全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(3): 447−456 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由浙江省科技攻关项目(2009C32030)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 吴建国, E-mail: jianguowu@zafu.edu.cn, Tel: 0571-88982691; 石春海, E-mail: chhshi@zju.edu.cn,
Tel: 0571-88982691
第一作者联系方式: E-mail: qin_haifeng_ok@126.com
Received(收稿日期): 2013-06-07; Accepted(接受日期): 2013-08-30; Published online(网络出版日期): 2013-11-14.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20131114.1710.011.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00447
甜叶菊微卫星富集文库的构建与多态性标记的筛选
秦海峰 1 龙 宁 1 吴建国 1,2,* 石春海 1,*
1浙江大学农业与生物技术学院农学系, 浙江杭州 310058; 2 浙江农林大学农业与食品科学学院 / 浙江省农业产品品质改良技术研究
重点实验室, 浙江临安 311300
摘 要: 甜叶菊是我国一种重要特种经济作物, 其分子标记相关遗传背景研究甚少。本研究基于生物素与链霉亲和
素的强亲和性原理, 用链霉亲和素顺磁颗粒捕捉人工合成的标记有生物素的寡核苷酸探针(AG)15, 间接筛选出含有
甜叶菊基因组微卫星序列的DNA酶切片段, 将筛选得到的片段连接到 pUC-T载体中, 构建甜叶菊微卫星序列的富集
文库。挑取 354个克隆进行菌落 PCR检验, 从中筛选出 158个阳性克隆进行测序。结果表明, 134个(84.81%)克隆中
含有微卫星序列, 其中完美型 85个(63.43%)、非完美型 15个(11.19%)、复合型 34个(25.38%)。根据微卫星序列共设
计出 71 对微卫星引物, 其中 62 对能扩增出稳定的条带。利用 24 个甜叶菊品系对这 62 对引物的遗传多样性的分析
表明, 有 16个位点表现出多态性, 等位基因数为 2~8个, 平均每个位点扩增得到 4.5个等位基因, 多态性信息含量在
0.3163~0.7595之间, 观测杂合度(Ho)与期望杂合度(He)的范围分别为 0.2174~0.9167与 0.3555~0.8076。通过聚类分析,
将甜叶菊分为大小叶两大类。本研究开发出的微卫星标记可为甜叶菊的分子遗传育种提供有效的遗传标记。
关键词: 甜叶菊; 富集文库; 微卫星; 磁珠; 遗传多样性
Construction of Microsatellite-Enriched Library and Isolation of Icrosatellite
Markers in Stevia rebaudiana
QIN Hai-Feng1, LONG Ning1, WU Jian-Guo1,2,∗, and SHI Chun-Hai1,∗
1 College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2 Key Laboratory for Qulaity Improvement of Agricul-
tural Products of Zhejiang University / College of Agriculture and Food Science, Zhejiang A&F University, Lin’an 311300, China
Abstract: Stevia is one of important special crops in China, but its genetic background about molcular markers is known a little so
far. Based on the principle of the strong affinity between biotin and streptavidin, we used streptavidin paramagnetic particles to
catch a synthetic oligonucletide probe (AG)15 during an indirect selection from the genomic microsatellite sequence of restriction
fragments of DNA in Stevia rebaudiana. The enriched DNA fragments were ligated to the pUC-T vector to construct a S. re-
baudiana microsatellite sequence enriched library. From a library of 354 cloned colonies, 158 were screened by PCR examination
and the positive clones were sequenced, resulting in 134 (84.81%) clones containing microsatellite sequences. Among these
microsatellites, 85 (64.34%) belonged to the perfect type, 15 (11.19%) to the imperfect type and 34 (25.38%) to the compound
type. From the primers designed for the 71 microsatellite loci, 62 could amplify stable PCR products. An analysis of individual
genetic diversity of the 62 pairs primers using 24 S. rebaudiana varieties showed 16 loci had polymorphism and the number of
alleles at each locus ranged from two to eight. The average site amplified 4.5 alleles and the polymorphic information content
ranged from 0.3163 to 0.7595. The observed heterozygosity (Ho) varied from 0.2174 to 0.9167 and the expected heterozygosity
(He) varied from 0.3555 to 0.8076. By clustering analysis, S. rebaudiana were divided into two categories. The microsatellite
markers developed at this study could provide useful genetic markers for molecular breeding of S. rebaudiana.
Keywords: Stevia rebaudiana; Enrichement library; Microsatellite; Magnetic-beads; Genetic diversity
甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)又名甜菊、甜 茶、甜草, 是菊科多年生草本野生植物[1]。南美巴拉
448 作 物 学 报 第 40卷
圭等地的土著族将甜叶菊作为甜味剂食用[2]。甜叶
菊叶片中甜菊糖甜度很高, 是蔗糖的 250~300 倍[3],
但其热值较低, 仅为蔗糖的 1/300, 是一种可替代蔗
糖的非常理想的甜味剂[4]。甜叶菊的提取物用途广
泛, 可作甜味剂、药品辅料和矫味剂[5], 另外提取物
还具有抗高血糖、抗癌和抗菌等功效[6]。甜叶菊是
一种新型糖料栽培作物, 含有 14种微量元素、32种
营养成分, 它既是继蔗糖、甜菜糖后的第三种天然
糖源, 又是良好的营养来源[7]。榨糖后的甜叶菊渣中
含有多种营养成分, 如粗蛋白、粗纤维、粗脂肪及
微量元素等, 可以从中提取微晶纤维素, 还可作饲
料、肥料及食用菌的培养基等。甜叶菊中含有蛋白
质、鞣酸、淀粉、叶绿素等, 随着研究的深入, 它的
利用价值会进一步开发出来, 是一种综合开发利用
经济价值较高的作物。甜叶菊适应性很广, 几乎所
有从事种植业生产的农业区域都能生长, 自我国 70
年代从日本引种成功后, 种植面积逐年扩大, 现已
在全国 20个省市种植, 种植面积占全世界总种植面
积的 80%以上, 国内每年大约消耗甜叶菊干叶 3 万
吨, 加之每年有上千吨甜叶菊叶片出口, 因此甜叶
菊在种植应用及出口创汇等方面取得了经济效益和
社会效益[8]。目前国内外已报道的甜叶菊研究主要
集中在栽培技术及甜菊糖苷等方面, 而在分子标记
与遗传分析方面的报道甚少, 在一定程度上影响了
甜叶菊在遗传分析、分子辅助育种等方面的研究和
应用。另外, 我国甜叶菊品种多为 80年代初筛选的
国外实生群体品种, 品质不高、病害严重, 迫切需要
培育高产优质的优良品种, 提高原材料质量。因此
需要获得更多多态性丰富、重复性较好、特异性较
强的甜叶菊分子标记, 运用分子标记辅助育种为培
育高产优质的优良甜叶菊品种提供保障。
微卫星 (microsatellite), 又称简单重复序列
(simple sequence repeat, SSR)[9], 是基因组中由 1~6
个核苷酸组成基本单位的多次重复DNA序列, 广泛
且随机存在于基因组中不同位置。微卫星标记在真
核生物基因组中含量丰富且随机分布, 能表现出较
好的稳定性和多态性, 具符合孟德尔遗传规律、呈
共显性、易操作等优点。现已广泛应用于不同物种
的遗传连锁图谱构建、品种鉴定、进化分析、基因
定位、遗传辅助育种、QTL 分析等研究[10-13]。但甜
叶菊微卫星开发进展缓慢, 尚未开展甜叶菊基因组
测序工作, 仅有少量报道关于甜叶菊 EST 数据库应
用的研究。
磁珠富集法作为一种简单高效分离微卫星标记
的方法, 其基本原理是生物素(biotin)标记重复序列
的特异性探针与基因组DNA酶切片段杂交后, 由于
生物素与链霉亲和素(streptavidin)具有强亲和性, 用
包被有链霉亲和素的磁珠进行磁力吸附可以完成
全基因组 DNA 酶切片段中含有重复序列片段的富
集[14-15]。本研究利用生物素标记的(AG)15 寡核苷酸
探针, 成功地构建了甜叶菊微卫星富集文库, 并筛选
出具有较高多态性的微卫星标记, 为今后甜叶菊遗
传多样性分析、遗传连锁图谱构建、品种鉴定、标记
辅助育种、QTL分析等提供了有效的分子遗传标记。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选用具大叶的 Lil/守田 2 号杂交种, 其命名为
177-11; 另选 24 个甜叶菊品系用于多态性位点的筛
选(表 1)。表中具有相同名称的甜叶菊材料来自同一
原始材料, 但在种植过程中发生了较大的性状变异,
本试验中这些具有不同性状变异、但名称相同的甜
叶菊材料标以不同品系编号以示区分。将所有材料
种植于浙江大学试验基地 , 取幼嫩叶片保存于
–80℃冷藏箱。
1.2 甜叶菊微卫星富集文库构建和阳性克隆筛选
1.2.1 基因组 DNA 的提取与酶切 采用 Doyle
等[16]的方法提取甜叶菊幼嫩叶片基因组 DNA, 利用
限制性核酸内切酶 Sau3AI (康为世纪)酶切基因组
DNA, 用 PCR 产物纯化试剂盒(康为世纪)纯化酶切
产物。
1.2.2 接头连接与接头产物扩增 将相同浓度的
单链寡核苷酸 Oligo A (5′-GATCGTCGACGGTACC
GAATTCT-3′)和 Oligo B (5′-GTCAAGAATTCGGT
ACCGTCGAC-3′)等比例混合 , 使其终浓度为
10 μmol L–1, 95℃变性 3 min后, 自然冷却至室温形
成具有黏性末端的接头。用 T4 DNA连接酶(上海生
工)连接接头与酶切片段, 16℃连接过夜。以接头连
接产物为模板, Oligo B为引物进行 PCR扩增后, 用
PCR产物纯化试剂盒(康为世纪公司)纯化产物。
1.2.3 磁珠富集微卫星序列 将 0.6 mL 链霉亲
和素顺磁颗粒(Promega 公司)用 1 mL TEN100 (10
mmol L–1 Tris-HCl, 1 mmol L–1 EDTA, 100 mmol L–1
NaCl, pH 7.5)冲洗磁珠 3次后, 悬于 70 μL TEN100
中。采用生物素标记探针(AG)15与 PCR扩增产物杂
交。将杂交溶液置 95℃加热 5 min, 迅速冷却至低于
第 3期 秦海峰等: 甜叶菊微卫星富集文库的构建与多态性标记的筛选 449
表 1 24份不同地区甜叶菊品系编号及表型性状
Table 1 Line number of 24 Stevia rebaudiana lines from different areas and their phenotypic traits
序号
No.
编号
Code
原始材料名称
Raw material name
类型
Type
叶型
Leaf type
抗病性
Resistance
花期
Florescence
1 7009 高 A3/守田 2号 Gao A3/Shoutian 2 RA 小 Small 强 Strong 迟 Late
2 7026 高 A3由 Gao A3 you RA 小 Small 弱 Feeble 迟 Late
3 7034 宿州 2号 Suzhou 2 RA 小 Small 强 Middle 迟 Late
4 7037 宿州 2号 Suzhou 2 RA 小 Small 中 Middle 中 Middle
5 7066 南京 158由 Nanjing 158 you TG 大 Big 中 Middle 早 Early
6 7067 南京 158由 Nanjing 158 you TG 大 Big 中 Middle 中 Middle
7 7071 南京 158 Nanjing 158 TG 大 Big 中 Middle 早 Early
8 7072 南京 158 Nanjing 158 TG 大 Big 中 Middle 中 Middle
9 7090 安徽李国 1号 Anhuiliguo 1 TG 小 Small 强 Strong 迟 Late
10 7104 南京 158 Nanjing 158 ST 大 Big 弱 Strong 早 Early
11 7110 鲁引 1号 Luyin 1 ST 大 Big 强 Strong 中 Middle
12 7111 绿玉 131 Lüyu 131 ST 小 Small 弱 Feeble 中 Middle
13 7122 守田 2号 Shoutian 2 RA 小 Small 弱 Feeble 早 Early
14 7123 守田 2号 Shoutian 2 RA 小 Small 强 Strong 早 Early
15 7134 安徽李国 1号 Anhuiliguo 1 RA 中 Middle 强 Strong 早 Early
16 7137 绿玉 131 Lüyu 131 RA 小 Small 中 Middle 中 Middle
17 7140 高 A3 Gao A3 RA 小 Small 弱 Feeble 中 Middle
18 7144 W4 RA 小 Small 强 Strong 中 Middle
19 7147 守田 3号 Shoutian 3 RA 小 Small 强 Strong 迟 Late
20 7148 守田 3号 Shoutian 3 RA 小 Small 中 Middle 早 Early
21 7149 守田 3号 Shoutian 3 RA 中 Middle 中 Middle 早 Early
22 7150 守田 3号 Shoutian 3 RA 小 Small 中 Middle 早 Early
23 7155 守田 3号 Shoutian 3 RA 大 Big 弱 Feeble 中 Middle
24 7173 南京 158 Nanjing 158 TG 大 Big 中 Middle 早 Early
RA: 瑞鲍迪甙 A; ST: 甜菊甙; TG: 总糖甙。RA: rebaudioside A; ST: stevioside; TG: total glycoside.
Tm值 5~12℃下杂交 20 min, 室温放置 15 min。将杂
交溶液加入到制备的磁珠中, 并加入 300 μL TEN100
(pH 7.5), 室温放置 30 min。对杂交后磁珠依次用
400 μL TEN1000 (10 mmol L–1 Tris-HCl, 1 mmol L–1
EDTA, 1 mol L–1 NaCl, pH 7.5)、400 μL 0.2×SSC+
0.1% SDS、400 μL 1×SSC于室温下各洗涤 3次, 每
次 5 min。最后用 80 μL TE (pH 8.0)重悬磁珠, 于
95℃下变性 10 min, 以磁力架固定磁珠, 吸出含
有微卫星单链 DNA片段的上清液备用。
1.2.4 构建克隆与克隆筛选 通过 PCR 将富含
微卫星的单链 DNA片段恢复成双链, 建立 50 μL反
应体系含富含微卫星单链 DNA溶液 5 μL、10 μmol
L–1 Oligo B 3 μL、10×PCR buffer 5 μL、10 mmol
L–1dNTPs 1 μL、25 mmol L–1 Mg2+ 3 μL、Taq DNA
Polymerase (上海生工) 7.5 U, 灭菌 ddH2O 补足
50 μL。反应程序为 94 30 s, 55 40 s, 72 50 s, ℃ ℃ ℃
共 33个循环; 72 20 min℃ 后, 用 PCR产物纯化试剂
盒(康为世纪)纯化 PCR产物。采用康为世纪 T载体试
剂盒将 PCR 产物与 pUC-T 连接, 并转化到高效感受
态细胞 DH5α中, 即构建成甜叶菊微卫星富集文库。
经蓝白斑初筛选后, 挑取白色单菌落接种到含
有 0.1 mg mL–1 Amp的 LB液体培养基中, 37℃培养
过夜。以菌液为模板, 以 Oligo B及微卫星核心序列
(AG)8为引物进行菌液 PCR筛选。用 1.5%的琼脂糖
凝胶电泳检测 PCR 产物, 将阳性克隆送到桑尼公司
测序。
1.3 序列分析、引物设计及多态性筛选
测序序列在 chromas 软件 (http://www.bioon.
com/Soft/Class1/Class7/200408/205.html)上进行峰图
分 析 , 用 DNAstar 软 件 (http://www.bbioo.com/
download/58-241-1.html)查找载体和接头并将其去
除 , 使用 SSR Hunter 软件 (http://www.bbioo.com/
download/58-255-1.html)查找微卫星位点, 筛选重复
次数≥5 的测序序列, 并记录下序列的核心序列构
450 作 物 学 报 第 40卷
成。对含有微卫星序列且侧翼序列足够长的 DNA序
列使用 Premier Primer 5.0 软件(http://www.bbioo.
com/download/58-166-1.html)设计引物, 由上海生工
合成。
将设计好的微卫星特异性引物以甜叶菊品系
177-11 基因组 DNA 为模板, 进行 PCR 最佳退火温
度的筛选, 用 8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增
产物, 记录每对引物带型情况以及最佳退火温度。
1.4 多态性数据分析
利用24个甜叶菊品系对设计出的特异性微卫星
引物进行多态性筛选。利用分析软件 PopGene32
(http://www.seekbio.com/soft/1059.html)处 理 数 据 ,
计算各位点的等位基因数 (Na)、有效等位基因数
(Ne)、等位基因频率、观测杂合度(Ho)、期望杂合度
(He)、Hardy-Weinberg 平衡卡方检验(P 检验)等。根
据 Botstein 等[17]计算多态性信息含量(polymorphism
information content, PIC)的方法, 用 PIC-CAL 软件
计算每个微卫星位点的 PIC 值。采用 NTSYS-pc2.1
软件 (http://ishare.iask.sina.com.cn/f/7592245.html)对
24个甜叶菊品系进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 富集片段克隆及测序
从(AG)15构建的富集文库中挑取 354 个白色单
菌落, PCR检测阳性克隆, 其中共有 158个(44.63%)
克隆产生了 2 条或 2 条以上的扩增条带, 表明这些
克隆可能含有微卫星序列。对这些阳性克隆测序 ,
通过 SSRHunter 软件搜索微卫星位点, 结果显示其
中 134 个克隆含有微卫星序列, PCR 筛选微卫星序
列的准确率为 84.81%, 微卫星富集率为 37.85%。
在核心序列组成上, 微卫星核心序列(AG)n 在
134 条含有微卫星的序列中含量最高为 87.31%, 另
外还检测到 (AC)n、 (AT)n、 (GATC)n、 (ACGT)n、
(ATGC)n、(CATG)n、(AGAAG)n 等核心序列类型。
在碱基构成类型上仅检测到二碱基、四碱基和五碱
基的微卫星构成类型, 未发现三碱基微卫星构成类
型。所有序列中 , 重复次数 <10的序列有 96个
(71.64%), 重复次数为10~20的序列有28个(20.90%),
>20次的有10个(7.46%)(表2)。依据Weber [18]提出的分
类法对开发出的微卫星统计 , 结果显示完美型
(perfect)微卫星序列 85个 (63.43%)、非完美型
(imperfect)微卫星序列 15个 (11.19%)、混合型
(compound)微卫星序列34个(25.38%)(表3)。
2.2 引物设计及优化
通过对 134 个含有微卫星的序列设计引物, 除
侧翼太短和相似度高的序列外, 使用 Premier Primer
5.0软件共设计出引物 71对。通过甜叶菊品系 177-11
对 71对引物进行 PCR筛选后发现, 有 62对引物能
够呈现特异性条带。用 24个甜叶菊品系对 62 对引
物进行多态性分析, 共筛选到 16对具有良好多态性
的引物, 可作为甜叶菊分子标记使用(表 4)。
2.3 微卫星位点的多态性分析
通过24个甜叶菊品系对16对具有良好多态性引物
的分析, 共获得72个等位基因, 等位基因数在2~8之间,
平均每个位点扩增得到4.5个等位基因, 对多态性信息
含量(PIC)的分析表明, 其 PIC值介于0.3613~0.7595之
间。根据 Botstein等[17]的分类方法, 有9个位点(58.8%)
的 PIC 值高于0.50, 显示出较高多态性; 有7个位点
(41.2%)的 PIC值介于0.25~0.50, 显示出中度多态性。
分析发现, 观测杂合度(Ho)在0.2174~0.9167之间, 期
望杂合度(He)在0.3555~0.8076之间。经 Hardy-Weinberg
平衡卡方检验, 有5个位点显著偏离 Hardy-Weinberg
平衡(表5)。总体表明筛选得到的16对甜叶菊微卫星引
物具有良好的多态性。
表 2 甜叶菊微卫星富集文库中序列类型比例
Table 2 Sequence type ratio of Stevia rebaudiana microsatellite enriched library (%)
碱基构成 Base composition 核心序列类型 Core sequence type
二(2) 四(4) 五(5)
(AG)n (AC)n (AT)n (GATC)n (ACGT)n (ATGC)n (CATG)n (AGAAG)n
87.31 11.94 0.75 66.42 19.40 1.49 1.49 4.48 3.73 2.24 0.75
表 3 甜叶菊微卫星重复类型
Table 3 Type of Stevia rebaudiana microsatellite repeats
重复数 Repeat number 序列
Sequence
完美型
Perfect repeat
非完美型
Imperfect repeat
混合型
Compound repeat 5≤SSR<10 10≤SSR<20 SSR≥20
个数 Number 85 15 34 96 28 10
百分比 Percentage (%) 63.43 11.19 25.38 71.64 20.90 7.46
第 3期 秦海峰等: 甜叶菊微卫星富集文库的构建与多态性标记的筛选 451
表 4 甜叶菊微卫星分子标记信息
Table 4 Information of Stevia rebaudiana microsatellite molecular markers
位点名称
Locus name
核心序列
Core sequence
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
退火温度
AT (℃)
序列大小
Size (bp)
AG-R3 (GA)11(GA)5(GA)20 F: TATTCATTGACCCCTCACCTT;
R: ATCTAGTCTTAAATCCCACAT
51.0 210
AG-R6 (AG)15(GA)22 F: CGATACTACCGAACAGACCAC;
R: ATCTAATCTTAAACCCCACAT
49.0 153
AG-R9 (CT)18 F: GAAGCTGGTACTCCATCCTCA;
R: GTCATTTTAGTTACCGTTTATTG
49.0 110
AG-R11 (GT)5(GA)14 F: AGAAAGAGGCGTAAAGGTATG;
R: AGCTGGTACTCCATCCTCATA
51.0 105
AG-R14 (GA)12 F: AACGGAGATGGTGAAATGGAG;
R: TTTGGAGATTGAGGTCGGTAT
54.0 262
AG-R15 (GT)5(GA)14 F: AGAAAGAGGCGTAAAGGTATG;
R: AGCTGGTACTCCATCCTCATA
54.0 105
AG-R18 (CT)11 F: ATCCCTAATGAAAGAGGTGAG;
R: TAGCAAAGAAGTATGATGAGAAC
51.0 98
AG-R21 (TC)11(ATGC)5 F: CACCACTCATCGTCTTCACCG;
R: TGTTTGTCGACGTGGGTTTTG
55.0 102
AG-R23 (CT)6 F: TCGGTTAATCGCAAGTTCTAC;
R: CCCTCACATCATTTACCCATA
52.3 253
AG-R27 (TC)5(CT)9 F: ATCTCACGACGACCGAAACGA;
R: AACTTGATGGTGGCGAACGAC
55.0 313
AG-J38 (AG)9(GA)5 F: TAACTTGATGGTGGCGAACGA;
R: TATCTCACGACGACCGAAACG
54.3 315
AG-J46 (CT)6 F: AATGGGTTTGAGGGAAGG;
R: GGCGAGGAGTAAGCGAGA
50.0 133
AG-J50 (GA)5 F: AATGAAGAACAAAGGAGAAAAC;
R: TTCCTACTTAACCCACTACCC
51.0 155
AG-J59 (CT)7 F: CACATTTCACCCCACTAC;
R: GAGGTTTTAGGCTTGTAC
50.0 132
AG-J63 (CT)9 F: AACCGACTCCATGATACAATT;
R: GATACTACCGAACAGACCACC
50.3 202
AG-J69 (TC)5 F: ATGACAGCCACTATCTTCCTC;
R: GTGTTTTGTGAGCTTCCTTTG
51.0 278
AT: annealing temperature.
2.4 基于位点信息的聚类分析
利用 NTSYS-pc 2.1软件, 以遗传相似系数 0.68
为阈值, 将 24个甜叶菊品系分为两大类(图 1), 基本
上是按照叶形区分的。同时, 按照材料中总糖甙含
量(total glycoside, TG)以及瑞鲍迪甙 A (rebaudioside
A, RA)和甜菊甙(stevioside, ST)的不同, 可将全部供
试材料分为 TG类与 RA和 ST两大类型。
3 讨论
3.1 微卫星文库构建
目前微卫星分子标记被广泛应用于遗传学和生
物进化等方面, 由于微卫星在真核生物基因组中广
泛且随机分布 , 能表现出较好的稳定性和多态性 ,
另外符合孟德尔遗传规律、呈现共显性、易操作等
优点, 使其近年来被广泛应用, 但不同物种中微卫
星出现的频率差异较大, 在植物整个基因组中, 最
为普遍的二核苷酸重复单位是(AT)n、(AC)n和(AG)n。
由于 SSR 分子标记为特异性引物, 所以设计引
物须在物种DNA序列已知情况下进行, 在应用研究
上花费较大, 一定程度上阻碍了其运用[19]。至今对
甜叶菊基因组尚未开展测序工作, 仅在 EST 数据库
方面有少量报道。Brandle等[20]通过构建甜叶菊叶片
cDNA 文库, 得到5548条甜叶菊 EST 序列, 并对其
分析和注释 , 但未进行微卫星标记研究。Brandle
等 [20]构建的甜叶菊 EST 数据库为甜叶菊微卫星标
记的开发奠定了重要基础, 朱琼琼[21]通过搜寻甜叶
菊 EST 数据库, 从5573个非冗余序列中筛选出含有
SSR 的 EST 序列, 获得重复次数大于5的序列261
452 作 物 学 报 第 40卷
表 5 甜叶菊 16个位点多态性分析
Table 5 Analysis of 16 polymorphic loci of Stevia rebaudiana
多态性位点信息 Polymorphism site information 位点名称
Locus name Na Ne Ho He PIC P-test
AG-R3 6 4.7081 0.8750 0.8076 0.7595 0.2169
AG-R6 7 3.1302 0.8696 0.6957 0.6434 0.3804
AG-R9 5 3.3488 0.7917 0.7163 0.6856 0.8438
AG-R11 8 3.8919 0.7083 0.7589 0.7096 0.4352
AG-R14 4 2.9304 0.6000 0.6756 0.5938 0.0536
AG-R15 6 3.8195 0.7826 0.7546 0.6939 0.5746
AG-R18 5 2.2027 0.8333 0.5576 0.4680 0.1274
AG-R21 4 1.8580 0.3636 0.4725 0.4197 0.2557
AG-R23 2 1.8824 0.7500 0.4787 0.3589 0.0001*
AG-R27 3 2.2559 0.2174 0.5691 0.4584 0.0002*
AG-J38 5 3.8919 0.6667 0.7589 0.6970 0.3059
AG-J46 3 1.5437 0.4167 0.3555 0.3163 0.4938
AG-J50 2 1.9862 0.9167 0.5071 0.3732 0.0000*
AG-J59 5 2.9614 0.5833 0.6764 0.6144 0.1578
AG-J63 3 2.2812 0.7917 0.5736 0.4821 0.0151*
AG-J69 4 2.8166 0.4167 0.6587 0.5878 0.0000*
*表示偏离 Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)的位点。* is deviating from Hardy-Weinberg balance site.
图 1 甜叶菊 24个品系聚类图
Fig. 1 Clustering map of 24 Stevia rebaudiana lines
个, 共设计 EST-SSR引物 58对; 利用 EST-SSR标记
对 F1群体筛选分析后, 仅有 6个 EST-SSR标记可用
于遗传图谱的构建。由于至今甜叶菊已知序列还很
有限, 同时 EST 数据库中包含的微卫星标记有很大
的局限性, 不能从已有的DNA数据库中分离出大量
具有良好多态性的微卫星位点, 所以运用独特的方
法来发掘甜叶菊微卫星序列是必要的。
磁珠富集法是目前开发微卫星标记的一种简便
高效的方法。本试验采用磁珠富集法 , 结合
(AG/TC)15探针构建了甜叶菊微卫星富集文库。在应
用磁珠富集微卫星的过程中, 很多因素都可能最终
影响到微卫星的筛选效率 [22], 高纯度基因组 DNA
第 3期 秦海峰等: 甜叶菊微卫星富集文库的构建与多态性标记的筛选 453
是试验的前提保证, DNA 浓度、接头连接效率、富
集过程中杂交温度以及洗脱条件的控制都是重要影
响因素[23], 另外磁珠平衡质量对成功开发微卫星标
记也会产生重要影响[24]。
本试验从甜叶菊富集文库中挑取354个单菌落,
经过初次筛选后得到158个阳性克隆 , 测序后发现
其中134个克隆含有微卫星序列, PCR筛选微卫星序
列的准确率达到84.81%, 微卫星富集效率为37.85%,
均高于 Hye等 [22] 鲀开发绿鳍马面 的效率 (45%与
21.5%), 本试验所用方法能够很好地开发甜叶菊微
卫星标记。在筛选得到的序列中, 66.42%序列的核心
为 (AG/TC)n, 同时还检测到 (AC/TG)n、 (AT/TA)n、
(GATC)n、(ACGT)n、(ATGC)n、(CATG)n、(AGAAG)n
等核心序列类型。朱琼琼[21]从甜叶菊 EST数据库筛
选出30种不同的核心序列类型, 其中以(AG/TC)n 为
多, 这说明甜叶菊基因组中存在着大量不同类型的
微卫星序列可供利用。但在这些序列中, 仅检测到
了二、四、五核苷酸构成类型, 未检测到三核苷酸
构成类型。朱立静等[25]在筛选西施舌微卫星标记时
也发现这种状况。其原因可能是抽样测序克隆较少,
不能完全反映甜叶菊微卫星的分布情况, 也可能与
检测片段来自基因组不同位置有关。
3.2 微卫星位点多态性评价
不同生物微卫星的重复次数比例各有不同, 郭
昱嵩等[26]从勒氏笛鲷基因组文库中筛选微卫星, 重
复次数分布在 7~15之间的约占 80.80%。贾小东等[27]
从藏酋猴中分离微卫星, 重复次数在 15~24 的约占
60.20%。朱琼琼[21]对甜叶菊 EST 数据库进行筛选,
微卫星重复次数在 10次以下的序列占 91.70%, 而介
于 5~6次的序列为 67.30%。表明不同研究者从不同
物种微卫星文库中所分离得到的微卫星结果不一样,
这可能与物种基因存在较大差别或对测序克隆的代
表性有关。本试验开发出的微卫星, 初次筛选后发
现 28.36%的序列微卫星重复次数达到 10次以上, 其
中重复数最多的为 AG-R6, 其重复次数达到 37 次;
而 71.64%的序列的微卫星重复次数介于 5~10 之间,
高于朱琼琼[19]开发甜叶菊 EST-SSR的效率。高焕等[28]
研究表明微卫星重复拷贝数与多态性是有一定关系
的, 较高拷贝数的位点, 其多态性较高。贾舒雯等[29]
在研究脊尾白虾时也发现, 核心序列重复次数与微
卫星位点多态性相关, 核心序列的重复次数较多的
微卫星序列, 表现出高多态性。Weber[18]认为二碱基
核心序列重复次数大于 12时, 才可能表现高多态性,
本研究中有 9个位点核心序列重复次数达到 12次以
上, 都表现出良好多态性, 而核心序列重复次数低
于 12次的位点也发现具有多态性。
Squirrell等 [30]对1997—2003年微卫星标记开发
的情况统计发现 , 平均24.10%的引物具有多态性 ,
17.70%的引物无多态性, 19.50%的引物无法扩增出
条带。Smulders 等[31]在研究番茄时发现, 较长的微
卫星序列变异程度更高, 从而在物种间与物种内都
有良好的多态性。所以需要对开发出的引物进行多
态性的筛选 , 尽量筛选重复次数较多的微卫星标
记。本试验筛选开发出71对引物, 得到16个多态性
良好的微卫星位点 , 占开发得到引物总数的
22.54%, 筛选出的引物多态性比例与 Squirrell等的
结论相近。
等位基因数表示某位点在遗传进化过程中的遗
传变异程度, 某个位点的等位基因数越多, 说明该
物种在进化过程中在此位点上的遗传变异积累越大,
这有利于物种在自然界中的进化[32]。本试验开发的
16 个位点的等位基因数介于 2~8 之间, 平均每个位
点获得等位基因数 4.5个, 显示了良好的多态性, 在
AG-R23 与 AG-J50 位点仅检测到 2 个等位基因, 这
与位点微卫星重复次数不高有很大关系。
多态性信息含量(PIC)是衡量基因变异程度的重
要指标, 能反映出某个标记所包含或提供的遗传信
息容量。多态性信息含量越大, 在一个群体中该座
位杂合子比例会越大, 提供的遗传信息就越多[33]。
PIC>0.50 的座位为高度多态座位, 该位点可以提供
丰富的遗传信息; 0.25
PIC<0.25 的座位为低多态性座位, 该标记可提供的
遗传信息较差[34]。本研究中 16个微卫星位点 PIC值
在 0.3613~0.7595 之间, 其中 9 个位点(PIC>0.50)可
提供丰富的遗传信息、7个位点(0.25
勤超等 [35]开发的黄颡鱼微卫星位点的 PIC 平均值
0.5511。显然本实验所筛选出的 16个甜叶菊微卫星
位点多态性信息含量丰富, 可为甜叶菊遗传分析提
供有效依据。
杂合度是反映群体遗传多样性高低的主要参数,
群体的杂合度高, 表明该群体的遗传变异大, 群体
遗传多样性高。筛选出的 16个甜叶菊微卫星位点的
观测杂合度 (Ho)和期望杂合度 (He)分别介于
0.2174~0.9167 和 0.3555~0.8076 之间, 平均观测杂
454 作 物 学 报 第 40卷
合度(Ho)为 0.6615, 平均期望杂合度(He)为 0.6261,
观测杂合度(Ho)与期望杂合度(He)较为符合, 表明甜
叶菊群体遗传变异较大, 杂合度较高, 可为甜叶菊
品系提供一定种质资源。
Hardy-Weinberg平衡会受人为干扰、自然选择、
种群的不完全随机交配、近亲交配及迁移等多种因
素的影响[36]。经 Hardy-Weinberg平衡检验, 11个微
卫星位点的 P检验值>0.05, 说明其观测杂合度和期
望杂合度之间没有显著差异, 处于 Hardy-Weinberg
平衡(P>0.05); 其中 AG-R23、AG-R27、AG-J50、
AG-J63、AG-J69 等 5 个位点偏离 Hardy-Weinberg
平衡(P<0.05), 这可能由于甜叶菊为多年生植物, 每
生长 1~2 年需要移栽或重新选育, 品系间存在自然
杂交或产生品系中杂交假植株, 导致基因频率变化,
偏离 Hardy-Weinberg平衡。
3.3 种间进化分析
遗传多样性是生物多样性的基础也是研究生物
多样性的核心内容, 了解种内遗传变异的与环境关
系, 对于遗传多样性研究有重要帮助, 进而为遗传
改良提供保障。本试验将 24个甜叶菊品系聚为两大
类, 第一类为小叶、中叶为主的甜叶菊材料, 共 17
份, 其中 7150与 7104两份材料为大叶品系; 第二类
全为甜叶菊大叶材料, 共有 7 份。在小叶和中叶甜
叶菊的聚类中出现的两份大叶材料, 可能与产地有
关, 其中大叶材料 7150与小叶材料 7148和 7149的
原始材料都是守田 3号, 故其遗传相似度较高。另外
材料 7037与 7034, 7123与 7122有很高的相似度, 猜
测可能是同一个品系。从来源地分析发现, 部分符
合地区一致性, 能聚类到一组, 有个别材料通过来
源地聚类发生偏离, 如材料 7009 与守田 3 号材料,
这可能由于一些材料受多年的自然选择以及地域环
境的影响, 发生了一定程度的变异。这种变异可增
加甜叶菊品系的多样性, 为甜叶菊品系的改良与选
育提供种质资源。
根据 24 个甜叶菊品系在 RA、ST、TG 含量上
的不同, 可将材料分成以 TG为主的大类与以 RA和
ST为主的大类。以 TG为主大类为总糖甙含量大于
13%, 其中 5 份表现为 TG 类型, 仅有 7155 与 7110
两份材料分别表现为 RA 与 ST 类型。以 RA 和 ST
为主大类为 RA 或 ST 含量均大于 7%的材料, 总共
有 17份材料, 有 14份表现出 RA类型, 2份表现出
ST类型, 仅有 7090材料表现为 TG类型。通过糖甙
含量分类可以发现, RA、ST、TG含量与叶型可能有
着一定的相关性, 小叶、中叶材料多为 RA和 ST含
量较高的品系, 大叶材料多是 TG含量较高的品系。
这一聚类结果一方面可能与选用材料本身局限性相
关 , 所用材料尚不能完全涵盖所有材料表型性状 ;
另一方面本实验开发的 16个微卫星标记全为 AG系
列标记, 在甜叶菊基因组中还存在着大量其他类型
的微卫星标记, 运用这 16个标记进行品系聚类的代
表性有限, 造成了聚类基本按照叶型区分品系的现
象, 尚需进一步搜索更多的甜叶菊材料并进一步开
发更多甜叶菊分子标记进行相关研究。
4 结论
构建了甜叶菊全基因组微卫星富集文库, 提出
了一种适合甜叶菊微卫星开发的新方法。通过富集
文库筛选, 选取合适的富集序列设计引物, 共合成
71对微卫星引物并筛选其多态性, 获得特异性强、
多态性良好的微卫星位点16个, 为今后揭示甜叶菊
品系多样性、构建遗传图谱、分子标记辅助育种、
QTL 定位等研究工作提供了有效的遗传基础。基于
16个微卫星位点多态性信息构建了24个品系的聚类
图, 初步揭示了各品系间的遗传关系。
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