全 文 ：武汉植物学研究 1999, 17 (4) : 289～ 296
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
基因枪介导的籼稻遗传转化及外源基因
在受体中的遗传研究Ξ α
陶利珍1　凌定厚1　张世平2　C laude Fauquet2
(1 中国科学院华南植物研究所　广州　510650)
(2 IL TABöT SR I2ORSTOM 2Scripp s Research Institu te, D ivision of P lan t B io logy,
10666 N o rth To rrey P ines Road- M RC7, L a Jo lla, CA 92037,U SA )
提　要　由来自水稻成熟胚的愈伤组织或由此而建立的悬浮细胞系作基因枪转化的靶材料,
将质粒 p IL TAB 227 (含 hp h 基因和 g us 基因) 导入籼稻, 在Basm ati21、青油粘、新山粘 29、胜
优 2 号, 明恢 63 等品种获得了转基因植株。T 0 转化体 g us 基因组织化学染色和DNA 分子杂
交 (Sou thern b lo t) 证实, g us 和 hp h 基因已整合到上述品种的基因组中。本实验仔细研究了
hp h 基因在Basm ati21 的 T 1、T 2 和 T 3 等各个世代的遗传及表达。对 T 1 家系中各个体核DNA
的分子检测表明, hp h 基因普遍呈 3∶1 的分离 (转基因阳性∶阴性) , 表明 hp h 基因为单一位
点的整合, 其遗传符合单 (显性)基因控制的孟德尔遗传规律。还发现一些株系表现 1∶1 的不
正常的分离 (阳性个体较预期的少) , 推测这是由于雌或雄配子之一方的 hp h 基因受到抑制而
产生基因沉默的结果。在 T 2、T 3 世代获得了具 hp h 基因的纯合体。笔者还探讨了外源基因在
核基因组中的遗传稳定性及基因的沉默与活化问题。
关键词　籼稻, 转化, 稳定遗传, 基因抑制
水稻是世界上主要的粮食作物, 栽培稻中籼亚种的种植面积约占栽培稻全部种植面积的 80% 左
右〔1〕。传统的作物育种方法对水稻的改良作出了很大贡献, 然而遗传工程对水稻的改良提供了更为先进
的方法。作为遗传转化方法较为成功的有 PEG 介导 (或电激) 原生质体转化法〔2, 3〕; 幼胚、愈伤组织和悬
浮细胞系基因枪转化法〔4～ 6〕; 农杆菌介导法〔7, 8〕; 电激成熟胚〔9〕等。在水稻的遗传转化方面, 和粳稻相比,
籼稻的难度较大, 成功地获得可育转基因植株并对外源基因的遗传稳定性及表现规律方面的报道并不
多见。外源基因整合后在受体中能否稳定遗传, 乃是人们关心的重要问题。本文报道外源基因 hp h 在水
稻转基因植株之 T 1、T 2 和 T 3 各世代的遗传行为、表达、及其相应的规律。
1　材料和方法
(1) 品种: 供试的籼稻品种有 26 窄早、闽 129、青油粘、明恢 63、胜优 2 号、新山粘 29、新七 1 号、Bas2
m ati21、青二矮及桂朝 2 号等。
(2) 质粒载体: 质粒 p IL TAB 227 含有 uidA (g us)和 hp h 基因, 分别由CaM V 35S 启动子驱动。结构Ξα 助课题部分研究结果。收稿日: 1998207222, 修回日: 1999201209。第一作者: 女, 1965 年出生, 博士, 从事作物遗传育种方面研究国家自然科学基金 (4903566)、广东省自然科学基金 (940396)和美国Rockefiller Foundation (942000120024)资
见图 1。
H ind Ë , Bam H I, H ind Ë . 限制性内切酶
(Restriction endonuclease) ;
CaM V 35S. 启动子 (P romo ter)
图 1　质粒 p ILTAB 227 结构简图
F ig. 1　Construction of p lasm id p IL TAB227
(3) 靶材料: 以愈伤组织及细胞悬浮系为靶材料。愈伤组织来自成熟去壳的种子, 灭菌后去壳的种
子接种于M S 培养基, 添加 2, 42D 210 m göL , 以诱导愈伤组织; 愈伤组织继代增殖后可直接作为靶材料
供基因枪轰击用。在初级愈伤组织中挑选球形的胚性愈伤在 R 2 培养基中作悬浮培养。
(4) 转化: 转化试验采用 PD S21000öH e 基因枪 (B io2R ad 公司) , 根据厂商推荐的条件, 将DNA 与金
粉充分混合, 使DNA 包裹到金粉微粒表面上。靶材料在基因枪轰击前进行高渗透压的预处理, 即悬浮细
胞系继代后 3 d, 转入具高渗透压的 R 2 固体培养基上 (含 30 göL 甘露醇、30 göL 山梨糖醇、30 göL 蔗
糖) ; 预处理 4 h 后, 将盛靶材料的平皿置于静止屏下 8 cm 处进行轰击, 氦气压为 1 100 p si, 每批靶材料
轰击 2 次; 轰击后的靶材料在黑暗条件下继续在高渗透压培养基上作后处理。
(5) 抗性愈伤组织筛选: 按 Zhang 的方法〔6〕轰击, 并在高渗培养基作 16～ 20 h 的后处理后, 将靶材
料转入添加 300 m göL 水解酪蛋白、2 m göL 2, 42D 和 30 m göL 潮霉素B 的NB 或CC 培养基中进行筛
选, 在黑暗条件下 25～ 26℃作筛选培养 2～ 3 周。转化了的细胞由于具 hp h 基因, 对潮霉素B 具有抗性,
在选择压下仍然能长出新愈伤组织。将这些抗性愈伤转到更高浓度的选培养基 (含潮霉素 B 50 m göL )
上作进一步筛选, 2 周后当抗潮霉素 (hy g ) 的抗性愈伤长至 2～ 3 mm (直径) 大时, 将它们转入NB 或CC
培养基 (附加 300 m göL 水解酪蛋白、2 m göL 激动素、1 m göL 萘乙酸、5 m göL 脱落酸和 50 m göL 潮霉
素B、30 göL 蔗糖, 用 0145% 琼脂糖固化)作预分化培养并进行再次筛选。
(6) 植株再生: 经连续 3 次严格地选择后, 绝大多数漏网的假抗性愈伤均被淘汰, 已转化的细胞在
具选择压的预分化培养基能正常而快速地生长。抗性愈伤在预分化培养中再次选择 2 周后, 将快速生长
的抗性愈伤转入植株再生的分化培养基中作分化培养, 培养基为NB 或CC 培养基附加 215 m göL 激动
素、011 m göL 萘乙酸、30 göL 麦芽糖、50 m göL 潮霉素、014 göL 琼脂糖固化。每天 16 h 光照, 培养温度
为 25～ 26℃。再生出的抗性小植株转入生根培养基 (含 1ö2M S 无机盐成分、30 göL 蔗糖、50 m göL 潮霉
素B、011 m göL 萘乙酸和 0126% 植物凝胶固化)以促进根的发生。待苗 8～ 10 cm 高时, 转入水稻营养液
水培 (Yo sh ida 等〔10〕) , 以利根的进一步发育。2 周后将植株转入土壤, 在温室或大田生长成熟。此时所获
得的再生植株称为拟转基因植株。经分子检测证实外源基因已整合到受体的核基因组者称为 T 0 代转基
因植株。
(7) 转基因植株后代分析: g us 基因的组织化学分析根据 Jefferson 等〔11〕的方法进行。转基因植株的
种子 (T 1、T 2、T 3 代) 去壳, 无菌播种于 1ö2 M S 培养基 (无选择压) , 在光照条件下, 培养 6 d 后将幼苗转
入含 50 m göL 潮霉素B 的 1ö2 M S 培养基中进行筛选; 在这一选择压下, 具 hp h 基因的阳性转基因植株
对潮霉素B 具有抗性而能正常生长, 阴性植株则因不具 hp h 基因对潮霉素B 敏感而会死亡。2 周后分别
统计抗潮霉素和敏感的植株数。
(8) 点杂交及 Southern 杂交分析: 根据D ellapo rta 等〔12〕的方法提取叶片组织的总DNA , 点杂交采
用 Sam brook〔13〕的方法。Southern 印迹杂交中, 每个独立转化株叶片DNA 用BamH I, H indË 内切酶消
化。每一植株酶解和未酶解的DNA 各取 10 Λg 在 018% 琼脂糖凝胶上电泳, 2 V öcm 电泳过夜。然后将
DNA 转移到 po sit ively charged 尼纶膜 (Boeh ringer M annheim )。琼脂糖酶 (Boeh ringer M annheim )用作
hp h 基因探针的分离纯化, 用随机引物标记试剂盒 (P rom ega) Α232P2dCT P 标记, 进行杂交。洗膜及 X 光
片放射自显影根据 Sam brook〔13〕的方法进行。
092 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 17 卷　
2　试验结果
2. 1　抗性愈伤的选择和植株再生
供试的 10 个籼稻品种中除青二矮、桂朝 2 号, 其它 8 个品种都能在 6～ 10 周建立结构良好的可供
基因枪轰击用的胚性悬浮细胞系 (图版É: 1 )。愈伤组织或悬浮细胞系在基因枪轰击后继续保持在高渗
培养基上 16～ 20 h, 然后直接转入选择培养基 (NB 或CC 培养基包含 30 m göL 潮霉素B ) , 2～ 3 周后可
见到靶组织上长出新的抗性愈伤。然后在 50 m göL 潮霉素B 选择压力下连续选择 2 次, 为了提高植株的
再生频率, 第 3 次选择是在预分化培养基上培养 2 周 (图版É: 2)。为了证实是否已发生了转化, 在试验的
不同时期, 挑选抗性愈伤及拟转基因植株的叶片进行 GU S 活性的组织化学染色, 观察到检测的组织呈
现兰色的转化效果 (图版É: 4～ 6)。图版É: 3 显示生根培养基对再生小植株促进根的发生的良好作用。表
1 显示本实验的转化效果。从表 1 可知, 在Basm ati21、青油粘、新山粘 29、胜优 2 号, 明恢 63 等 5 个籼稻
品种中共获得 39 个独立的拟转基因植株。5 个品种之靶组织对抗性愈伤 (抗 50 m göL 潮霉素B )的转化
效率, 高的可达到 3013% , 低的为 1101% ; 抗性愈伤的植株再生频率高的可达 50% , 低的也有 1514%。
除闽 129、26 窄早两品种外, 其他供试品种均获得了抗性再生植株 (表 1)。闽 129、26 窄早在培养基加入
选择压力之后, 愈伤组织迅速褐化, 完全抑制了生长; 而新七粘 1 号, 获得了再生小植株, 并在再转入
1ö2 M S (含 50 m göL 潮霉素B)培养基作进一步筛选及诱导根的发生时夭折, 最终没有再生成完整的小
植株。
表 1　籼稻不同品种基因枪法之转化频率的比较
T able 1　Comparison of transfo rm ation2frequency in differen t variet ies of
Ind ica rice by part icle bom bardm ent
品种
V ariety
靶组织
T arget
t issue
轰击数
N o. of
bom bard
抗性愈伤数 N o. of callus
筛选次数 N o. of selection
1 2 3
抗性愈伤频率
% of
resistan t
calli
转化植株数
N o. of
transgen ic
p lan t
转基因植株频率
F requency of
transgen ic
p lan t (% )
Basm ati21 愈伤 370 301 95 25 12
愈伤 162 68 10 4 2
愈伤 91 84 28 15 8
合计 To tal 623 453 133 44 7. 06 22 50 　
青油粘Q ingyouzhan 悬浮系 103 60 40 26 9
悬浮系 105 70 37 20 2
合计 To tal 208 130 77 46 22. 12 11 17. 46
新山粘29 X inshanzhan 29 悬浮系 472 126 76 26 5. 51 4 15. 38
胜优二号 Shengyou 2 悬浮系 396 204 48 4 1. 01 1 25. 00
明恢63 M inghu i 63 悬浮系 214 30 9 5 2. 34 1 20. 00
　抗性愈伤频率 (% ) = 轰击靶组织数ö抗性愈伤数×100; 转基因植株频率 (% ) = 抗性愈伤数ö转基因植株数×100。
　F requency of resistan t callus (% ) = N o. of target t issue bom bardöN o. of resistan t callus×100;
　F requency of transgen ic p lan t (% ) = N o. of callusöN o. of transgen ic p lan t×100.
2. 2　转基因水稻植株当代 (T0)的D NA 分子检测
对Basm ati21、青油粘和新山粘 29 等 3 个品种之独立转化体当代 (T 0) 的核DNA 进行了 hp h 基因
Southern 杂交分析, 以 116 kb 含 hp h 基因的片段为探针, Sou thern 杂交结果证实了 hp h 基因整合进水
稻的核基因组。图 2: A ,B 显示了部分转化体分子分析的结果。由图 2: A ,B 可知, hp h 基因在基因组中有
不同整合样式。转化体B 22,Q ing21,Q ing22,Q ing23 hp h 基因为单拷贝插入, 未发现有 hp h 基因的重排;
多数转化体B 24,B 213,B 214, X in21, X in22 有大于 116 kb 高分子条带, 这表明外源基因 hp h 整合到水稻
基因组时质粒的BamH É、H indË 的限制酶切位点发生改变。
192　第 4 期　　　　　　陶利珍等: 基因枪介导的籼稻遗传转化及外源基因在受体中的遗传研究
A. 1. 阳性对照, 质粒 (p IL TAB227) DNA ; 2. 阴性对照 (未转化 Basm ati21 植株的 DNA ) ; 3～ 10. 未酶切及酶切
Basm ati21 之 4 株独立转基因植株 (B24、B22、B213、B214)的DNA ;
B. 1. 阳性对照, 质粒 (p IL TAB227)DNA ; 2. 阴性对照 (未转化青油粘植株的DNA ) ; 3. Q ing21 (青油粘) 酶切DNA ;
4, 5. Q ing22 (青油粘) 酶切DNA ; 6. Q ing23 (青油粘) 酶切DNA ; 7. 阴性对照 (未转化新山粘 29 植株的DNA ) ; 8, 9.
新山占 29 的 2 株独立转基因植株 (X in21, X in22)之酶切DNA ; 10, 11. X in21 及Q ing23 未酶切DNA
A. 1. Po sit ive con tro l (p lasm id p IL TAB227)DNA ; 2. N egative con tro l (DNA from untransfo rm ed Basm ati21) ; 3～
10. U ndigested and digested DNA of four independen t transgen ic p lan ts of Basm ati21, B24, B22, B213, B214;
B. 1. P lasm id p IL TAB227 DNA ; 2. DNA from untransfo rm an t of Q ingyouzhan; 3. D igested DNA from Q ing21; 4, 5.
D igested DNA from Q ing22; 6. D igested DNA from Q ing23; 7. N egative con tro l of X inshanzhan29; 8, 9. D igested
DNA from two independen t transgen ic p lan ts of X ingshanzhan29, X in21, X in22; 10, 11. U ndigested DNA of X in21
and Q ing23
图 2　转基因植株当代 (T0)之核DNAR 分子杂交分析
F ig. 2　Southern b lo t analysis of the transgen ic p lan ts (T 0)
　
2. 3　转基因植株后代的遗传分析
为了更进一步地证实外源基因 (hp h)已整合到水稻的核基因组并能遗传到后代, 对转基因植株的基
因型 (在 T 1 代)及其性状表达 (表型, 在 T 1 至 T 3 代)作了遗传学分析。
2. 3. 1　T 1 代核DNA 的分子检测
以点杂交方法检测了部分 T 1 代株系内各个体核DNA 中的 hp h 基因分布。图 3: A ,B 为Basm ati21
的两株系B 216, B 21 (T 1) 点杂交的结果。从图 3: A , B 可知在 T 1 代的核DNA 中, 已检测到外源基因
(hp h) 的存在。证实了 hp h 基因已遗传到后代并发生了分离。株系B 216 的种子是在具选择压 (潮霉素
B ) 的条件下发芽; 幼苗是经过潮霉素B 选择的, T 1 代分离出的阴性植株已被潮霉素杀死, 故 24 株均为
阳性 (图 3: A )。而株系B 21 则未经潮霉素B 选择, 随机取 34 株, 点杂交显示阳性 26 株, 阴性 8 株, 符合 3
∶1 的分离 (图 3: B)。这一结果充分证明以基因枪转化的外源基因不仅整合到受体的核基因组, 而且能
稳定地遗传至后代, 在后代核基因组中检测到它的存在并显示出正常的分离比例。
2. 3. 2　T 1 代转基因植株抗潮霉素的性状表达 (表型分析)
转基因植株 (T 0)的种子 (T 1) 在不含潮霉素的 1ö2 M S 培养基上进行萌发, 然后转入添加 50 m göL
潮霉素B 的选择培养基上进行选择, 由于 hp h 基因在 T 1 代发生分离, 具 hp h 基因的幼苗生长良好, 不具
hp h 基因的幼苗由于不抗潮霉素B 而逐渐死亡 (图版É: 8 )。表 2 显示了Basm ati21、青油粘两品种部分
T 0 的自交后代 (T 1)对潮霉素抗性和敏感分离之符合度的卡方测验的结果。
292 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 17 卷　
A. 24 株B216 之 T 1 代植株的 hp h 基因点杂交分析. 1. 阳性对照, 质粒 (p IL TAB22)DNA ; 2. 阴性对照 (未转化植株
之DNA ) ; 3～ 26. 为 24 株 T 1 代植株。因种子萌发时经过潮霉素B 的筛选, 故 24 株均为阳性;
B. 34 株B21 之 T 1 代植株的 hp h 基因点杂交分析, 黑点表示具有 hp h 基因 (阳性) , 无信号者表示 hp h 基因 (阴性).
1. 阳性对照, 质粒 (p IL TAB22)DNA ; 2. 阴性对照 (未转化植株之DNA ) ; 3～ 36. 为 34 株 T 1 代植株. 种子未经过潮
霉素B 的筛选, 故有阳性与阴性的分离
A. A nalysis of 24 T 1 p lan ts from B216. 1. Po sit ive con tro l, DNA from p lasm id p IL TAB227; 2. N egative con tro l,
DNA from untransfo rm ed p lan t; 3～ 26. Tw entieth four p lan ts of T 1 generation from B216. T he seedlings w ere se2
lected by hygrom ycin, so all of them w ere po sit ive;
B. A nalysis of 34 T 1 p lan ts from B21. B lack do ts indicate the p resence of hph gene, the absence of a signal indicates
negative fo r hph gene. 1. Po sit ive con tro l, DNA from p lasm id p IL TAB227; 2. N egative con tro l, DNA from untrans2
fo rm ed p lan t; 3～ 36. T he 34 p lan ts of T 1 generation from B21. T he seedlings w ere no t selected by hygrom ycin, so
they segregated in to po sit ive and negative
图 3　转基因植株后代 (T1)点杂交分析
F ig. 3　Do t b lo t analysis of p rogeny of transgen ic p lan t (T 1)
　
表 2　转基因 (hp h+ ) T1 代植株对潮霉素抗性分离的卡方分析
T able 2　Ch i2squ ire analysis on segregation of resistan t to hygrom ycin in T 1 of hp h+ p lan t
T 1 株系号
N o. of
L ine
对潮霉素的抗ö感
R öS fo r hygrom ycin
R S
预期分离比
Expected
ratio
ς 2 T 1 株系号N o. of
L ine
对潮霉素的抗ö感
R öS fo r hygrom ycin
R S
预期分离比
Expected
ratio
ς 2
B21 66 20 3∶1 0. 062 B214 20 24 1∶1 0. 20
B22 28 12 3∶1 0. 3 B216 24 22 1∶1 0. 02
B23 33 7 3∶1 0. 83 B218 84 69 1∶1 1. 28
B24 35 9 3∶1 0. 48 Q ing21 32 17 3∶1 1. 97
B213 146 55 3∶1 0. 48 Q ing22 22 14 3∶1 3. 00
对照Contro l 0 30 对照Contro l 0 30
　　hp h+ : hp h 基因阳性; R = Resistan t; S= Sensit ive; B= Basm ati21; Q ing= Q ingyouzhan (青油粘)。
从表 2 中可以看出, 在所列出的 10 个株系中, 有 7 个株系对潮霉素的抗与感呈 3∶1 分离; 3 个株系
呈 1∶1 的分离。值得注意的是这 3 个株系表现出的抗潮霉素的植株比预期的少, 即有近 1ö4 预期具抗
性植株失去了抗性。
2. 3. 3　T 2 代植株对潮霉素抗性的性状表达 (表型分析)
根据对潮霉素的抗性性状的分离, 现可将 T 1 代分为 2 类: É , 符合 3∶1 的分离比的, 如B 21; Ê , 符
合1∶1分离比者, 如B 216 株系 (表 2)。在 T 2 代我们分别研究了这两类株系中各个体对潮霉素的抗与感
分离表现。类型É (符合 3∶1 的分离比者)在 T 2 代表现为①继续呈 3∶1 分离和无分离全部为抗潮霉素
的表现型 (表 4) ; ②表现为继续 3∶1 分离, 1∶1 分离和无分离全部为抗潮霉素的表现型。类型Ê (符合 1
∶1 分离比者)在 T 2 代表现为继续 1∶1 分离; 也出现 3∶1 分离的正常分离比及无分离全部为抗潮霉素
的表现型 (表 3)。无论在 T 1 代属于那种分离方式 (3∶1 或 1∶1)其在 T 2 代的分离均可以将它们分为 3
类: ①3∶1 分离者 (表 3, 表 4) ; ②无分离全部为抗潮霉素者 (表 3、表 4) ; 及③ 1∶1 分离者 (表 3)。
392　第 4 期　　　　　　陶利珍等: 基因枪介导的籼稻遗传转化及外源基因在受体中的遗传研究
表 3　转基因 (hp h+ )株系B 216 之 T2 代对潮霉素抗性的分离样式及卡方分析
T able 3　Ch i2squ ire analysis and segregation pattern of resistan t to hygrom ycin in T 2 of B 216 line
T 2 代株系号
Code of line
T 1 代对潮霉素的抗性表现
R o r S to hygrom ycin in T 1
T 2 代对潮霉素抗或感的分离
总株数 To tal Resistan t Sensit ive
预期分离比
Expected ratio
ς 23
B21621 R 38 19 19 1∶1 0. 03
B21622 R 34 16 18 1∶1 0. 03
B21623 R 19 8 11 1∶1 0. 21
B21624 R 42 36 6 3∶1 2. 03
B21625 R 36 20 16 1∶1 0. 25
B21626 R 33 21 12 3∶1 1. 71
B21627 R 31 14 17 1∶1 0. 13
B21628 R 33 16 17 1∶1 0. 00
B21629 R 36 22 14 3∶1 3. 70
B216210 R 34 22 12 3∶1 1. 19
B216220 S 38 0 38
Contro l S 30 0 30
　　3 卡方测验的 95% 及 99% 可信值分别为 3. 84 及 6. 63; R = Resistan t; S= Sensit ive。
　　3 V alues of the 95% and 99% confidence level in the Ch i2square test are 3. 84 and 6. 63, respectively.
2. 3. 4　T 3 代植株对潮霉素抗性的性状表达 (表型分析)
在 T 2 代已观察到 1 个株系的所有个体均对潮霉素具有抗性, 即 hp h 基因的纯合体 (表 4)。观察了 1
个独立转化体B 21 之 T 2 代的自交后代 (T 3 代)的 4 个株系对潮霉素抗性的性状表达, 证实它们都对潮霉
素具有抗性, 表明它们是纯合体 (表 4)。
表 4　转基因 (hp h+ )株系B 21 之 T2 及 T3 代对潮霉素抗性的分离样式及卡方分析3
T able 4　Ch i2squ ire analysis and segregation pattern of resistan t to
hygrom ycin in T 2 and T 3 of B 21 line
T 2, T 3 代株系号
Code of line in
T 2, T 3
T 1, T 2 对潮霉素的抗性表现
R o r S to hygrom ycin in
T 1, T 2
T 2, T 3 代对潮霉素抗或感的分离
总株数 To tal R S
预期分离比
Expected ratio
ς 23 基因型33
Geno type
B2121 (T 2) R (T 1) 45 45 0 hp höhp h
B2122 (T 2) R (T 1) 41 32 9 3∶1 0. 07 hp hö2
B2123 (T 2) R (T 1) 43 43 0 hp höhp h
B2124 (T 2) R (T 1) 39 39 0 hp höhp h
B2125 (T 2) R (T 1) 38 27 11 3∶1 0. 14 hp hö2
B2126 (T 2) R (T 1) 41 34 7 3∶1 0. 98 hp hö2
B2127 (T 2) R (T 1) 43 30 13 3∶1 0. 38 hp hö2
B21215 (T 2) S (T 1) 33 0 33 2ö2
B212321 (T 3) R (T 2) 40 40 0 hp höhp h
B212322 (T 3) R (T 2) 40 40 0 hp höhp h
B212421 (T 3) R (T 2) 40 40 0 hp höhp h
B212422 (T 3) R (T 2) 40 40 0 hp höhp h
对照Contro l S 30 0 30 2ö2
　　3 卡方测验的 95% 及 99% 可信值分别为 3. 84 及 6. 63; R = Resistan t; S= Sensit ive (V alues of the 95% and 99%
confidence level in the Ch i2square test are 3. 84 and 6. 63, respectively)。
　 33 基因型: hp h 表示 hp h 基因阳性; 2表示 hp h 基因阴性; hp höhp h 为显性纯合; hp hö2为杂合; 2ö2为隐性纯合。
492 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 17 卷　
3　讨论
以上结果清楚地表明, 基因枪介导的外源基因转化法是获得籼稻工程植株的可靠方法。虽然籼稻再
生频率低成为转化效率提高的限制因子, 但我们可以针对不同籼稻品种的特点, 采用悬浮细胞系作为基
因枪轰击的靶组织, 通过增加靶组织的数量, 可以获得一定数量的转化植株供遗传分析用。和幼胚作为
靶组织相比, 悬浮细胞系的优点是取材不依赖于季节性, 可以使靶材料迅速扩增, 提供大量均一的靶材
料供基因枪轰击用。
关于转基因植株的育性, 本试验获得的转基因植株移植于温室或大田生长成熟, 它们有着正常的形
态, 自交可育 (图版É: 5, 7)。选择年龄不超过 3 个月以内的悬浮细胞系用作靶材料, 获得的转化株中, 未
发现有不育现象。虽然转化株 (T 0)比种子生长的实生苗 (对照)结实率低, 转基因植株 T 1 代结实率能恢
复到与对照相似的水平 (数据未显示)。这个结果部分说明了离体培养时间长度影响转化株的结实率, 而
不是由于外源基因的导入的结果。
试验证实, 外源基因 hp h 单一位点插入水稻基因组, 在 T 1、T 2 和 T 3 各世代通常是按孟德尔遗传规
律传递的。但同时我们也发现, 部分株系中所分离出的具 hp h 基因的个体比预期 3∶1 的分离比少, 而呈
1∶1 的不正常分离。Ch ristou 等〔14〕认为这种不正常分离比例是由于外源基因在配子中的缺失, 仅由单
个配子 (雌或雄配子之一方)传递的结果, 但该假设还无试验来证实。试验中, 我们特别追踪了呈 3∶1 及
1∶1 分离之 T 1 代株系在 T 2 代的分离式样, 发现这种两分离式样在后代竟会交叉出现。即 3∶1 分离的
株系后代中除 3∶1 外还有 1∶1 的式样, 反之亦然, 在 1∶1 的后代中亦有 3∶1 的式样发生。很显然这
不是由于携带 hp h 基因的雌配子或雄配子致死而缺失的结果。如发生致死, 就不会出现这两种分离方式
交叉出现。很可能, 在雄配子或雌配子形成或它们相互接合的过程中, hp h 基因的结构、排列等方面发生
了变化, 从而使雄配子或雌配子之一方的 hp h 基因被抑制 ( supp ression) 或发生沉默, 结果 hp h 基因仅由
未受到抑制 (沉默) 的一方 (雄或雌配子) 表达, 致使本应发生 3∶1 的后代呈现出 1∶1 的分离。但沉默
(或抑制) 不等于基因缺失, 由于某种原因, 沉默 (或抑制) 的基因又活化 (act ion) , 故 1∶1 的后代又呈现
出了3∶1的分离。这一结果还说明基因抑制和活化是相对的。但何种条件致使基因抑制, 又是什么条件
使抑制的基因活化值得进一步研究。
从以上的结果可以看出, 基因枪介导的遗传转化系统产生籼稻转基因植株是有效的。由这个系统获
得 T 0 代植株在有些品种中 hp h 基因已传递到 T 3 代, 这为我们进一步研究农业上其它有价值基因的转
化、遗传提供了依据。同时此处我们报道的转化系统也为籼稻基因工程研究提供了可行的方法。
参 考 文 献
1　Sw am inathan M S. B io techno logy research and th ird wo rld agricu ltu re. S cience, 1982, 218: 967～ 972
2　To riyam a K, A rimo to Y, U ch im iya H. T ransgen ic rice p lan t after direct gene transfer in to p ro top last B ioöT echno2
logy. 1988, 6: 1 072～ 1 074
3　D ata S K, Peterhans A , D ata K. Genetically engineered fertile indica2rice recovered from p ro top last. B ioöT echnolo2
gy , 1990, 8: 736～ 740
4　Ch ristou P, Fo rd T L , Kofron M. P roduction of transgen ic rice (O ry z a sa tiva L. ) p lan t from agricu ltu rally impo r2
tan t indica and japon ica varieties. B ioöT echnology , 1991, 9: 957～ 962
5　L i L , Q u R , Kochko de A. A n imp roved rice transfo rm ation system using the b io list ic m etho rd. P lan t Cell R ep ,
1993, 12: 250～ 255
6　Zhang S, Chen L ili, Q u Rongda. Regeneration of fert ile transgen ic ind ica (group 1) rice p lan t fo llow ing m icrop ro2
jectile transfo rm ation of em bryogen ic suspension cu ltu re cells. P lan t Cell R ep , 1996, 15: 465～ 469
7　H ier Y, Shozo O , To sh ih iko K. Efficien t transfo rm ation of rice (O ry z a sa tiva L. ) m ediated by A g robacterium and
sequence analysis of the boundaries of the T 2DNA. P lan t J , 1994, 6 (2) : 271～ 282
592　第 4 期　　　　　　陶利珍等: 基因枪介导的籼稻遗传转化及外源基因在受体中的遗传研究
8　Rath id H , Yoko i S, To riyam a K. T ransgen ic p lan t p roduction m ediated by A g robacterium in ind ica rice. P lan t Cell
R ep , 1996, 15: 727～ 730
9　Xu X, L i B. Fertile transgen ic ind ica rice p lan ts ob tained by electropo ration of the seed em bryo cells. P lan t Cell
R ep , 1994, 13: 237～ 242
10　Yo sh ida S, Fo rno D A , Cock J H. L abo rato ry m anual fo r physio logical study of rice. Ph ilipp ines: IRR I, 1976. 61～
63
11　Jefferson R A. GU S fusion: B2glucuron idase as a sensit ive and versatile gene fusion m aker in h igher p lan ts. P lan t
M ol B iol R ep , 1987, 5: 387～ 405
12　D ellapo rta S L ,W ood J , H ick s J B. P lan t M ol B iol R ep , 1983, 1: 19～ 20
13　Sam brook J , F ritsch E F,M aniatis T. M o lecu lar C lon ing. Co ld Sp ring: H arbo r L abrato ry P ress. 1989. 486～ 487
14　Ch ristou P, V ain P, Koh li A et a l. In troduction of M ultip le Genes in to E lite R ice V arieties2evaluation of T rans2
gen ic Stab ility, Gene Exp ression, and F ield Perfo rm ance of H erb icide2resistan t T ransgen ic P lan ts. In: Khush G S
ed. R ice Genetics Ë . Ph ilipp ines:〔s. n. 〕, 1996. 223～ 235
GENE TRANSFORM ATION BY PARTICL E BOM -
BARDM ENT IN IND ICA R ICE AND INHER ITANCE
OF THE FORE IGN GENE IN HOST R ICE PLANT
T ao L izhen1　L ing D inghou 1　Zhang Sh ip ing2　C laude Fauquet2
(1 S ou th Ch ina Institu te of B otany , T he Ch inese A cad emy of S cienses　Guangzhou　510650)
(2 IL TA B öT S R I2OR S TOM 2S cripp s R esearch Institu te, D iv ision of P lan t B iology
10666 N o rth To rrey P ines Road2M RCT , L a Jo lla, CA 92037,U SA )
Abstract　Em bryogen ic calli induced from m ature seeds and cell suspensions w ere used as exp lan ts fo r
part icle bom bardm ent. P lasm id p IL TAB 227 con tain ing hp h gene and g us gene under the con tro l of
CaM V 35S w as in troduced in to differen t variet ies of Ind ica rice. R esistan t p lan ts of Indica rice variet ies
Basm ati21,Q ingyouzhan, X inshanzhan 29, Shengyou 2, M inghui 63 w ere ob tained. T issue h istochem ical
sta in ing analysis of gus gene and Southern b lo t analysis of DNA iso lated from leaves of T 0 p lan ts dis2
p layed the p resence of gus and hp h genes in the rice genom e. W e cho se Basm ati21 as a model and evalu2
ated the exp ression of hp h gene in T 1, T 2 and T 3 generations in o rder to p rovide us to study further the
exp ression, regu lat ion and con tro l of o ther impo rtan t agronom ically genes in rice. T he segregation rat io
of 3∶1 (po sit ive∶negative fo r transgene) w as found common in the T 1 p rogeny, it indicated that inheri2
tance of transgene w as in acco rdance w ith M endelian ru le of dom inan t gene w ith one locus. In addit ion,
the selfed p rogeny of som e independen t p lan ts show the segregation rat io of 1∶1. Itw as assum ed that
the aberran t ra t io of 1∶1 resu lted from gene supp ression of fem ale gam ete o r m ale gam ete. M endelian
fash ion of hp h gene w as further confirm ed and homozygo tes fo r hp h gene w ere iden tified in the T 2 and
T 3 lines. M eanw h ile, the supp ression and activation of fo reign gene in the p rogeny of transgen ic p lan ts
w as pu t fo rw ard to discussion.
Key words　Ind ica rice, T ransfo rm ation, Inheritance, Gene supp ression
692 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 17 卷