全 文 ：武汉植物学研究 ,
用 翻 月
首落根癌农杆菌转化系原生质体培养研究
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徐子勤 贾敬芬 胡 之 德
兰州大学细胞生物学研究室 兰州 兰州大学化学系 兰州
口 了,
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名
关建词 首猎 , 转化系 , 原生质体 , 愈伤组织 , 培养基
即 , , , ,
首落是一种重要的豆科牧草 年 , 等首次由首楷叶肉原生质体通过胚状体途径再生植株
获得成功‘曰 , 此后有关首蓓原生质体再生植株的报道已经涉及很多不同品种山 。 本工作对首蓓胭脂碱型
农杆菌转化愈伤组织进行了原生质体培养 , 建立起一种简便有效的培养方法 并分析了碘乙酞胺对原生
质体的作用 , 为融合实验打下了基础 。
, 材料与方法
以本实验室得到的曹蓓 材心 根癌农杆菌 八 加 万 舀 , 菌株转化系
为材料 。 取 转代 的颗粒状黄绿色愈伤组织转入 酶液 , 于黑暗 、 ℃ 、 条件下游离
。 酶液组成为 一 、 一 、 、
甘露醇 、 、 , · , 。 然后用 拌 尼龙网过滤 ,
离心 悬浮原生质体于 溶液 〔, , 中 , 用 蔗糖溶液于 离心 漂浮纯
化 , 用酚藏花红染色观察原生质体活力〔们 。
纯化的原生质体悬浮于液体培养基中 , 调整其密度至 。“ 个 , 于 ℃暗处理 , 然后移
至 ℃进行暗培养 , 每天轻轻摇动 次 。 原生质体基本培养基采用修改 , 和 两种 ,
收稿 日 一 一 , 修回 日 一 一 。 第一作者 男 岁 , 博士 。
国家自然科学基金资助 。
武 汉 植 物 学 研 究 第 巧 卷
附加 蔗糖 、 。 葡萄糖 、 谷氨酞胺 、 。 , 一 。 两周后添加 。 葡萄糖减
半的无激素培养基 , 以后再添加 含 葡萄搪的无激素培养基 修改 培养基取消了
其它糖类和生物素 、 ‘ 、 、 、椰乳等附加成分 。 生长至 大小的愈伤组织转入 无激素培养
基进行扩增 , 然后转至 , 一 、 一 、 、 、 、 、 等激素组合的 和 培养基进行分
化 。 将原生质体于 ℃预冷 , 用不同浓度 碘乙酞胺 , 在
℃处理 , 用 或 溶液洗涤后进行培养 。
结果与讨论
每 愈伤组织的原生质体产量可达到 。‘ ‘个左右 。 首楷原生质体生长要求较高的
了 浓度 , 但也需要一定量的 才 培养基中加入 肠蔗糖对原生质体生长有明显的促进作用 。 培
养基完全可以满足首楷转化系原生质体的生长需求 。 修改 中 , 诸如抗坏血酸 、抓化胆碱 、泛酸钙 、
叶酸 、 核黄素 、对氨基苯甲酸 、 柠檬酸 、 延胡索酸 、 苹果酸 、丙酮酸钠等均不是首楷原生质体生长必需的物
质 。
开始培养时 , 先将原生质体 图版 置于 ℃黑暗处理 , 对以后的分裂生长有促进效果 。 因
为去壁后的原生质体实际上处于受伤状态 , 低温暗处理可以减慢其代谢过程 , 使一些受伤反应如褐化
作用等变弱 。 以后 , 大部分原生质体开始再生细胞壁 , 并逐渐伸长成椭圆形 以后观察到第 次
分裂 图版 。 以后在 培养基中的分裂频率为 沁 , 培养基为 。 培养第 观察
到第 次分裂 图版 , 后形成紧密的细胞团 图版 两周后在 培养基中的植板率为
。 , 培养基为 。
,
植板率指能进行 次以上分裂的原生质体比率
两周之后 , 大部分细胞团与分裂细胞开
一一存活原生质体
一一分裂原生质体 沁
浓度
图 从 对首有 转化系原生质体生长分裂的形响
云 沁 滋 即 佃
八 八沾 八“ 脚‘ 俪
始褐化 , 生长速度减慢 此时应及时添加渗透
压调节剂减半的新鲜培养基 , 才能保持细胞
团的继续生长 。 左右 , 具有 个细
胞的小愈伤组织 已经形成 , 而且 肉眼可以分
辨出来 图版 , 此时应添加 渗透压
调节剂的新鲜培养基 。 。 如果填加液体
太多 , 液层加厚 , 细胞会发育成老化的长细
胞 。每天轻轻摇动 次 , 可以增加液层中的
氧气含量 , 促进细胞生长 培养 后 , 得到
大小的愈伤组织 图版 。 长至
大小的愈伤组织转入 无激素培养
基进行扩增 图版 。 用 和 为基
︵次︶哥令冲
本培养基 , 组合多种植物激素进行大量分化试验 , 均没有得到芽的分化和胚状体的发生 。 野生型根癌农
杆菌的 一 具有瘤性生长基因 , 它的整合引起很多植物分化能力的降低和丢失 。
首楷 转化系原生质体用一定浓度的 处理以后 , 生长和分裂明显受到抑制 。 当 浓度
为 时 , 原生质体分裂被完全抑制 , 但仍有 的原生质体可以存活 图 。 当 浓度增加
至 时 , 一周后原生质体全部褐化死亡 。 以下 处理后 , 原生质体均不能进行第
次分裂和形成细胞团 。
第 期 徐子勤等 首箱根癌农杆菌转化系原生质体培养研究
参 考 文 献
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孙勇如 , 安锡培 植物原生质体培养 北京 科学出版社 , 一
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