全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(4): 691−701 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由谷物产品(水稻、小麦)质量安全普查项目(农办质[2012]19号)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 王步军, E-mail: wangbujun@caas.cn
第一作者联系方式: E-mail: gwzx848@163.com, Tel: 010-82108740
Received(收稿日期): 2013-08-28; Accepted(接受日期): 2014-01-12; Published online(网络出版日期): 2014-02-17.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140217.1014.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00691
用超高效液相色谱串联质谱法同时测定谷物中 12种真菌毒素
孙 娟 李为喜 张 妍 孙丽娟 董晓丽 胡学旭 王步军*
中国农业科学院作物科学研究所 / 农业部谷物品质监督检验测试中心, 北京 100081
摘 要: 建立了简单、快速、同步测定谷物中 12种常见真菌毒素的超高效液相色谱串联质谱分析方法。样品用 80%
乙腈水溶液振荡提取, 多功能净化柱净化, Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18色谱柱分离, 串联四极杆质谱多反应
离子监测方式检测, 并采用外标法定量。结果表明, 12种真菌毒素在各自的线性响应范围内线性关系良好, 相关系数
均不低于 0.998, 12 种真菌毒素的检出限为 0.016~1.000 μg kg–1, 低、中、高 3 个加标水平的平均回收率(n = 6)为
60.0%~122.4%, 相对标准偏差(RSD)为 0.9%~20.3%。该方法具有前处理简单、净化效果好、灵敏度高和检测速度快
的优点, 适用于谷物样品中多组分真菌毒素残留的分离和定量检测。
关键词: 超高效液相色谱-串联质谱; 多功能净化; 谷物; 真菌毒素
Simultaneous Determination of Twelve Mycotoxins in Cereals by Ultra-high
Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
SUN Juan, LI Wei-Xi, ZHANG Yan, SUN Li-Juan, DONG Xiao-Li, HU Xue-Xu, and WANG Bu-Jun*
Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Cereal Quality Supercision and Testing Center, Ministry of Agriculture, Beijing
100081, China
Abstract: A determination method was developed using ultra-high performance liquid chromatography-tendem mass spectrome-
try (UPLC-MS/MS). Samples were sequentially extracted with 80% acetonitrile, and then the extracts were pooled and cleaned up
with multifunction cleaning column before being separating by a chromatographic column of Waters ACQUITY UPLCTMBEH
C18. The Mass spectrometry was conducted by using positive (ESI+) electrospray ionization and Multi-reactions monitoring
(MRM) models, with external standard method. The results indicated that contants of the 12 mycotoxins had good linear relation-
ship with than peak areas. The detection limits for them ranged from 0.016 to 1.000 μg kg–1, and the average recovery rates at
three levels of adding external standard were from 60.0% to 122.4%, with a relative standard deviation (RSD) varying from 0.9%
to 20.3%. The method is simple, rapid, accurate and suitable for simultaneously by measuring 12 kinds of mycotoxins in cereals.
Keywords: Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (UPLC-MS/MS); Multifunction
cleaning; Cereals; Mycotoxin
真菌毒素 (mycotoxins)是某些真菌产生的二级
代谢产物, 目前已知的真菌毒素有300多种, 按其主
要菌种可分为曲霉菌毒素, 如黄曲霉毒素, 包括黄
曲霉毒素B1 (aflatoxin B1, AFB1)、黄曲霉毒素B2
(aflatoxin B2, AFB2)、黄曲霉毒素G1 (aflatoxin G1,
AFG1)、黄曲霉毒素G2 (aflatoxin G2, AFG2)和棕曲霉
毒素等 ; 镰刀菌毒素 ,如脱氧雪腐镰刀菌烯醇
(deoxynivalenol, DON)、玉米赤霉烯酮(zearalenone,
ZEN)、T2毒素(T-2)、HT-2毒素(HT-2)等; 以及青霉
菌毒素。其中AFB1被公认为是目前致癌力最强的天
然物质。我国规定小麦、玉米中黄曲霉毒素的限量
值分别为5 μg kg–1和20 μg kg–1, 而国际食品法典委员
会标准中是按黄曲霉毒素总量(AFB1+AFB2+AFG1+
AFG2)指标制定限量指标, 限量值在10~20 μg kg–1 [1-3]。
目前检测真菌毒素的方法主要有薄层色谱法
(TIC)、酶联免疫吸附法、气相色谱法、免疫亲和柱
净化高效液相色谱法[4-8], 它们均只能检测单一类的
真菌毒素。液相色谱串联质谱法由于其较好的分离
692 作 物 学 报 第 40卷


度和较高的灵敏度逐渐成为同时检测多种真菌毒
素的主要手段 [9-15]。Ren等 [12]建立了免疫亲和法净
化与内标法定量, 利用两种不同流动相分别测定食
品中17种真菌毒素, 获得较好的回收率。Frenich等[13]
利用一步萃取法, 不经过净化对谷物中11种真菌毒
素进行测定 , 检出限和定量限分别为0.01~2.10 μg
kg–1和 0.03~6.30 μg kg–1, 回收率分别为 70.0%~
108.4%。孟娟等[14]建立了谷物及其制品中6种玉米
赤霉烯酮类物质的超高效液相色谱串联质谱的方
法, 采用石墨化炭黑固相萃取柱富集净化、内标法
定量, 取得了较好的回收率。内标法存在内标物不
易选择及成本较高等不足, 而样品不经过净化柱净
化前处理, 极易损伤色谱柱及仪器, 影响分析稳定
性。本研究目的是探讨建立前处理方法更为简便、
稳定性更高、外标法同时测定12种真菌毒素的分析
方法。
1 材料与方法
1.1 试剂
甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯(美国 Fisher公司);
AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、ZEN、DON、3-乙酰
基脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (3-acetyl deoxynivalenol,
3-ADON)、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-acetyl
deoxynivalenol, 15-ADON)、疣孢青霉原 (verrucu-
logen, VCG)、杂色曲霉素(sterigmatocystin, SMC)、
T-2、HT-2 等 12 种标准品纯度均不低于 99% (国家
标物中心)。
1.2 仪器与设备
超高效液相色谱 -串联四级杆质谱 (UPLC-
XEVO TQ, 美国 Waters 公司), 配有电喷雾离子源;
恒温培养摇床(上海-恒科学仪器公司); MILLI-Q 纯
水机(美国Millipore公司); 氮吹仪; 涡旋混匀器; 天
平(感量 0.01 g); Mycosep 226 多功能净化柱(美国
Romer实验室)。
1.3 液相色谱、质谱分析条件
液相色谱的色谱柱为 ACQUITY BEH C18 柱
(50.0 mm × 2.1 mm, 粒径 1.7 μm), 流速为 300 μL min–1,
柱温为 26 , ℃ 进样体积为 5 μL。
流动相种类和比例是本研究的处理因素。比较
乙腈-水、甲醇-水两种流动相对质谱信号及峰形对称
的影响, 选择一种流动相作进一步添加不同浓度的
乙酸铵对各组分保留时间、分离效果和峰型的影响
试验。甲醇-10 mmol L–1乙酸铵流动相中浓度设计为
10%、20%、25%、30%、40%和 50%。
质谱分析的离子源为电喷雾离子源(ESI), 扫描
方式为正离子扫描, 检测方式为多反应监测(MRM),
毛细管电压是 2.50 kV, 离子源温度为 110 , ℃ 去溶
剂气流量为 800 L h–1, 溶剂气温度为 450℃。其他质
谱采集参数见表 1。
1.4 样品前处理
准确称取 10 g粉碎均匀的试样(精确到 0.01 g)
于 150 mL三角锥形瓶中, 加入 50.0 mL乙腈水溶液,
恒温振荡器中振荡 30 min, 取出后过滤。取处理好
的样品滤液 8 mL 至 MycoSep 萃取柱的试管中, 将
MycoSep 萃取柱的红色橡胶头插入试管内, 缓慢将
萃取柱推入试管底部, 使提取液通过固定相进入套
管中, 时间不少于 1 min, 取 4 mL套管中的纯化液
至干净的刻度试管中, 将试管置于 50℃水浴中氮吹
至近干, 用甲醇-10 mmol L–1 乙酸铵水溶液(1∶1,
体积比)溶解, 定容至 1 mL, 旋涡 1 min, 过 0.22 μm
聚醚砜滤膜于 2 mL样品瓶中, 待测。
样品前处理提取溶剂乙腈水溶液浓度是本研究
的处理因素, 设计为 30%、50%、70%、80%、84%、
90%和 100%。
1.5 标准溶液配制
毒素标准储备液的配制(100 mg L–1): 用纯甲醇
将 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2配制成 200 μg L–1、
60 μg L–1、200 μg L–1、60 μg L–1的标准储备液, 其
余 8 种真菌毒素配制成 100 mg L–1的标准储备液,
−18℃以下贮存。
混合标准工作溶液: 根据 AFB1、AFB2、AFG1、
AFG2、ZEN、VCG、SMC、T-2、HT-2、DON、3-ADON、
15-ADON 各毒素在质谱中的响应值 , 用甲醇 -10
mmol L–1 乙酸铵(1∶1, 体积比)逐级稀释各储备液,
最终配制成 10、3、10、3、20、20、20、20、20、
100、100和 100 μg L–1的标准溶液。
基质标准溶液是本研究的处理因素。将空白小
麦或玉米按照 1.4 方法处理, 用空白基质溶液将 12
种真菌毒素配制成混合标准溶液, 浓度同 1.5。
2 结果与分析
2.1 流动相种类和比例的选择
本实验分别考察了乙腈-水、甲醇-水作为流动相
的结果, 表明以甲醇-水作为流动相, 质谱信号提高,
峰形对称。考察了在甲醇-水中添加不同量的乙酸铵
对质谱灵敏度的影响, 最终采用甲醇-10 mmol L–1

第 4期 孙 娟等: 用超高效液相色谱串联质谱法同时测定谷物中 12种真菌毒素 693


表 1 12种真菌毒素 UPLC-MS/MS测定参数
Table 1 UPLC-MS/MS acquisition parameters for 12 mycotoxins
真菌毒素
Mycotoxin
保留时间
Retention time (min)
母离子
Parention (m/z)
子离子
Daughter ion (m/z)
驻留时间
Dwell time (s)
锥孔电压
Cove voltage (V)
碰撞能
Collision energy (V)
249.1(Q) 0.006 20 10 DON 1.09 297.28
203.1(q) 0.006 20 14
283.0(Q) 0.006 18 22 ZEN 4.73 319.05
187.3(q) 0.006 18 14
285.0(Q) 0.006 46 22 AFB1 3.14 313.28
241.1(q) 0.006 46 38
287.1(Q) 0.006 40 26 AFB2 2.93 315.20
259.1(q) 0.006 40 30
243.0(Q) 0.006 40 28 AFG1 2.75 329.03
199.8(q) 0.006 40 40
245.1(Q) 0.006 44 28 AFG2 2.53 331.29
189.1(q) 0.006 44 34
231.2(Q) 0.006 20 14 3-ADON 2.15 339.20
213.3(q) 0.006 20 22
137.1(Q) 0.006 22 10 15-ADON 2.16 339.30
261.2(q) 0.006 22 12
392.2(Q) 0.006 22 18 VCG 5.20 534.32
191.1(q) 0.006 22 24
281.0(Q) 0.006 45 36 SMC 4.87 325.20
253.1(q) 0.006 45 42
387.2(Q) 0.006 42 22 T-2 4.40 489.31
245.1(q) 0.006 42 34
345.2(Q) 0.006 34 18 HT-2 3.97 447.30
285.1(q) 0.006 34 22
在流动注射状态下, 将 12 种毒素的标准品分别配制成 0.1 mg L–1的甲醇溶液, 通过全扫描(Scan 模式)确定 12 种化合物的(M+1)
质子化离子峰(母离子) m/z。二级质谱分析(子离子扫描)得到各自碎片离子的信息, 选取碎片离子峰值相对较高的 2个碎片离子作为定
量离子和定性离子。Intelistart自动优化各质谱参数。Q: 定量离子; q: 定性离子。
Standards of 12 mycotoxins were prepared in methanol solution (0.1 mg L–1), respectively. The protonated ion peaks (M+1) (parent ion,
m/z) of 12 mycotoxins were determined by full scan under flow injection mode. Information of each fragment ion was obtained using MS2
(daughter ion scan), and two fragment ions with relatively higher peak were selected as quantitative and qualitative ion. Automatic optimiza-
tion of the mass parameter was conducted with Intelistart. Q: qualitative ion; q: quantitative ion.

乙酸铵水溶液作为流动相。由于电喷雾质谱的电离
是在溶液状态下电离 , 因此流动相的种类和比例
不仅影响目标化合物的保留时间和峰形 , 还会影
响到目标化合物的离子化效率 , 从而影响灵敏度。
由于 12种真菌毒素的化学性质差异较大, 而采
用等度洗脱很难在短时间内达到基线分离, 因此采
用梯度洗脱方式分离。实验中逐渐调整甲醇初始浓
度, 结果表明, 初始甲醇比例越大, 出峰越快, 特别
是呕吐毒素在 0.6 min内便出峰, 且对 4种黄曲霉毒
素类的分离效果较差, 峰型有重叠, 而甲醇的初始
比例较小时 , 出峰较慢 , 后出组分峰形变宽 , 灵敏
度下降。综合考虑, 确定梯度洗脱程序为 0~5.5 min,
20%~85% A; 5.5~5.8 min, 85%~100% A; 5.8~6.0 min,
100%~20% A; 6.0 min, 20% A, 平衡 2 min。在上述
优化液谱和质谱最佳条件下得到 12 种真菌毒素的
多反应监测(MRM)色谱图(图 1)。
2.2 样品前处理提取溶剂比例的选择
Ren等[12]及宫小明等[15]均采用 84%乙腈-水溶液
作为提取液。不同浓度提取液(30%、50%、60%、
70%、80%、84%、90%和 100%)的提取效果差异很
大(图 2)。随着乙腈-水体积比逐渐增大, 提取回收率
逐渐提高。当乙腈-水为 80%和 84%时, 提取回收率
相当, 且达到最大。因此, 选择 80%乙腈-水溶液作
为提取溶液。
694 作 物 学 报 第 40卷



图 1 12种真菌毒素混合标准溶液在 ESI+模式下 MRM色谱图
Fig. 1 Mutiple reaction monitoring (MRM) chromatograms of mixed solution of 12 mycotoxins standards in ESI+

2.3 基质效应对样品添加回收率的影响
根据1.4操作步骤对小麦样品进行空白和添加
实验处理, 分别采用溶液配制标液以及空白基质配
制标液对12种真菌毒素进行定量测定 (图3)表明 ,
DON、15-ADON、3-ADON 三种呕吐类毒素以及
AFB1、AFB2、AFG1、AFG2四种黄曲霉类毒素受基
质效应影响较小, 而 ZEN、T-2、HT-2、VCG、SMC
五种毒素受基质效应影响较大。
2.4 方法学验证
2.4.1 标准曲线与线性范围 在优化条件下, 配
第 4期 孙 娟等: 用超高效液相色谱串联质谱法同时测定谷物中 12种真菌毒素 695


制标准溶液系列, 进样分析表明, 12种组分在正离
子模式下均呈良好的线性关系, 相关系数(r)均不低
于0.998 (表2)。
2.4.2 检出限和定量限 根据12种真菌毒素在质
谱 MRM 模式下响应不同, 将其配制成不同浓度的
混标溶液, 分别取空白小麦粉和玉米粉样品作为基
质, 添加12种真菌毒素的混标溶液, 按照1.4样品预
处理方法处理, 分析测定后 , 按照3倍信噪比(S/N)
可得最低检出限(LOD), 按10倍信噪比(S/N)可得最
低定量限 ( L OQ) , 如表2所示。结果表明 , 12种
真菌毒素的最低检出限 LOD在 0.016~1.000 μg kg–1,
最低定量限 LOQ在 0.02~ 3.00 μg kg–1之间, 均低于
中国、欧盟和日本等国家规定的最大残留限量。
2.4.3 精密度试验 取 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、
DON、ZEN、3-ADON、15-ADON、T-2、HT-2、VCG、
SMC浓度分别为 10、3、10、3、100、20、100、100、
20、20、20、20 μg L–1的 12种真菌毒素混合标准溶
液连续进样 6 次, 测得 12 种真菌毒素的 RSD%, 连
续进样 11 d, 测得日间重复性(表 3), 表明日内精密
度及日间精密度均在允许范围内。

Volume ratio of acetonitrile to water

图 2 不同浓度提取液对 12种真菌毒素的提取效果
Fig. 2 Recovery rate of 12 mycotoxins using different concentrations of extractant
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图 2 不同浓度提取液对 12种真菌毒素的提取效果
Fig. 2 Recovery rate of 12 mycotoxins using different concentrations of extractant


图 3 12种真菌毒素溶液配制标液和空白基质配制标液添加回
收率对比
Fig. 3 Recovery rate contrast for standard solutions based on
12 mycotoxins and blank matrix

2.5 方法回收率
分别称取小麦和玉米的空白样品10.0 g, 对12
种真菌毒素进行低、中、高3个不同水平添加, 不同
组分每个浓度进行6个水平测定, 结果见表4。12种
毒素的平均回收率为60.0%~122.4%, 相对标准偏差
为0.9%~20.3%。
2.6 与标准方法比对
为了进一步验证方法的可行性, 采取了与标准
方法的比对试验。目前可查到的国家标准方法仅限
于免疫亲和净化-液相色谱法, 是针对 DON、ZEN、
T-2 以及黄曲霉毒素类毒素测定的标准 [16-19], 未查
到针对 3-ADON、15-ADON、VCG、SMC、HT-2
测定的标准, 该标准方法稳定性较好, 也是国际公
认的 , 但成本较高 , 前处理较复杂 , 不适用于做批
量样品, 从灵敏度角度讲也远不及液质质, 为权衡
二者灵敏度的差异, 添加浓度相对较高, 比对结果
(表 5)表明, 该方法与国家标准方法的结果均在规定
范围内, 从而证明该方法的可靠性。
3 讨论
3.1 流动相的选择
采用超高效液相色谱串联质谱法分析生物毒素
时, 流动相通常选择乙腈-水或甲醇-水, 有时也在乙
腈-水或甲醇-水流动相中加入低浓度的甲酸或乙酸
铵。所有的分析研究都采用梯度洗脱, 但流动相的梯
度洗脱时间设计和组合则相差很大。如王岩松等[20]
在研究谷物中黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 和Ｍ1
分析方法时, 流动相 A 为水加甲酸(0.2%甲酸), 流
动相 B为甲醇, 梯度洗脱时间设计为 0、2、5、9、
10和 12 min, 流动相 A/B比为 85/15、85/15、5/95、
5/95、85/15和 85/15。王晓春等[21]在研究谷物中 T-2
毒素和HT-2毒素分析方法时, 流动相A为 1.0 mmol
第 4期 孙 娟等: 用超高效液相色谱串联质谱法同时测定谷物中 12种真菌毒素 697


表 2 12种真菌毒素的标准工作曲线、线性范围、相关系数、检出限及定量限
Table 2 Calibration curve, linear ranges, correlation coefficients(r), LODs, and LOQs of 12 mycotoxins
真菌毒素
Mycotoxin
线性方程
Calibration curve
线性范围
Linear range
(μg kg–1)
相关系数
r
小麦检出限
Wheat LOD
(μg kg–1)
小麦定量限
Wheat LOQ
(μg kg–1)
玉米检出限
Corn LOD
(μg kg–1)
玉米定量限
Corn LOQ
(μg kg–1)
AFB1 Y = 4283.68X+657.44 0.05–40.00 0.999 0.016 0.05 0.016 0.05
AFB2 Y = 5613.03X+294.19 0.015–12.000 0.999 0.016 0.02 0.016 0.02
AFG1 Y = 3651.66X+268.33 0.01–40.00 0.999 0.016 0.05 0.016 0.05
AFG2 Y = 1293.70X+16.39 0.30–12.00 0.999 0.024 0.03 0.024 0.03
DON Y = 74.9099X±25.81 0.50–250.00 0.998 0.500 1.50 0.500 1.50
ZEN Y = 471.636X±759.77 0.50–200.00 0.999 0.100 0.50 0.100 0.50
3-ADON Y = 101.161X±305.12 5.00–250.00 0.999 1.000 3.00 1.000 3.00
15-ADON Y = 170.777X±353.81 5.00–250.00 0.999 1.000 3.00 1.000 3.00
T-2 Y = 1119.44X±1705.05 0.05–200.00 0.999 0.010 0.05 0.020 0.10
HT-2 Y = 636.931X+1331.94 0.25–250.00 0.999 0.080 0.25 0.100 0.50
VCG Y = 301.022X+1017.75 0.05–200.00 0.997 0.010 0.05 0.010 0.05
SMC Y = 7759.51X+8214.74 0.02–200.00 0.999 0.006 0.02 0.010 0.05
Y: 峰面积; X: 浓度(μg L–1)。Y: peak area; X: concentration (μg L–1).

表 3 12种真菌毒素的日内精密度和日间精密度
Table 3 Within-day precision and day to day precision of 12 mycotoxins
日内精密度 Within-day precision (n = 6) 日间精密度 Day to day precision (n = 6)
真菌毒素
Mycotoxin 平均值
Average
标准偏差
SD
相对标准偏差
RSD (%)
平均值
Average
标准偏差
SD
相对标准偏差
RSD (%)
AFB1 10.75 0.647 6.7 10.60 1.104 10.8
AFB2 3.03 0.036 1.3 3.00 0.248 8.6
AFG1 9.62 0.320 3.6 10.52 1.272 12.5
AFG2 3.19 0.200 7.0 2.93 0.398 14.1
DON 102.89 1.968 2.2 103.23 7.996 8.2
ZEN 19.41 1.185 6.8 20.07 2.483 12.9
3-ADON 101.26 3.323 3.8 96.47 5.283 5.7
15-ADON 103.29 2.883 3.1 96.60 5.569 5.9
T-2 20.36 1.422 7.8 21.23 1.652 8.1
HT-2 100.49 2.823 3.1 101.28 5.042 5.2
VCG 20.03 1.230 7.5 19.86 2.254 11.9
SMC 19.41 0.824 4.7 19.77 1.967 10.4
SD: standard deviation; RSD: relative standard deviation.

L–1乙酸铵溶液, 流动相 B 为甲醇, 梯度洗脱时间设
计为 0、2、4、4.3、4.31 和 7.3 min, 流动相 A/B比
为 50/50、5/95、5/95、0/100、50/50和 50/50。优化
的流动相设计有利于缩短分析物出峰时间, 又不至
于形成不同分析物峰型重叠。可见, 由于分析物的
差异, 优化的流动相设计有较大的差异, 同时分析
测定的分析物越多, 流动相的优化设计就越重要。
3.2 萃取溶剂的选择
生物毒素的化学结构类似 , 都易溶于有机溶
剂。乙腈和甲醇是近年来生物毒素分析中最常用的
2 种萃取溶剂。相对于过去常用的乙酸乙酯或乙醚,
乙腈和甲醇可以减少旋转蒸发操作 , 简化实验步
骤、节省实验时间和降低实验成本。不同研究报道
的乙腈或甲醇的溶液浓度变化很大。当乙腈或甲醇

698 作 物 学 报 第 40卷


表 4 12种真菌毒素的添加回收率(n = 6)
Table 4 Recoveries of 12 mycotoxins in wheat and corn samples (n = 6)
玉米 Corn 小麦 Wheat
真菌毒素
Mycotoxin
添加水平
Spiked level
(μg kg–1)
回收率
Recovery (%)
相对标准偏差
RSD (%)
回收率
Recovery (%)
相对标准偏差
RSD (%)
0.2 105.0 2.6 74.2 11.3
1.0 92.9 7.0 103.3 11.5
AFB1
2.0 104.0 1.8 104.1 8.3
0.06 83.0 1.7 99.3 4.9
0.2 96.9 5.8 82.9 8.3
AFB2
0.6 71.8 1.7 82.7 3.0
0.2 80.0 8.8 88.8 10.4
1.0 74.0 1.9 84.5 8.5
AFG1
2.0 71.8 7.4 102.5 9.0
0.06 98.6 8.8 89.6 10.4
0.2 92.6 1.9 73.3 7.6
AFG2
0.6 90.7 3.2 79.2 4.3
10.0 85.2 5.7 65.2 11.7
50.0 76.1 13.0 97.7 9.1
DON
250.0 77.6 1.8 75.5 8.9
1.0 104.5 11.3 94.4 20.0
5.0 88.8 13.4 65.7 10.4
ZEN
25.0 105.0 2.3 91.9 2.5
10.0 116.1 2.7 112.3 3.8
50.0 98.8 0.9 87.0 4.2
3-ADON
250.0 122.4 13.2 111.2 4.5
10.0 106.2 2.1 120.4 7.3
50.0 97.3 7.4 84.1 3.5
15-ADON
250.0 109.9 2.7 110.7 0.7
1.0 95.0 8.2 96.8 20.3
5.0 66.0 9.9 72.8 11.7
T-2
25.0 103.7 3.2 103.7 8.3
1.0 111.4 9.0 110.7 2.7
5.0 72.9 7.1 61.6 2.5
HT-2
25.0 63.8 2.7 70.0 3.4
1.0 85.7 8.7 64.8 8.2
5.0 61.3 6.9 72.2 2.6
VCG
25.0 111.4 7.1 101.1 2.7
1.0 114.8 8.0 104.4 9.2
5.0 62.1 9.7 60.0 2.9
SMC
25.0 91.0 1.8 88.9 2.6
第 4期 孙 娟等: 用超高效液相色谱串联质谱法同时测定谷物中 12种真菌毒素 699


表 5 本研究方法与国家标准方法比对结果
Table 5 Comparison of results measured by method used in the study with the national standard method
本研究方法 This study method 国家标准方法 National standard method 真菌毒素
Mycotoxin
添加水平
Spiked level
(μg kg–1)
回收率
Recovery (%)
相对标准偏差
RSD (%)
回收率
Recovery (%)
相对标准偏差
RSD (%)
5.0 101.5 3.1 91.5 2.5 AFB1
10.0 90.3 2.3 89.6 3.9
1.5 81.5 4.6 88.6 4.3 AFB2
3.0 86.4 3.2 91.5 5.7
5.0 90.2 4.1 87.9 5.2 AFG1
10.0 93.4 3.7 89.2 6.7
1.5 80.1 5.2 85.4 3.7 AFG2
3.0 86.4 4.6 90.3 4.1
300.0 86.4 4.1 96.1 3.2 DON
500.0 81.6 3.8 75.8 4.1
20.0 103.8 5.1 88.1 1.8 ZEN
60.0 98.8 2.8 94.6 4.5
20.0 83.8 6.1 86.2 5.4 T-2
60.0 91.4 5.7 83.4 4.8

浓度增加时 , 一般会增加分析物的萃取回收率 ,
但随着浓度的增加 , 会降低多功能净化柱净化过
程中分析物在净化柱柱体的保留效果 , 否则易将
谷物基质中的极性物质 , 如氨基酸、矿物质等 , 引
入待分析组分中 , 产生较强的离子抑制效果 , 进
而干扰质谱信号的测定 [21]。因此 , 萃取溶剂种类
选择和浓度设计的优化因分析目标物的差异和同
时分析的目标物数量有着较大的差别 , 也是近年
研究超高效液相色谱串联质谱法分析生物毒素时
的主要研究内容。
3.3 基质配标消除了谷物基质对引起的萃取和
分析误差
现有的谷物产品中生物毒素检测标准和科学文
献报道 , 基本上采用溶液配标的方法绘制标准曲
线。其优点是标准曲线线性关系显著, 精确度高, 操
作简便; 缺点是不能消除分析样品基质对萃取回收
率干扰及对分析仪器灵敏性干扰的系统误差。同时
测定多种生物毒素时, 由于不同毒素受基质影响程
度不一样 , 采用基质配标可明显提高萃取回收率 ,
减少基质对分析仪器灵敏性的干扰影响, 从而提高
分析测试的准确性。
3.4 创新点与可靠性验证
本研究的创新性在于采用超高效液相色谱串联
质谱-正离子模式对小麦和玉米中12种真菌毒素进
行了同时测定; 采用空白基质配制标液克服了同时
定量测定 12种真菌毒素时, ZEN、T-2、HT-2、VCG、
SMC 等 5 种毒素受基质影响较大的问题; 优化了同
时分析测定 12种真菌毒素时的液相色谱的流动相条
件和样品前处理的萃取溶剂。本研究的结果在生物
毒素萃取回收率、最低检测限方面明显高于同类研
究水平[20-21], 也为尚未建立国标方法的 3-乙酰基脱
氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯
醇、疣孢青霉原、杂色曲霉素、HT-2等 5种毒素的
测定提供了方法基础。
为进一步验证本研究的结果, 将分别添加了脱
氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素)、玉米赤霉烯酮和 T-2
毒素等3种毒素的标品小麦试样分发给5个农业部部
级质检中心进行相同试样不同添加水平回收率测定
试验。结果表明 , 5家实验室回收率测定值均在
80%~120%范围内, 相对标准偏差在规定范围内, 表
明本研究建立的方法在实验室间的重复性及再现性
均较好。本实验室2011、2012和2013年从华北地区
随机抽取的157份玉米样品及全国各地抽取的1350
份小麦样品的真菌毒素检测结果也表明, 本研究建立
的方法与现行国标方法的测定结果吻合[16-19], 验证了
本研究建立的方法的可靠性。
3.5 不足与改进
本研究工作的整体设计中前处理部分和液相条
700 作 物 学 报 第 40卷


件的优化过于简单, 未考虑色谱分离的检测指标以
及回收率。本研究建立的方法测定 HT-2、VCG、SMC
毒素时回收率底限低于 70%, 不是很理想。
进一步研究工作将考虑同时测定 12 种毒素时,
现有的色谱条件是否有改进和优化的空间, 研究分
析部分毒素回收率较低的原因和提高这些毒素回收
率的措施, 进一步研究同时测定谷物中更多毒素的
方法。

致谢: 感谢农业部稻米及制品质量监督检验测试中
心 , 农业部农产品质量安全监督检验测试中心(长
沙), 农业部农产品质量安全监督检验测试中心(南
京), 农业部谷物及制品质量监督检验测试中心(哈
尔滨), 和农业部农产品质量监督检验测试中心(郑
州)在实验室比对实验中提供的数据帮助。
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