全 文 ：武汉植物学研究
  ,
! ∀# ∃ %
一 & &
∋ ( ) ∗ 陀 + # (, − ).+ / 0 ( 1+ / 23 + # 4 56 5 + ∗3 .
韭菜细胞溶质超氧化物歧化
酶的纯化和性质 ’
翟颐华 邹国林” 杨
∀武汉大学生物化学与生物物理学系 武 汉
雄’“
7 8 9 9 : & ∃
提 要 经硫酸钱沉淀 、; 5 < .+= 5> ? 一 & 9 凝胶过滤和 ≅ Α Β Α 一;5 <.+3 5# 层析 8 个步骤 , 将韭菜
细胞溶质 6 9 ≅ 纯化到均一程度 。 从 9  叶片中得到 &Χ 7 Δ Ε 酶 , 酶比活力达
8 9 9 Φ Γ Δ Ε
蛋白 。 鉴定该酶是 Η ) · Ι / 一 ;ϑ ≅ 。 测得酶分子量约为 89  9 道尔顿 , 亚基分子量约为
 9
道尔顿 , Κ 一末端氨基酸为丙氨酸 。 该酶在紫外与可见光区吸收峰分别在 &!9 / Δ 和 !Λ9 / Δ 。
实验表明该酶热稳定性良好 。
关键词 超氧化物歧化酶 , 纯化 , 性质 , 韭菜细胞溶质
超氧化物歧化酶 ∀; ϑ ≅ ∃是一种以 9 丁自由基为底物的酶 , 对它的研究可以丰富酶学
和 自由基生物学的内容 。 邹国林等曾对小 白菜 ;ϑ ≅ 进行过系统研究〔‘一 ’〕 。 韭菜是一种生
长广泛的蔬菜 , 与小白菜分属不同的科 。韭菜 ; ϑ ≅ 的纯化和性质研究国内外未见报道 。本
文报道韭菜细胞溶质 Η ) · Ι / 一; ϑ ≅ 的纯化及其性质 , 旨在为高等植物 ; ϑ ≅ 的比较研究
提供素材 。

材料和方法

Χ
材料与试剂
新鲜 韭 菜 ∀Β ##2) Δ Μ ( ∗ ) Δ ∃ , ;5 < .+ = 5 > ? 一& 9 9 ∀< . + ∗ Δ + 5 2+ 产 品 ∃ , ≅ Α Β Α 一; 5 < . + 5 5 #
∀Ν .+1 Δ + / 产品 ∃ , 氯化硝基氮蓝四哇 ∀Κ 0Ο ∃∀ 上海前进试剂厂产品 ∃ , 标准蛋白质 、标准氨
基酸均为层析纯 , 其它试剂均为分析纯或生化试剂 。

Χ & 方法
酶活力测定采用 Κ 0 Ο 光还原法 〔‘〕 , 以抑制 Κ 0Ο 光还原达 9 Π的酶量作为
个酶单
收稿 日 %
  !


 , 修回日 %
 : 一 9
一 & & 。 第 一作者 % 女 , & 岁 , 硕士 生 , 从事生物化学方面的研究 。
湖北省科委重点科技项 目 。
通讯联系人 。
进修教师 , 工作单位为武汉教 育学院生物系 。
第
期 翟颐华等 %韭 菜细胞溶质超氧化物歧化酶的纯化和性质
位 。 蛋白质浓度测定采用考马斯亮蓝 ? 一& 9 染色法川 。 酶分离纯化按以下步骤进行 。
∀
∃ 粗酶液的制备 % 取韭菜叶片 9 9  加 9 Δ Θ 缓冲液 Β ∀ 9 Δ Δ (# Γ Θ 磷酸钠缓冲
液 , < Ρ : Χ Λ , 含
Δ Δ (# Γ Θ Α ≅ Ο Β , 。Χ 7 Δ (# Γ Θ 蔗糖 , 9 Χ 9
Π 琉基乙醇 ∃匀浆 , 纱布过滤 。 滤液
经
8 9 9 ∗ Γ Δ 2/ 离心 Δ 2/ 取上清液 , 上清液再经

( ( ( ∗ Γ Δ 2/ 离心
9 Δ 2/ 取上清液 , 此
即为细胞溶质粗酶液 。
∀& ∃ 盐析条件摸索 % 取粗酶液 : 份 , 每份 &9 Δ Θ , 分别加硫酸按至 &9 Π 、 8 Π 、 9 Π 、
Π 、 ! 9 Π 、 : Π 、  9 Π饱和度 , 静置过夜 , 经
8 ( ( ( ∗ Γ Δ 2/ 离心 8 9 Δ 2/ 取沉淀 。 沉淀用缓
冲液 0 ∀& Χ Δ Δ (# Γ Θ 磷酸钠缓冲液 , < Ρ : Χ Λ , 含 9 Χ 9
Π琉基 乙醇 ∃溶解后 , 对缓冲液 0 透
析 。 将透析液调整到相同体积 , 分别测酶活力和蛋白浓度 。 以硫酸按饱和度为横坐标 ,
Κ 0 Ο 光还原抑制率和 Β  值为纵坐标 , 作盐析 曲线 。 根据该曲线确定合适的盐析饱和度
为 Π 。
∀8 ∃ 酶的纯 化 % 粗 酶液 加硫 酸按 至 Π饱和 度 , 静 置过 夜 , 经
8 9 9 9 % Γ Δ 2/ 离心
8 9 Δ 2/ 弃上清液 , 沉淀用缓冲液 0 溶解后对缓冲液 0 透析 , 再浓缩至
9 Δ Θ 上 6 5 < . + = 5 >
? 一& 9。柱 ∀# Χ 。Δ > 9 。Δ ∃ 。 用缓冲液 0 洗脱 , 流速
& Δ Θ Γ. , 每管 7 Δ Θ 部分收集 。 经测
活 , 合并酶活力峰 , 上 ≅ ΑΒ Α 一; 5 < .+ 5 5 #柱 ∀
Χ 。Δ 火 8 9 Η Δ ∃ 。 经缓冲液 0 淋洗至 Β & Λ 。值低
于 9 Χ 9 & 后 , 再用 < Ρ : Χ Λ , & Χ Σ 8 9 9 Δ Δ ( #Γ Θ 磷酸钠缓冲液 ∀
9 9 Δ Θ > Ι ∃进行线性梯度洗
脱 。 流速
& Δ Θ Γ. , 每管 7 Δ Θ 部分收集 。 经测活 , 合并酶活力峰 , 存冰箱备用 。
酶种类鉴 定采用抑制剂 敏 感性实 验 。 Τ Η Κ 的终浓 度分别 为 9 、 9 Χ 、
· 。、
Χ 、
& Χ 9 Δ Δ ( #Γ Θ , Ρ Ιϑ % 的终浓度分别为 。、 9 Χ 、 一 。、 & Χ 、 Χ 9 Δ Δ ( #Γ Θ , 测定 ; ϑ ≅ 在这些 不同
浓度的抑制剂存在下的活力 。
聚丙烯酞胺凝胶 电泳采用非解离系统不连续的聚丙烯酞胺凝胶垂直板状电泳 。 浓缩
胶浓度为 8 Π , 分离胶浓度为
9 Π , 电极缓冲液为 < Ρ ; Χ 8 , Ο ∗2 ; 一甘氨酸缓冲液 。 蛋 白染色
用考马斯亮蓝 4 一& 9 , 酶活性染色参照文献〔! 二。 二即!97&卜口之
口。一
!∀#∃门。一八%上&∃∋(飞口)∗二+,−次.哥
姆景医架喇卜口之分子 量测定采用 /0 1 23 ( 0 4 5 一 6   凝胶过滤法 〔7〕 。 亚基分子量测定采用 / 8 / 一!9 5 :法〔幻 , 胶浓度为 ; < 。 = 一末端氨基酸测定采用 > 一二 甲氨基蔡磺酞氯法 − 8 = / 法 ? 〔的 。 热稳定性研 究方法是 将酶 样品分别 在 ≅> Α 、> > Α 、 Β > Α 、 7 > Α 、 Χ > Α 下保温 ;> 、 Δ  、 Β  、 Ε  、;6  Φ Γ 后测定酶活力 。
6 结果与讨论
6Η ; 盐析曲线
结果如图 ; , 根据 图 ; 选择 > <的饱和
度一次性沉淀 。许多文献报道 /Ι 8 的盐析为
分级沉淀 , 一般都是采用 > < 一 Ε  肠硫酸按
饱和度的沉淀部分 。 而实际上这种分级沉淀
 6  ≅  翻 , Χ  ;侧 ,
硫酸按饱和度 − < ?
/ 3 ∋ % ϑ 3 ∋Γ& & Κ − = Λ Μ ? Ν / − ? ‘
· 一 · = Ο ‘Π’光还 原抑制率 − Π ∃一Μ Θ Γ∋ Γ& & Κ
1 ∃飞 ∋ & 0 ∃∃0 ∃一0 3 ∃ ϑ 0 ( % 0 ∋Γ& & Κ 又Ο Ρ ? Μ
Σ 一 Τ 凡 > Ε > Φ
Ρ , Υ甲ϑ ;Ε · ; 韭菜细胞溶质粗酶液的盐析曲线入 Γ ∃& ∃% Γ ς % ∃Κ3 ∋ 0 Κϑ 3 0 ∋Γ& 3 ∋ Γ& 0 % ϑ 、 七
& Κ ∃0 0 Ω 1 ∃3 ς ∃3 0 ϑ % ( 0 0 4 ∋ ϑ 3 0 ∋
并非对所有的材料都适用 。 文献〔;。〕报道从乌梅果中制备 /Ι 8 , 分级沉淀后酶活力只回

第
期 翟颐华等 % 韭菜细胞溶质超氧化物歧化酶的纯化和性质 &

& Χ ! Κ 一末端氨基酸
测得该酶 Κ 一末端氨基酸是丙氨酸 。
酶样品经聚酞胺薄膜单向和双向层析 , 均
只出现 ≅ Κ ; 一丙氨酸荧光斑点 , 未出现其
它 ≅ Κ ; 一氨基酸斑点 , 这也为该酶 已纯化
到均一程度提供了证据 。 小白菜细胞溶质
和 叶绿体 Η ) · Ι / 一 ;ϑ ≅ 的 Κ 一末端氨基
酸 亦是 丙 氨酸〔‘ ·’〕 , 而线粒体 Υ / 一 ; ϑ ≅
的 Κ 一末端氨基酸是撷氨酸 〔8〕。
9 ς 9
9 Χ 田
9 Χ
9 Χ 9

&9∀∃ & 9 89 7 9 引洲, 爱训州」 :洲 Λ仪Ω
入∀ / Δ ∃
图 8 韭菜细胞溶质 9 9 的吸收光谱
Ξ 2Ε Χ 8 Β Ψ 6 ( ∗ < 1 2( / 6 < 5 5 1 ∗ ) Δ ( Ζ < #+ 6 Δ + 6 ∀∃ ≅ Ζ∗ ( Δ #5 5 [
7 一 Λ
7 &
7 Χ Λ
!7毛
沐芝」
!77∋Ζ
沐芝冬
7 Χ &
7 Χ 9 7 Χ 9
974Ζ9 9 ‘ & 认∴ 9 Χ ! 9 Χ Λ

Χ 细胞色素 Η ∀
& 6 ( ( ≅ ∃ ] & Χ 胰蛋白酶∀& 8 8 9 9 ≅ ∃ ]
8 Χ 胃蛋白酶 ∀8 ( ( ( ≅ ∃ ] 7 Χ 牛血清白蛋白∀! : (( ( ≅ ∃

Χ Η ⊥ 1( 5. ∗ ( Δ 5 Η ∀
& 9 9 ≅ ∃ ] & Χ Ο ∗ ⊥Μ6 2/ ∀& 8 89 9 ≅ ∃ ]
8 Χ Μ 5 < 6 2/ ∀8 9 9 9 ≅ ∃ ] 7 Χ
如∴ 2/ 6 5 ∗ ) Δ + #Ψ ) Δ 2/ ∀! : 9 9 9 ≅ ∃

Χ 细胞色素 Η ∀
& 6 ( ( ≅ ∃ ] & Χ 胰 蛋白酶 ∀& 8 8 9 9 ≅ ∃ ]
8 Χ 胃蛋 白酶∀8 ( ( 9 ≅ ∃ ] 7 Χ 牛血清白蛋白 ∀! : 9 9 9 ≅ ∃

Χ Η ⊥ 1(3 . ∗ ( Δ 5 Η ∀
& 9 9 ≅ ∃ ] & Χ Ο ∗⊥ <6 2/ ∀& 8 8 ϑϑ ≅ ∃ ]
8 Χ Μ 5Μ6 2/ ∀8 99 9 ≅ ∃ ] 7 Χ 0( ∴ 2/ 6 5 ∗ ) Δ + #Ψ ) Δ 2/ ∀! : 9 9 9 ≅ ∃
图 7 凝胶过滤法测 9 9 分子 1
Ξ2Ε Χ 7 Υ ( #5 5 ) #+ ∗ Ν 5 2Ε . 1 = 5 15 ∗ Δ 2/ + 1 2( / ( Ζ < #+ 6 / 2+
; ∀∃≅ Ζ∗ ( / # Ω5 5[ ( / ;5 Μ. + = 5 > ? 一 & 9 9
图 ;≅ ; 一 ΜΒ ? Α 法测 ;ϑ ≅ 亚基分子1
Ξ 2Ε Χ Υ ( #5 5 ) #+ ∗ Ν 5 2Ε . ∗ = 5 1 5 ∗ Δ 2/ + 1 2( / ( Ζ 1 . 5 6 ) Ψ ) / 21
( Ζ < #+ 6 Δ + 6∀∃≅ Ζ∗ ( Δ #5 5 [ Ψ ⊥ ;≅ ; 一 ΜΒ ? Α
& Χ : 热稳定性
结果 如 图 ! , 可见该酶热 稳定性
强 。 例如 , 在 ! Η 下保温 # . , 只丧失

Λ Π的活力 。 Η ) · Ι / 一; ϑ ≅ 一般热稳
定性较强 , 而 Ξ5 一; ϑ ≅ 和 Υ / 一; ϑ ≅
热稳定性较差 〔’&〕。
7 ℃
弓 ∗
!

, ℃
认一_泌三代、、气
丫
8 Φ ! / 9
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!9Λ979加“
时间 Ο 2Δ 5 ∀/ 、2/ ∃
图 ! 韭菜细胞溶质 9 9 的热稳定性
Ξ
 Χ ! Ρ 5 + 1 6 1+ Ψ 2#21⊥ ( Ζ < #+ 6 / #+ 6∀∃≅ Ζ∗ ( / 2 #5 5 [
& & 武 汉 植 物 学 研 究 第
! 卷
参 考 文 献

邹国林 , 罗时文一种小白菜叶细胞溶质铜锌超氧化物歧 化酶的纯化 和性质研究 Χ 生物化学杂志 ,
 Λ , ∀& ∃ %
Λ &
Σ
Λ 7
& 邹国林 , 罗时文 , 荣俊等 Χ 小白菜叶绿体铜锌超氧化物歧化酶的纯化和某些性 质研究 Χ 生物 化学与生物物理学报 ,

Λ  , &
∀
∃ %
Σ
8 邹国林 , 罗时文 , 裘名宜等 Χ 小白菜线粒体锰超氧化物歧化酶的纯化和性质研 究 Χ 生物化学 与生物物理学报 ,
  & Χ
& 7 ∀& ∃ %
Λ 9 Σ
Λ 8
7 ; 1 5 Ν + ∗ 1 4 Η , 05 Ν #5⊥ ∋ ≅ Χ Ω 2< 2= <5 ∗ ( > 2= + ∗ 2( / + 6 6 ( 5 2+ ∗ 5 = Ν 21 . + 5 5 5Ω5 ∗ + 15 = + Ε 2/ Ε ( Ζ 6 ( ⊥ Ψ 5 + / + > 5 、Χ Μ #+ , % ∗ Μ的6 % 9
Χ

 Λ 9 , ! % & 7 Σ & 7 Λ
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5 1 . ( = Ζ( ∗ 1 . 5 ⎯ ) + / ∗2∗ + 1 2( / ( Ζ / 225 ∗( Ε ∗ + Δ ⎯ ) + / 1 2125 6 ( Ζ < ∗ ( 1 5 2/ ) 1 2#2α 2/ Ε ∗. 5
< ∗ 2/ 5 2< #5 ( Ζ < ∗ ( 1 5 2/ 一 = ⊥ 5 Ψ 2/ = 2/ Ε Χ Β , % ) # 0 2优. ( / 卜 & : ! Χ : & % & 7 一 & 7
! 05 + ) 5. + Δ < Η , Ξ ∗ 2= ( ∴ 25. #Χ ; ) < 5 ∗( > 2= 5 = 26 / #) 1+ 6 5 % 2/
< ∗ ( ∴ 5 = + 6 + ⊥ 6 + / = + / + 6 6 + ⊥ + < < #25 + Ψ #5 1 ( + 5 ∗ ⊥ #+ /
2=5 Ε 5 # Χ Β , 一) #
0 2配. 5 / 2 ,
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Χ 7 7 % & : ! Σ & Λ :
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 ! 7 , 
% & & &一
& 8 8
Λ 赵永芳 Χ 生物化学技术原理 及其应用 Χ 武 汉 % 武汉大学出版社 Χ
 Λ Χ 8 78 一 8 7 !
 赵永芳 Χ 生物化学技术原理 及其应 用 Χ 武汉 % 武汉大学出版社 Χ
 Λ Χ ! Σ !

9 张 尔贤 , 陈杰 , 顾伟文等 Χ 乌梅果超氧化物歧化酶的纯化和部分性质研究 Χ 中国药学杂志 Χ

, & !∀ : ∃ % 79 7 一 7 9!

邹国林 Χ 对 ;∀ ∃≅ 研究中若干问题的看法 Χ 中国生化药物 杂志 Χ
  Χ #!∀ 7 ∃ %
Λ! Σ
Λ 

& 邹国林 , 裘名宜 , 朱彤 Χ 超氧化物歧化酶研究的历史 、现状 及应用前景 Χ 氨墓酸 杂烹 ,
 
Χ
8 ∀8 ∃ , &Λ 一8&
Μ Φ 4 ΩΞΩΗ Β Ο Ωϑ Κ Β Κ ≅ Μ4 ϑ Μ Α 4 Ο ΩΑ ; ϑ Ξ
; Φ Μ Α 4 ϑ β Ω≅ Α ≅ Ω;Υ Φ Ο Β ; Α ΩΚ Θ Α Α Τ Μ Θ Β ;Υ Β
Ι . + 2 χ 2. ) + Ι ( ) ? ) ( #2/ χ + / Ε β 2( / Ε
∀肠Μ+ ∗1 , , % 。, , ∗可 0 2‘、. ‘, / % 26 ∗即 ) , , = 0 ] ‘∃Μ .〕、% ‘ Χ Ν ) . + , , 乙α , , ] % ·‘, ∗ , %妙 − ) ##+ / 决 9 9 : & ∃
Β Ψ 6 1 ∗ + 3 1 Β 6 ) < 5 ∗ ( > 2= 5 = 26 Δ ) 1 + 6 5 Ζ∗( Δ #5 5 [ < #+ 6 Δ + . + 6 Ψ 5 5 / < ) ∗ 2Ζ25 = 1 ( .( Δ ( Ε 5 / 5 2∗⊥
Ψ⊥ + Δ Δ ( / 2) Δ 6 ) #Ζ+ 1 5 Ζ∗+ 5 1 2( / + 12( / , ; 5 < .+ = 5 > ? 一 & 9 9 Ε 5 # Ζ2#1 ∗ + 1 2( / + / = ≅ Α Β Α 一;5 < . + 5 5 #
5 .∗ ( Δ + 1 ( Ε ∗ + < . ⊥ Χ & Χ 7 Δ Ε < ) ∗ 2Ζ25 = 5 / α ⊥Δ 5 Ν + 6 ( Ψ 1+ 2/ 5 = Ζ∗ ( Δ 9 9  #5 + ∴ 5 6 Χ Ο .5 6 < 5 5 2Ζ25
+ 5 ∗ 2∴ 21 ⊥ ( Ζ 1 .5 < ) ∗ 2Ζ25 = 5 / α ⊥Δ 5

8 ϑϑϑ Φ Γ Δ Ε < ∗ ( 15 2/ Χ Ο . 5 5 / α ⊥Δ 5
5 ( < < 5 ∗ Γ α 2/ 5 6 ) < 5 ∗ _
( > 2= 5 = 26 Δ ) 1+ 6 5 + 6 + 6 6 + ⊥5 = Ψ⊥ 21 6 6 5 / 6 21 2∴ 21 ⊥ 1 ( 2/ .2Ψ 2∗( ∗ 6 % Τ Η Κ + / = Ρ Ιϑ & Χ Ο .5 Δ ( #5 5 ) #+ ∗
Ν 5 2Ε .1 ( Ζ 1. 5 5 / α ⊥ Δ 5
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12( / , 1. + 1 ( Ζ 1 . 5 5 / α ⊥Δ 5 6 ) Ψ ) / 21
+ Ψ ( ) ∗
 9 9 = + #1 ( / 6 + 6 ∗5 6 ∗5 = Ψ⊥ 6 ( = 2) Δ = ( = 5 5 ⊥# 6 ) #_
< .+ 1 5 一< ( #⊥ + 5 ∗ ⊥ #+ Δ 2∀#5 Ε 5 # 5 #5 5 1 ∗ ( < . ( ∗ 5 6 26 Χ Ο .5 Κ 一 1 5 ∗ Δ 2/ + # ( Ζ 1. 5 5 / α ⊥Δ 5
+ #+ / 2/ 5 + 6
1 5 6 1 5 = Ψ ⊥ = + / 6 ⊥# 5. #( ∗ 2〔#5 Χ ,# ’δ% 5 5 / α ⊥Δ 5 5 > . 2Ψ 2∗6 ( / 5 + Ψ 6 ( ∗ < 1 2( / Δ + > 2Δ ) Δ 2/ 1. 5 ) 2∗ ∗ + ∴ 2( _
#5 1 + 1 & ! 9 / Δ + / = + / ( 1 δ% 5 ∗ 2/ 1 .5 ∴ 26 2Ψ #5 ∗ 5 Ε 2( / + 1 ! Λ 9 / Δ Χ Ο . 5 ∗ 5 6 ) #1 ( Ζ 5 > < 5 ∗ 2Δ 5 / 1 6
6 . ( Ν 6 1 . + 1 1 . 5 5 / α ⊥Δ 5 . + 6 Ε ( ( = #、5 + 1 6 1+ Ψ 2#21⊥ Χ
Τ 5 ⊥ Ν ( ∗ = 6 ; ) < 5 ∗ ( > 2= 5 = 26 Δ ) 1 + 6 5 , Μ ) ∗ 2Ζ25 + 1 2( / , Μ ∗ ( < 5 ∗ 125 6 , Θ 5 5 [ < #+ 6 Δ +