 水稻类病变突变体 c5的遗传分析与目标基因的精细定位 1149


对水稻类病变基因的命名主要有两种方式, 一种由
Gramene网站统一以 lrd (lesion resembling disease)
形式命名; 另一种是根据类病变发生的时间、颜色、
形状或导致植株抗病等特点来命名, 如 spl (spotted
leaf)、bl (brown leaf spot)、cdr (cell death and resis-
tance to the blast fungus)、blm (blast lesion mimic)、
yls (yellow leaf spot)、fgl (faded green leaf )、zn (zebra
necrosis)、lmi (lesion mimic initiation)等, 其中以 spl
命名的突变体最多[5]。
到目前为止, 利用分子标记定位的水稻类病变
突变基因有 20多个, 如定位在第 1染色体的 SPL6 [6]、
第 2染色体的 SPL2、第 3染色体的 SPL3 [7]、第 4染
色体的 RLIN1[14]、第 5染色体的 SPL7 [8]和 SPL8 [9]、
第 6染色体的 SPL4、第 7染色体的 SPL5和 SPL9、第
8染色体的 lmi基因[9]、第 10染色体的 SPL10、第 12
染色体的 SPL1和 SPL11 [10-13]。其中, SL(SPL1) [15]、
SPL7 [8]、SPL11 [16]、SPL18 (OsAT1) [17]、SPL28 [18]、
attm1 (OsPtila) [19] 、 OsNPR1 [20] 、 RLIN1 [14] 、
OsLSD1 [21]、OsEDR1 [22]和 OsNH1 [23]等基因已被克
隆。SPL7 基因是第一个被克隆的类病变基因 , 由
Yamanouchi 等 [9]分离 , 它编码一热胁迫转录因子 ,
与玉米的 HSFb, 拟南芥的 HSF21、HSF1 和蕃茄的
HSF8具有较高的同源性。当植物受到环境的热胁迫
时, HSF会被热激因子活化, 进入细胞核并与热激蛋
白基因的启动子结合, 启动热激蛋白的表达, 导致
热激应答的诱导。SPL11编码 U-box-ARM蛋白, 有
E3 泛素连接酶活性, 与植株细胞死亡和防御有关,
并对水稻稻瘟病有抗性, 表明泛素化系统对控制细
胞的死亡和防御反应有重要作用[16]。Mori等[17]通过
T-DNA 插入获得的显性水稻类病变基因 SPL18, 编
码一个酰基转移酶。SPL18 的过量表达致使类病变
产生。2009年, Qiao等[18]通过图位克隆方法分离了
水稻类病变基因 SPL28, 其编码产物是网格蛋白相
关衔接蛋白复合物 1 介导亚单位 u1, 在囊泡形成过
程中调控网格蛋白相关衔接蛋白复合物 1 在膜泡和
细胞质之间的循环。引起类病变突变的原因比较复
杂, 既有植物内部基因的作用, 也受光照、温度、湿
度和养分等环境因素的影响。Hu等[24]和 Tang等[25]
获得的类病变突变体是抗病基因突变或信号传导途
径改变所致。最近, Fujiwara等[15]也通过图位克隆分
离到 Sl (Spl1), 它编码一个细胞色素 P450单加氧酶
家族 CYP71P1。尽管已克隆了这些类病变基因, 但
它们编码着不同类型蛋白, 表明类病变发生过程非
常复杂, 只有发掘更多的类病变突变体, 克隆更多
的相关基因, 我们才有可能全面了解类病变发生机
制。前期, 我们通过化学诱变获得一个类病变突变
体 c5, 其表型明显, 性状稳定, 是一份研究类病变
发生的好材料。
1 材料与方法
1.1 供试材料和白叶枯菌小种
粳稻品种中花 11 和籼稻品种明恢 86 为本实验
室留种; 抗性鉴定所用到的 10个菲律宾白叶枯病小
种包括 PXO61(P1)、 PXO86(P2)、 PXO79(P3)、
PXO71(P4)、PXO112(P5)、PXO99(P6)、PX145(P7)、
PXO280(P8)、PXO330(P9)和 PXO124(P10), 由中国
农业科学院作物科学研究所提供。
1.2 c5突变体的获得及遗传分析
所用水稻类病变突变体最初由粳稻品种中花11
种子经化学诱变剂EMS(甲基磺酸乙酯)诱变处理得
到, 后经多代自交, 形成突变性状稳定突变体c5。以
突变体c5为母本 , 与籼稻品种明恢86杂交 , 获得F1
材料后进行表型鉴定和遗传分析; 从苗期开始观察
F2代单株的类病斑表现, 再在成熟期调查它们的主
要农艺性状。
1.3 定位群体的构建和总 DNA的提取
根据植株性状调查与分析结果, 利用c5与明恢
86杂交产生的的F2代1629株纯合隐性类病变植株进
行定位分析, 分单株取叶片提取总DNA。在此基础
上, 随机选取正常和类病变植株各20株, 每单株取
等量叶片, 将正常和类病变单株叶片分别混合, 参
照McCouch等[26]的方法, 提取总DNA作为正常和类
病变近等基因池。
1.4 分子标记的设计和电泳分析
根据McCouch等的方法 [27]获得简单序列重复
(SSR)标记, 运用Primer5.0软件自行设计序列标签位
点(STS)标记。由上海英骏生物技术有限公司合成
SSR和STS引物。参照Panaud等 [28]的PCR反应体系,
扩增产物经3.0%~3.5%琼脂糖凝胶电泳 , 经溴化乙
锭染色后在紫外灯下观察、照相。
1.5 组织学染色
将表现类病斑的c5和中花11的幼嫩叶片分别浸
泡在煮沸的台酚蓝染液 [29]中, 染色10 min, 室温放
置12 h后于2.5 mg mL–1的水合氯醛(10 mL水中加入
25 mg水合氯醛)中脱色3~4 d, 观察细胞死亡情况并
用相机拍照记录。将叶片保存在50%的甘油中, 实验
1150 作 物 学 报 第 39卷

重复3次 ; 此外 , 参考Thordal-Christensen等 [30]的方
法检测水稻类病变突变体叶片中H2O2反应物的积
累。将表现类病斑的突变体叶片及其野生型叶片浸
泡在1 mg mL–1的DAB (pH 3.8)中于25℃光照8 h后,
取出叶片置96%的乙醇中煮沸10 min, 脱色, 再将叶
片在新鲜的乙醇中浸泡4 h (25℃), 观察叶片中是否
出现红褐色沉淀并照相记录。实验重复３次。
1.6 MDA和氧自由基含量的测定
参照 Buege和 Aust的方法[31]测定 MDA和氧自
由基的含量, 取 0.5 g叶片作为待测样。3次重复。
2 结果与分析
2.1 突变体 c5的表型特征及主要农艺性状
突变体 c5生长 3~4周后, 叶尖开始出现稀疏的
褐色小斑点, 并蔓延到叶尖以下, 逐步分散到叶脉
附近及叶片表面, 其分布越来越密而多, 且颜色由
褐色加深为黑褐色, 直到整个叶片坏死(图 1)。与野
生型相比, 突变体 c5还表现出其他农艺性状的变化,
如成熟期株高从正常的 110.4 cm减少到 74.6 cm, 有
效分蘖数和每穗着粒数也分别减少 23.7%和 28.5%,
千粒重和结实率都显著降低。


图 1 c5突变体的表型(5周左右)
Fig. 1 Phenotype of c5 mutant (five weeks)

2.2 突变体 c5的组织化学分析
以往报道的类病变坏死突变体的细胞一般会产
生过多的 H2O2, 甚至引起细胞坏死。经台酚蓝染色
发现突变体 c5 坏死斑点处的细胞有深蓝色着色点
(图 2-D), 表明该部位的细胞已经死亡或正在死亡,
而中花 11的叶片上无着色点; 同时, 突变体 c5叶片
上的深蓝色着色点呈散发状独立存在, 表明这种细
胞死亡是自发起始的。
植物细胞产生 H2O2沉积时, 在过氧化物酶存在
的情况下, 二氨基联苯胺(DAB)与 H2O2 反应, 迅速
形成红褐色聚合物沉积。因此, DAB 染色可检测细
胞程序性死亡时产生的活性氧沉积。本研究将突变
型和野生型叶片进行 DAB染色, 野生型中基本没有
H2O2 沉积的斑点, 而突变体有大量的 H2O2 沉积斑
点产生, 表明 c5突变体的类病斑是由水稻细胞产生
过多的活性氧所引起的(图 2-C)。此外, 在叶片还未
出现类病变斑点时用铝箔包住叶片时, 遮光处理约
2 周, 待其他部位有病斑出现后, 取下铝箔后发现
c5突变体的遮光部位没有病斑的形成(图 2-E), 表明
c5类病斑还受光照诱导。


图2 不同处理的野生型和c5突变体部分叶片
Fig. 2 Plant leaves of wild-type and c5 mutant under different
treatments
WT(A)、c5突变体(B)、台酚蓝染色(C)、DAB染色(D)和铝箔纸遮
光处理(E), 黑色示叶片遮光部位。
WT(A), c5 mutant(B), trypan blue staining(C), DAB staining(D),
and tinfoil shading treatment (E).

2.3 突变体 c5的丙二醛(MDA)和氧自由基含量
为进一步了解c5突变体病斑部位细胞产生过量
H2O2的原因 , 测定了中花11和突变体c5叶片中的
MDA和氧自由基含量 , 结果显示c5突变体MDA含
量比野生型多一倍(图3-A), 氧自由基含量将近野生
型的3倍(图3-B), 表明c5突变体细胞内活性氧清除
系统出现了障碍, 从而造成氧自由基含量高, 引起
细胞膜的过氧化并最终触发了细胞程序性死亡产生
类病变表型。
2.4 c5对多个白叶枯病生理小种产生广谱抗性
由于目前报道的很多类病变突变体表现出很强
的抗病性, 我们对c5突变体进行了白叶枯病菌抗性
分析。将培养好的白叶枯病菌生理小种用无菌水稀
释成OD600为0.5的菌液 , 然后利用剪叶法接种分蘖
盛期的c5和中花11叶片, 结果表明, c5类病变突变体
对10个菲律宾小种全部表现出抗性, 特别是对致病
性极强的PXO280(P8)表现出极强的抗性反应(图4和
表1)。
第 7期 陈红霖等: 水稻类病变突变体 c5的遗传分析与目标基因的精细定位 1151



图3 野生型和c5突变体MDA和氧自由基含量
Fig. 3 MDA and oxygen radicals contents of wild-type and c5
A: MDA含量; B: 氧自由基含量, 3次独立测量。
**表示在 P = 0.01水平上差异显著。
A: MDA content; B: oxygen free radicals content, three indepen-
dent measurements. ** Significantly different at P = 0.01.


图4 c5突变体和野生型中花11对多种白叶枯病生理小种的广谱抗性
Fig. 4 Broad spectrum resistance to a variety of physiological
races of bacterial blight of c5 and wild-type
P1~P10分别代表菲律宾白叶枯菌10个生理小种。
P1−P10 is 10 physiological races of the Philippines Xoo, respectively.

表1 c5突变体和对照中花11对多种白叶枯病生理小种病斑长度
统计(5次独立测量)
Table 1 Lesion length statistics of wild-type and c5 mutant to
physiological races of bacterial blight (five independent
measurements)
材料 Material 菌株
Strain 野生型
Wild-type
c5 c5比野生型增减
Compared with wild-type
PXO61 (cm) 2.1 0 –100.0%**
PXO86 (cm) 3.6 0 –100.0%**
PXO79 (cm) 2.0 0 –100.0%**
PXO71 (cm) 7.1 0.5 –93.0%**
PXO112 (cm) 3.3 0 –100.0%**
PXO99 (cm) 5.9 0.4 –93.2%**
PX145 (cm) 4.2 0 –100.0%**
PXO280 (cm) 7.0 1.0 –85.7%**
PXO330 (cm) 0.8 0.6 –25.0%*
PXO124 (cm) 5.8 0.1 –98.3%**
** 表示在P = 0.01水平上差异显著, *在P = 0.05水平上差异显著。
** Significantly different at P=0.01; *Significantly different at P=0.05.
2.5 突变性状的遗传分析
将 c5突变体与明恢 86杂交, 共获得 31个 F1代
植株 , 它们都未出现病斑 , 为正常表型 , 表明该性
状受隐性基因控制。随后对这些 F1 代植株的 6269
个自交后代进行表型鉴定, 发现叶片正常的植株与
有类病表型的植株数量分别为 4640 株与 1629 株,
经卡方(χ2)测验, 基本符合 3∶1 的分离比, 符合孟
德尔的单基因控制遗传定律, 这表明 c5突变性状受
单个隐性核基因控制。
2.6 突变基因的分子标记定位
首先利用914个F2代类病变突变单株将目的基
因定位于第 5染色体上简单重复序列 (SSR)标记
RM18353与RM18368之间约500 kb的范围内。然后
利用这2个分子标记进一步扩大群体分析 , 在剩下
的715个F2类病变突变单株中又分别鉴定出14个和
13个与c5基因发生交换的个体。为了进一步缩小定
位区间, 设计了一系列序列标签位点(STS)标记(表2)
对这些交换单株进行分析, 结果显示S35检测出3个,
S41检测出2个交换单株, 其中2个为共同检出; S23
检出4个交换单株, S47检测出2个, 其中2个为共同
检出; S45标记没有检测出交换单株。通过以上分析,
最后将目标基因限定S41和S47之间约102 kb距离内
(图5), 并在这区间内预测到11个候选基因, 它们与
现已报道的类病变基因都不同, 显示c5基因是一新
类型类病变坏死基因。



图5 c5基因的精细定位
Fig. 5 Fine mapping of c5 gene
A: c5基因位点被定位到第5号染色体SSR分子标记RM18353和
RM18368之间500 kb; B: 用新发展的一些STS分子标记进一步精
细定位。C: 把目的基因锁定在包含2个BAC/PAC的102 kb范围内。
A: c5 is positioned in 500 kb between RM18353 and
RM18368 on chromosome 5; B: some new STS markers
were developed; C: lock the target gene within 102 kb,
containing two BAC/PAC.
1152 作 物 学 报 第 39卷

表2 c5基因连锁标记
Table 2 Sequences of markers linked with c5
标记
Marker
正向引物
Forward primer (5′–3′)
反向引物
Reverse primer (5′–3′)
RM169 TGGCTGGCTCCGTGGGTAGCTG GGAGGGATGAACGGCAACGGGA
RM18204 GAAACTAGAGATGCACACATCC GGATGGAGGGAGTACTTACCAT
RM18353 AGATCTCACTATTGAGTAGCCCATGC GGTTGGTATTTAAGGGCAAGGTG
RM18368 AAGCGAGTCACCAACATCATGC CCATGAACTGAGGTCAGCCACTA
RM18451 ATATACAGCGCGGACATTGTGG GGATTCGCGTGAAGATGACATG
RM1237 CTCCGCGAGCTTTAGAAGAG CGGGAGAGCCAGAGTATGTG
S35 AAAATTACTGCACCCTGCCTAA CATCGGTTAATTGTCTCATTTCA
S41 GGTGAGCATCCACATCCTCT TGTTCTCCCAAAAGTTTGCC
S47 ACCGATGTGTGGGTCCTATC TACGTGCTTCGAGCTGCTAA

3 讨论
水稻突变体 c5的叶片细胞在正常的生长条件下
会自发死亡导致类病变表型, 这暗示着细胞程序性
死亡(PCD)可能参与了 c5的类病变发生。事实上, 有
许多研究表明类病变突变体的细胞坏死与 O−2 和
H2O2 等活性氧(ROI)有关, 如拟南芥的 lsd1、acd2,
玉米的 les22、lls1 以及水稻的 cdr1、cdr2、Cdr3、
spl2、spl7、spl11、lrd40 等突变体的表型均与 ROI
有关。植物在长期的演化过程中, 发展了一套完善
的氧自由基的清除系统, 一般情况下它能保证 ROI
的产生和降解处于动态平衡, 若这种平衡被打破就
会影响细胞的正常代谢过程, 如高浓度 ROI 造成氧
化胁迫, 会使细胞膜的高度氧化, 影响细胞的通透
性, 最终导致细胞坏死。在 c5突变体中我们也检测
到 H2O2 在叶片细胞中积累较多, 这可能是细胞内
ROI 清除系统出现障碍, H2O2产生速率远大于分解
速率, 细胞内 H2O2过多积累引起了细胞的程序性死
亡, 表现出类病变表型。通过精细遗传定位, c5类病
变基因被定位在水稻第 5染色体的 102 kb物理区间
内, 与先前报道的第 5 染色体的 SPL7 和 SPL8 的类
病变基因不在同一个区间, 且它们之间的表型也存
在较大差异, 所以 c5类病变基因是一个影响细胞活
性氧代谢的新型水稻类病斑基因, 该基因的成功克
隆必将增进我们对类病变坏死机制的了解。
有许多类病变突变体不同程度地提高了其自身
的抗病性, 如 spl11对稻瘟病病菌和白叶枯病菌表现
出广谱抗性[29], lrd37 和 lrd40 对白叶枯病菌具有广
谱抗性[32], spl1、blm、Spl28等对稻瘟病病菌或白叶
枯病菌的抗性也有所提高[33-35]。从 c5 和 spl11 这些
突变体的广谱抗病性来看, 我们推测这些类病变突
变体的抗病信号传导途径下游的某些环节被激活了,
是很有潜力的作物抗病分子育种材料, 但是类病变
突变体普遍出现叶片细胞坏死、植株矮小、产量低
等一些不良农艺性状, 又限制了它们在生产实践中
的直接应用。怎样利用这些材料将是我们下一步要
开展的研究, 只有成功地分离到这些基因, 并了解
了它们的信号传导途径, 才可以利用基因工程技术
来充分利用它们, 培育出具有良好农艺性状的广谱
抗病新品种。
4 结论
以中花 11 为遗传背景的水稻类病变突变体 c5
属于起始型类病变突变体, 具有局部的细胞死亡和
超敏反应(HR)特征, 且病斑的形成受光照诱导。突
变体 c5细胞内积累了过多的活性氧, 诱发了膜质过
氧化, 并引起了细胞的程序性死亡; c5 具有广谱白
叶枯病抗性, 对 10 个菲律宾小种都有强烈抗性反应;
在成熟期, 突变体 c5的株高、有效分蘖数、每穗着
粒数、千粒重和结实率都显著降低。c5 突变性状受
1对隐性核基因控制。该突变基因被定位于水稻第 5
染色体两 STS标记之间的 102 kb的范围内, 其间含
11 个开放阅读框, 所编码的蛋白不同于以往报道的
类病变蛋白, 因此 c5是一个控制水稻类病变发生的
新基因。
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