全 文 ：武汉植物学研究 1999, 17(2) : 127～129
J ournal of Wuhan Botanical Resear ch
脐橙与柠檬种间细胞电融合再生杂种植株X
郭文武　邓秀新　胡春根
(华中农业大学:作物遗传改良国家重点实验室,园艺系　武汉　430070)
提　要　‘纽荷尔’脐橙〔Citrus sinensis (L. ) Osbeck〕胚性细胞悬浮系原生质体与‘尤力克’
柠檬〔Citrus limon (L. ) Burm . f. 〕叶肉原生质体经电场诱导融合, 培养 8个月, 首批再生了 1
棵植株。形态学观察、染色体计数及 RAPD 分析证明为异源四倍体体细胞杂种。该杂种的获
得为三倍体无籽柠檬品种培育提供了杂交亲本。
关键词　电融合, 体细胞杂种, RAPD, 柑桔
柑桔是世界重要水果之一,珠心胚的干扰、雄(雌)性败育、自交(异交)不亲和等特点使得通过有性
杂交途径改良柑桔品种的进程缓慢, 效率不高。柑桔细胞融合技术的发展和完善为品种改良展示了美好
前景, 已获得一大批体细胞杂种〔1～3〕。可以说, 柑桔细胞融合研究已走过了体系建立阶段,大多数柑桔基
因型融合组合, 经培养一般都能再生体细胞杂种, 部分杂种已开花、挂果, 用于培育三倍体或作砧木试
验〔4～6〕, 并正在逐步走向应用。通过特定融合组合的选配, 可以达到解决柑桔生产中存在的问题。纽荷尔
脐橙为我国 80 年代初从美国引进的无病毒柑桔良种,在长江三峡沿岸及江西赣南等地区有大面积栽
培, 由于其雄(雌)性均败育,不能通过有性杂交转移其优良性状。尤力克柠檬在重庆直辖市及四川省有
栽培, 具有单胚或双胚特性,可以作为杂交亲本, 但味酸、籽多是其缺点。本研究的目的是通过细胞融合
途径打破这 2 个种之间的生殖隔离现象(不育性) , 获得异源四倍体体细胞杂种。远期目标是利用体细胞
杂种作为回交亲本(若杂种可育) , 与柠檬杂交,将脐橙的优良性状导入柠檬,并得到三倍体无籽类型。
1　材料和方法
1. 1　材料
纽荷尔脐橙(C. sinensis)胚性愈伤组织由幼嫩珠心组织诱导产生, 诱导培养基配方为: MT + 蔗糖
50 g/ L+ IAA 0. 1 mg/ L+ KT 0. 5 mg/ L+ 麦芽提取物 500 mg/ L (未发表资料) ,继代保存于MT 基本
培养基〔7〕中。胚性细胞悬浮系培养基为MT+ 蔗糖 50 g/ L+ 麦芽提取物 500 mg/ L,每 14 d 继代 1 次,继
代 3 次后用于原生质体分离。尤力克柠檬( C. limon) 成熟种子经消毒后接种于试管中,叶片充分展开后
用于叶肉原生质体分离。
1. 2　原生质体分离、纯化、融合及培养
纽荷尔脐橙悬浮继代后的 6～10 d,可用于分离原生质体。胚性细胞悬浮系及叶肉原生质体分离、纯
化与以前报道相同〔8〕。融合仪为 SSH-2 型(日本岛津 ) , 融合室为 FTC-03 型。融合参数如下:交变电场
X
收稿日: 1998-02-18,修回日: 1998-06-01。第一作者:男, 1970年出生,讲师(博士) ,从事果树育种及生物技术方
面研究。
国家杰出青年科学基金(编号 39625017)及瑞典科学基金( IFS)资助项目。
125 V/ cm ,作用时间 60 s;直流脉冲电场 1 250 V/ cm,脉冲宽度 40 Ls,脉冲间隔 0. 5 s,脉冲个数为 5。电
融合液组成为: 甘露醇 0. 6 mol/ L, CaCl2 0. 25 mmol/ L, pH 5. 6, 高压灭菌。融合过程完成后, 静止
10 min, 然后离心 4 min (100×g )。融合产物用 BH3 液体培养基〔9〕悬浮至 1～5×105个/ mL 的密度, 于
28℃培养箱中, 用 15 mm×60 mm玻璃培养皿进行液体浅层暗培养。
胚状体增殖培养基组成为: MT + 蔗糖 50 g/ L+ 麦芽提取物 500 mg/ L;生芽培养基组成为: MT+
蔗糖 30 g/ L+ BA 0. 5 mg/ L + KT 0. 5 mg/ L+ NAA 0. 1 mg/ L;生根培养基组成为: 1/ 2 MT + 蔗糖
20 g/ L+ NAA 0. 5 mg/ L+ 活性炭 0. 05%。所有培养基的 pH 值均为 5. 8。
1. 3　染色体计数及 RAPD分析
茎尖及根尖染色体计数采用铁矾苏木精染色法〔10〕。叶片 DNA 提取采用 SDS 方法〔11〕。扩增仪为
Perkin Elmer 480 型。所用引物为: OPA-04, OPA-05, OPA-07, OPA-08, OPA-10, OPA-19, OPA-20。反
应条件同文献〔12〕, 扩增产物经 1. 6%琼脂糖电泳, 溴化乙锭染色后照相。
2　结果和分析
混合在一起的双亲原生质体经电场诱导融合, 双核异核体率可以达到 10%以上。利用不同类型原
生质体间比重的不同, 即柑桔叶肉原生质体、融合体的比重比悬浮系原生质体大, 并且柑桔叶肉原生质
体在目前培养体系下不能分裂再生成株, 融合后通过控制离心时间, 即离心 4 min, 而不是通常的
10 min, 又可以收集到更高比例的双核异核体〔8〕(未统计)。融合产物经培养,大约 1个月后再生大量很
小的球形胚状体。将胚状体转至分化培养基, 光照下进行液-固双层培养, 胚状体进一步增大并且木质
化。将木质化的胚状体转至生芽培养基, 经多次继代培养,但生芽困难, 培养 8 个月后,仅再生 1 棵植株。
将再生芽切下并转至生根培养基, 大约 20 d 后生了根,成为完整植株,并移入了温室 (图版É: 1)。
纽荷尔脐橙和尤力克柠檬均为二倍体( 2n= 2x = 18)柑桔品种, 叶形较细长,而融合再生植株叶片较
厚、叶形较宽,具多倍体特征(图版É: 1)。茎尖染色体计数表明它为四倍体( 2n= 4x= 36) (图版É: 2)。再
生植株移入温室后生长较旺。新近又获得 4 棵试管生根苗,根尖染色体计数表明都为四倍体。取温室苗
叶片抽提总 DNA, 进行RAPD分析。结果表明, 用引物OPA-10 扩增, 再生植株含有双亲的特异带(图版
É: 3)。纽荷尔脐橙的 1条特征带未能在杂种植株中表现出来(图版É: 3) , 可能是由于其 cpDNA 未能传递
给杂种植株所致。这是因为柑桔体细胞杂种的 mtDNA 一般来自悬浮系亲本,而 cpDNA 是随机分离的,
有来自悬浮系亲本的 ,也有来自叶肉亲本的, 比例为 1∶1〔13〕。由于 RAPD 分析用的是总 DNA,也可能扩
增出胞质基因组, 纽荷尔脐橙的这条未能在杂种植株中表现出来的特征带可能就是其 cpDNA 被扩增的
结果, 而杂种植株含有另一亲本的 cpDNA。实际结果是否如此, 还需要进一步的胞质基因组的 RFLP 分
析来证实。引物 OPA-20、OPA-08 结合也能鉴定其杂种性(图版É: 4, 5)。形态学观察、染色体计数及
RAPD 分析表明再生植株为异源四倍体体细胞杂种。
3　讨论
前人研究表明, 植物二倍体品种间的有性生殖隔离现象(如不育性、多胚性等)可以通过细胞融合这
一多倍体化途径解决。温州蜜柑、脐橙、无核葡萄柚均具不育性, 不能通过有性杂交来实现其基因交流与
重组, 细胞融合技术巧妙地解决了这一问题。温州蜜柑与脐橙、脐橙与无核葡萄柚间的体细胞杂种育性
得到了恢复, 并作为杂交亲本进一步培育了三倍体〔6〕。柑桔体细胞杂种, 已开花的组合基本上都有育性。
本研究得到的脐橙与柠檬间的体细胞杂种极有可能也具有育性,利用柠檬品种的单胚、少胚特性, 与其
回交, 这样不仅可以导入脐橙的优良性状,而且由于三倍体减数分裂不正常, 不能形成正常的配子,得到
的三倍体柠檬类型还将会是无籽的。另外, 脐橙具有较强的单性结实特性, 将来培育的三倍体因带有脐
橙的遗传信息, 单性结实特性可能也较强,从而可能实现三倍体无籽、果大的育种目标, 这对我国柑桔业
的发展具有重要意义。
128 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 17卷　
参 考 文 献
1　郭文武,邓秀新.原生质体融合与果树遗传改良。果树科学, 1996, 13( 1) : 49～55
2　Guo W W, Deng XX. Somat ic h ybrid plant let s r egenerat ion between Citr us and its wild relat ive, Mur ray a p anicu-
l ata via protop las t elect rofu sion. P lant Cel l Rep , 1998, 18: 297～300
3　Guo W W, Deng X X. Intert ribal hex aploid hyb rid plants regen erat ion from elect rofusion between diploid s of Ci-
tr us sinensis and it s sexually incompat ible relat ive,Clausena lansium. T heor App l Genet, 1999, 98( in press)
4　邓秀新,马湘涛,孙中海等.柑桔体细胞杂种扦插繁殖特性及有关性状研究.果树科学, 1997, 14( 2) : 77～81
5　邓秀新, 伊华林,李锋等.以异源四倍体体细胞杂种为父本杂交培育三倍体柑桔植株.植物学报, 1996, 38( 8) :
631～636
6　Kobayashi S, Ohgawara T, Saito W et al . Fru it character ist ics and pol len fert ility of cit rus somat ic hybrids . J
J ap an Soc H ort Sci , 1995, 64( 2) : 283～289
7　Mur ashige T, Tu cker D P H. Growth factor requ irements of cit rus t is sue cu lture. P roc Fi rst I nt Citr us Symp ,
1969, 3: 1 155～1161
8　郭文武,邓秀新,史永忠.柑桔细胞电融合参数选择及种间体细胞杂种植株再生.植物学报, 1998, 40( 5) : 417～424
9　Grosser J W, Gmit ter F G Jr. Pr otoplas t fusion and cit rus improvemen t. P lant Breed Rev, 1990, 8: 339～374
10　朱v .植物染色体及染色体技术.北京:科学出版社, 1982.
11　肖顺元, Gmitter F G J r, Gr os ser J W et al. RAPD分析——鉴定柑桔体细胞杂种的快速方法.遗传, 1995, 17( 4) :
40～42
12　史永忠,郭文武,邓秀新.柑桔 RAPD技术体系建立与体细胞杂种鉴定.园艺学报, 1998, 25( 2) : 105～110
13　Kobayashi S, Ohgawara T, Fuj iwara K et al . Analysis of cytoplasmic genomes in somat ic hyb rids between navel
orange (Citrus sinensis Osb) and ‘Murcott’t angor .T heor Appl Genet , 1991, 82: 6～10
SOMATIC HYBRID PLANT REGENERATION
BETWEEN NAVEL ORANGE AND LEMON
VIA PROTOPLAST ELECTRO-FUSION
Guo Wenwu　Deng Xiuxin　Hu Chungen
(N ational Key Laboratory of Crop Genet ic Imp rovement, and Dep artment of
H ort icul tur e, H uazhong Ag ricultural Univer si ty　Wuhan　430070)
Abstr act　Protoplasts isolated from cell suspension cultur es of ‘Newhall’navel or ange 〔Citrus sinensis
( L. ) Osbeck〕were electrica lly fused with mesophyll protopla st s of ‘Eureka’lemon 〔Citrus limon (L. )
Burm. f .〕. One plantlet was regenerated after 8 months of cultur e. Morphological observation, chromo-
some counting and RAPD analysis confirmed that this plant was allot etraploid somatic hybr id. T his so-
matic hybr id will be utilized as possible pollen par ent for breeding of seedless t riploid lemon cultivar s.
Key words　Electro-fusion, Somat ic hybrid, Randomly amplified polymorphic DNA, Citrus
129　第 2期　　　　　　　　　　　　郭文武等:脐橙与柠檬种间细胞电融合再生杂种植株