全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(7): 1200−1205 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2011CB100203)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 刘耀光, E-mail: ygliu@scau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: wocooo@163.com
Received(收稿日期): 2012-10-09; Accepted(接受日期): 2013-01-15; Published online(网络出版日期): 2013-03-22.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130322.1737.007.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01200
高通量 PCR模板植物基因组 DNA制备方法
王慧娜 初志战 马兴亮 李日清 刘耀光*
亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室 / 华南农业大学生命科学学院, 广东广州 510642
摘 要: 制备大量生物样品的模板 DNA 用于 PCR 检测是费时费工的工作。本文介绍一种快速高通量的植物基因组
DNA (gDNA)制备及其用于 PCR基因型检测的操作方法。将一小段单子叶植物苗叶片(与 96方孔板的孔深大致相同)
或一小块(约 2~5 mg)双子叶植物叶片放入 96方孔板的各孔中、放入一粒直径 4 mm或 3 mm的合金珠和 150 µL制备
缓冲液, 盖上硅橡胶盖, 在涡旋器或震动研磨器震动 2~4 min破碎组织。此方法获得的粗制 gDNA样品浓度约 2~4 ng
µL−1。用 96针复制器或多通道移液器转移约 0.5~1.0 µL的 gDNA溶液到 96孔 PCR板的反应液中, 利用各种类型的
PCR标记(简单序列重复 SSR, 插入缺失 InDel等)进行基因型检测。此方法制备的 gDNA模板也适合于较大 DNA片
段(>1 kb)的扩增。本方法的关键是控制好在一定溶液量中破碎合适量的叶片, 以及不要加入过量的 gDNA 溶液, 以
免带入过多的杂质抑制 PCR 效果。这种从材料种植、制备 gDNA、转移样品 gDNA, 到 PCR 都是 96 格式化操作的
快速、高通量、低成本的方法特别适合大量植物样品的规模化基因型检测。
关键词: 基因组 DNA制备; PCR; 基因分型
A High Through-Put Protocol of Plant Genomic DNA Preparation for PCR
WANG Hui-Na, CHU Zhi-Zhan, MA Xing-Liang, LI Ri-Qing, and LIU Yao-Guang*
State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources / College of Life Sciences, South China Agricultural Univer-
sity, Guangzhou 510642, China
Abstract: Preparation of large numbers of plant genomic DNA (gDNA) samples for PCR in basic researches and molecular
breeding in crops is a time-consuming and laborious work. In this study, we developed a protocol for rapid and high through-put
preparation of plant gDNA for PCR. A piece (about 30 or 40 mm in length, the same as the depth of the used 96-deep well plates)
of rice (or other monocot plants) seedling leaf, or about 2–4 mg of dicot plant leaf tissue, was put into each well of 96-deep well
plates. After adding a tungsten bead (diameter 4 mm or 3 mm) and 150 μL buffer [10 mmol L−1 Tris (pH 9.5), 0.5 mmol L−1 EDTA,
100 mmol L−1 KCl] in each well, the plates were sealed with silicon rubber caps, and vigorously shaken with a vortex shaker for
3–5 min, followed by a brief centrifugation for a few seconds. For the pieces of monocot seedling leaves (30 or 40 mm in length),
only the bottom parts (about 8 mm, 2–4 mg) could be broken by the tungsten beads. Small amounts (0.5–1.0 μL each) of the crude
gDNA solutions containing about 2–3 ng gDNA μL−1 were directly transferred with a 96-pin replicator (or a multiple-channel
pipetter) to 96-well PCR plates containing PCR solution (15–20 μL each well) for various types of PCR markers, such as Simple
Sequence Repeat (SSR) and Insertion Deletion (InDel). Our tests showed that too large amounts (2 μL or more) or too high con-
centration (>10 mg broken tissue in 150 μL solution) of the gDNA in PCR could suppress the amplification reaction, due to the
carrying-in of higher levels of inhibitory materials from the crude gDNA solution. Therefore, it is important to control a suitable
ratio of the amount of broken plant to the volume of tissue/preparation solution (ca. 2–5 mg, but no more than 10 mg in 150 μL
solution). The PCR amplifications with the template gDNAs prepared by this protocol are reliable for amplification of PCR mark-
ers and relatively large (>1 kb) DNA. This 96-formated high through-put/low-cost method is especially suitable for genotyping
large numbers of plant samples.
Keywords: Genomic DNA preparation; PCR; Genotyping
第 7期 王慧娜等: 高通量的 PCR模板植物基因组 DNA制备方法 1201


基于 PCR 的 DNA 检测技术已在如基因定位、
亲缘关系的分析、分子标记辅助育种、转基因植株
检测、以及种子纯度鉴定等基础和应用研究领域广
泛利用。在大规模基于 PCR 的基因型检测操作中,
模板 DNA 制备是一个影响工作效率的最重要因素
之一。多年来, 人们一直致力于对 DNA 抽提方法
的探讨, 并先后报道了一些相关的方法或简易制备
法[1-5]。但需多步骤操作, 且使用微量离心管, 达不
到高通量的要求, 样品间 DNA 浓度差异大, 重现性
也不理想。本文介绍一种从种苗制备基因组 DNA
(gDNA)模板、到转移模板 DNA溶液至 PCR反应液
全程都采用 96 格式化高通量模板 DNA 制备的操作
方法。该法不需纯化和乙醇沉淀 DNA, 因而操作简
单快速 , 同时还适合于从干燥植物叶片制备模板
DNA。所制备的模板 DNA 不仅可用于大规模分子
标记(简单序列重复/微卫星 SSR, 插入缺失 InDel,
酶切扩增多态序列 CAPS 等)的基因型检测, 大大提
高基因型分析的效率, 也可用于较大 DNA 片段(>1
kb)的扩增。
1 材料与方法
1.1 器具和试剂
(1) 96方孔板(2.2 mL或 1.6 mL容积)及其配套
硅橡胶盖(建议使用国产品以降低成本)。
(2) 96 针复制器(广州方统生物科技有限公司;
或可自制, 见附录 I)。
(3) 国产硬质钨合金珠（直径 4 mm, 方统生物
科技有限公司 ); 或进口钨合金珠 (直径 3 mm,
Qiagen)。
(4) 普通涡旋器(其林贝尔 QL-861), 或 MTM-96
震动研磨器(方统生物科技有限公司)。
(5) 8通道或 12通道移液器。
(6) 96孔 PCR板(国产)。
(7) 其他 PCR 扩增仪器和试剂及其电泳检测
设备。
(8) 10×制备缓冲母液: 100 mmol L−1 Tris (pH
9.5), 5 mmol L−1 EDTA, 1 mol L−1 KCl; 1×制备缓冲
溶液: 使用前将母液稀释 10倍。
(9) 普通 Taq酶(上海申能博彩公司产品)及其他
PCR试剂。
(10) 其他常用试剂。
1.2 植物材料
(1) 水稻秧苗。将 1.6-mL 96方孔板底部用 6 mm
电钻头打穿, 或将旧 96 孔 PCR 板的底部剪去约 4
mm。使用时将方孔板压入少量泥巴。每孔放入 1粒
萌动的水稻种子, 在自然日光下(或人工气候箱)生
长至 3~4片叶。其他植物小苗也可用类似方法种植。
(2) 水稻大植株的鲜叶片或干燥叶片。
(3) 其他单子叶和双子叶植物的鲜叶片或干燥
叶片。
1.3 操作方法
1.3.1 鲜叶片基因组模板 DNA的制备
(1) 用手摘取水稻秧苗叶一小段(对大植株的叶
片, 避开主叶脉撕取约 3 mm 宽的一小段), 放入
2.2-mL或 1.6-mL的 96方孔板的孔中(孔深分别为 42
mm和 27 mm), 叶片长度与方孔板深度大致相同。
对其他单子叶植物叶片的操作与对水稻相同, 双子
叶植物叶片量为 2~5 mg (初次操作用分析天平称几
个样品, 日常操作以经验目测即可)。
放入的水稻叶片顶端与 96 方孔板孔口差不多
齐平, 这样的好处是震动打叶片过程中叶片顶端被
盖压着不会往上跳, 而下部约 3~10 mm部位(约 2~3
mg)才能被打碎(震动时珠子只在孔下部作用)。也可
以只摘一段约 6~10 mm (2~5 mg)叶片段放入孔中。
不要将叶片摘成多个小段放入一个孔中, 这样不仅
费时, 还造成过量打碎叶片而抑制 PCR (见结果与
分析)。
与 1.6-mL方孔板相比, 使用 2.2-mL方孔板时溶
液不易弹到盖子上, 可减少交叉污染的机会。也可
用 96孔 PCR板, 但容易卡住合金珠。
(2) 每个孔投入 1粒合金珠(4 mm合金珠效果较
好)。普通钢珠的比重较小破碎效果差, 且用过的钢
珠会生铁锈, 铁锈会抑制 Taq 酶活性, 因此不推荐
使用普通钢珠。用多通道移液器在每孔加入 150 µL
1×制备缓冲液, 也可以用 0.5 × TE 或去离子水, 但
对 gDNA 的保存效果不如用缓冲液好。盖好硅橡胶
盖, 或可铺上 1张保鲜膜再盖硅胶盖。
(3) 用涡旋器震动 2~4 min, 或在 MTM-96 研
磨器(设强度为中上) 震动 1~2 min (小苗叶片)或
2~3 min (老叶片)。如果是放入一段约 6~10 mm的
叶片, 会有叶片粘在孔壁上部而打不着, 因此期间
要在桌面拍打 96孔板几次, 使叶片落回底部。从底
部往上看, 可见溶液变浅绿色。
用吊篮转子离心机离心约 10 s (可省略)。制备
的 gDNA溶液直接用作 PCR模板(见 1.3.3)。
1.3.2 干叶片基因组模板 DNA的制备
(1) 用剪刀将干叶片剪成约 2~3 mm小段, 放约
1202 作 物 学 报 第 39卷

2~4 mg到 96方孔板的孔中(初次操作用分析天平称
几份样品, 日常操作以经验目测即可)。
(2) 每个孔投入 1 粒合金珠(直径 4 mm), 盖好
硅橡胶盖。放入液氮箱冻几分钟。
(3) 用涡旋器(或 MTM-96 震动研磨器) 震动约
2~3 min。放入有液氮的盒子内冻约 30 s, 再震动约
2 min。
(4) 离心约 30 s, 使粘在壁和盖上的叶片粉末
落回底部。
(5) 打开盖子, 用多通道移液器加入 150 µL 1×
制备缓冲溶液, 盖好硅橡胶盖。
(6) 用涡旋器(或 MTM-96 研磨器) 震动 3~5
min。
(7) 将 96方孔板置约 90℃水浴加热约 5 min。
离心约 1 min。
1.3.3 PCR反应
(1) 对每块 96孔 PCR板, 配制 PCR液 1600 µL,
含上海申能博彩公司产 Taq酶 45 U (每 35 µL反应液
为 1 U), 100~150 µmol L−1 dNTPs, PCR 引物各约
0.25 µmol L−1。如果 2个标记的产物长度不重叠, 可
以在同一个反应里做 2个标记的扩增(图 3-C)。用多
通道移液器往 96孔 PCR板每孔分入 15 µL。扩增较
大片段 DNA (>1 kb)时, 反应体积为 20~25 µL, 含
0.8~1.0 U Taq酶。
(2) 用 96 针复制器沾取约 0.5~1.0 µL 上述的
gDNA 溶液转移到 PCR 反应液。用过的 96 针复制器
要马上泡在水中及时清洗。也可用多通道移液器加约
1 µL模板 DNA, 但不要加入超过 1.5 µL gDNA溶液,
以免降低 PCR的效率。
(3) 如果需要保存模板 DNA 溶液一段时间, 用
强磁铁吸出合金珠, 将样品放在−20℃保存备用。
(4) 根据引物(18~22 nt)的具体情况和扩增片段
的长度设定合适的 PCR 条件 (设预变性 95℃ 1
min)。一般分子标记引物的扩增用 32~35循环。按常
规的聚丙酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物。
(5) 将用过的 96方孔板洗干净, 可多次重复使用。
在检测共显性基因型 (即长度多态 )标记的
gDNA样品中混入少于 1/50量的另一种基因型DNA
样品为模板进行测试, 表明不会影响 PCR 产物的目
的基因型的正确检测(结果未显示)。而用过的 96 孔
板的残留 gDNA量在新配制的 gDNA中的比例远远
低于 1/100, 因此不必担心重复使用 96 方孔板和 96
针复制器残留痕量基因组 DNA 的污染对后续试验的
影响。但对于检测阳性/阴性样品的标记(即 PCR 产物
的有、无, 如转基因的有、无), 在阴性的样品 DNA中
污染痕量的阳性样品就可能产生 PCR假阳性, 因此对
这类标记不宜重复使用制备过 gDNA的 96孔板。
2 结果与分析
2.1 对制备 gDNA浓度的测定
本方法制备的植物 gDNA 溶液未经纯化, 含有
RNA、蛋白质和叶绿素等杂质, 因此不能用分光光
度计测定其浓度。将制备的 gDNA 在琼脂糖凝胶上
电泳也由于 DNA 浓度低且呈涂抹状而难以估计其
浓度(结果未显示)。为了较准确测定该浓度, 将纯化
定量的籼稻品种 93-11的 gDNA梯度系列(0.5~8.0 ng)
作为内参和本方法制备的 1 µL 粳稻(02428) gDNA
混合, 用 1个 InDel标记引物(表 1)进行 PCR扩增和
PAGE检测。结果表明, 4个测试样品(每个样品 2~3
mg 叶片, 加入 150 µL 溶液)制备的 gDNA 浓度为
2~3 ng µL−1(图 1)。


图 1 用 InDel标记 PCR估算所制备的水稻基因组 DNA浓度
Fig. 1 Estimation of concentrations of the prepared rice genomic DNA samples by PCR with an InDel marker
将纯化定量的水稻品种(93-11)基因组 DNA标准样品(0.5~8.0 ng)与 1.0 µL本方法制备的水稻品种(02428)基因组 DNA混合作为模
板, 用 InDel标记引物(表 1)进行 PCR扩增和 PAGE检测。箭头指某反应(或 2个反应之间)其 02428与 93-11条带的信号值大致相等(即
DNA等量点), 表明 02428基因组 DNA量与相应的标准 DNA相当。
Different amounts (0.5–8.0 ng) of standard genomic DNA from a rice variety (93-11) were mixed with 1 µL genomic DNA from another variety
(02428), and used as the template for PCR with primers (Table 1) of an InDel marker. Arrows show the band intensities in the reactions (or between
two reactions) of 02428 and 93-11 were similar, indicating that the amounts of 02428 gDNA were about the same as those of indicated standards.


第 7期 王慧娜等: 高通量的 PCR模板植物基因组 DNA制备方法 1203


表 1 本研究所用的 PCR引物
Table 1 Primers used in this study
引物编号
Primer No.
序列
Sequence (5–3)
对应的图
Corresponding figure
1 F: TGTGTGCTTTCGCTGAAGAGA; R: TGTGCTCAGCCATAGGGTGTGTT 图 1 Fig. 1
2 F: CGACATGTTGGCTATAAGG; R: ACCGGCCAATATTCCTTTG 图 2-A~C, E, F Fig. 2-A, B, C, E, F
3 F: ATGGTACTACACACGTTTGT; R: GAAACTCATACCTTACTTCA 图 2-D (左) Fig. 2-D (left)
4 F: TGCTCATCCTGCAGCTTCTTC; R: CGATCGGTTATTAACTCTTCCAT 图 2-D (右) Fig. 2-D (right)
5 F: GAAACTGATCAGTTGCTTTCAC; R: CTGCTACACAATCTCGTTATGGAG 图 2-G (上) Fig. 2-G (up)
6 F: GAGGTAGAAACCCACCCTAAA; R: CTGCTACACAATCTCGTTATGGAG 图 2-G (下) Fig. 2-G (down)
7 F: CCCTTACGTGCAGTACATTG; R: ATGCAGGCTACTTACTAGCG 图 3-A Fig. 3 A
8 F: TCCTCCCTCTGTACCATTTG; R: ACGCCAAGAAAGTCATATGG 图 3-B Fig. 3 B
9 F: TCAACCAGTGAAGGGTCGACG; R: CTCAGTTGTCACGATGTGAACG 图 3-C (M1) Fig. 3-C (M1)
10 F: GCGGTTGTGAAAGGCTAATCC; R: AAGCAGCAGGAAATGGGAGTG 图 3-C (M2) Fig. 3-C (M2)

2.2 加入不同量模板 DNA的 PCR效果
在一定量溶液中放入过多此方法制备的 gDNA
会带入过量的杂质, 因而会抑制 PCR 反应。我们的
结果显示, 用 2~3 mg叶片(150 µL)制备的模板(加入
1 µL)的 PCR效果(扩增 830 bp片段)比用 10~12 mg
叶片(150 µL溶液)制备的模板的扩增效果好(图 2-A,
B)。进一步检测加入不同容量 gDNA (用 3 mg叶片
150 µL−1溶液制备)的 PCR效果表明, 20 µL PCR反
应中加入上述方法制备的 DNA 0.5~1.0 µL的扩增效
果比加入 2 µL的效果好; 加入 1 µL DNA和 1 µL TE
(含有 1 mmol L−1 EDTA)的扩增效果更差。说明即使
控制好合适的叶片量和溶液的比例, 加入过量 DNA
溶液也因带入过多的杂质和 EDTA (制备液含有
EDTA)而抑制 PCR 反应。因此, 本方法的关键是要
控制适合的叶片量和溶液的比例, 同时加入的 DNA
溶液量不要超过 PCR反应液的 1/10。事实上, gDNA
溶液使用量少至 0.1~0.2 µL (约 0.2~0.4 ng)就足以产
生良好的 PCR扩增效果(图 2-D), 说明模板 DNA量
(指低量)不是一个限制性因素, 而样品间叶片破碎
量的差异有相当大的允许范围。虽然可以放入较多
的叶片制备较高浓度的 gDNA 并稀释使用也可避免
PCR 抑制, 但从操作的简单化和效率化考虑, 最好
直接确定一个合适的叶片量与溶液的比例范围, 以
减少操作步骤。我们在实际操作中只摘取 1 段长度
与 96孔板深度相当的叶片放入各孔中, 由于只有下
端约 3~10 mm部分才能被合金珠打碎, 因此不会产
生破碎叶片量与溶液比值过高的问题。用本方法也
可从干燥叶片制备模板 DNA做 PCR (同样要注意控
制投入的叶片量不能过多, 图 3-E, F), 适合于对野
外采集和干燥保存的植物样本的检测。用用本方法
制备其他植物如拟南芥的 gDNA做 PCR也产生良好
的效果(图 2-G)。

图 2 用本方法制备的植物 gDNA的 PCR扩增效果
Fig. 2 PCR effects using the prepared gDNA templates
A, B: 分别从约 2~3 mg水稻苗鲜叶片 150 µL−1缓冲液和约 10 mg水
稻苗鲜叶片 150 µL−1缓冲液制备的DNA, 取 1.0 µL gDNA为模板进
行PCR扩增。 C: 从3 mg水稻苗叶片 150 µL−1缓冲液制备的gDNA
取不同量为模板进行 PCR (20 µL反应)。D: 用递减的不同量 gDNA
(2~3 mg水稻苗鲜叶片 150 µL−1缓冲液) 进行 PCR标记(InDel)的扩
增。E, F: 分别从 2~3 mg水稻干燥叶片 150 µL−1缓冲液和约 10 mg
水稻干燥叶片 150 µL−1缓冲液制备的 DNA, 取 1.0 µL为模板进行
PCR扩增。 G: 从约 2~3 mg拟南芥鲜叶片 150 µL−1缓冲液制备
gDNA, 取 1.0 µL为模板进行 PCR扩增。A~C, E~G反应为 20 µL
PCR反应, 含有 0.8 U Taq酶。PCR条件为 95 2 min, 33 ℃ 循环的
94 30 s, 56 30 s, 72 1.5 min℃ ℃ ℃ 。D的 PCR条件与图 3相同。
A, B: PCR using 1.0 µL rice gDNA prepared from 2–3 mg and 10 mg
of seedling leaf tissue in 150 µL preparation buffer, respectively. C:
Using different volumes of rice gDNA prepared from 3 mg seedling
leaf tissue in 150 µL preparation buffer as PCR template. D: Use of
decreased amounts of gDNA (from 2–3 mg seedling leaf in 150 µL
preparation buffer) for performing PCR with InDel markers. E, F: PCR
using 1.0 µL rice gDNA prepared from 2–3 mg and 10 mg of dried leaf
tissue in 150 µL preparation buffer, respectively. G: PCR using 1.0 µL
Arabidopsis thaliana gDNA prepared from 2–3 mg fresh leaf tissue in
150 µL preparation buffer. A–C, E–G were conducted in 20 µL PCRs
containing 0.8 U Taq, with thermal conditions of 95 2 min, 33 cycles ℃
of 94 30 s, 56 30 s, 72 1.5 min℃ ℃ ℃ . PCR setting and thermal condi-
tions in D were the same as those in Fig. 3.
1204 作 物 学 报 第 39卷

2.3 高通量的分子标记检测
本方法制备的 DNA 浓度虽然低, 用 96 针复制
器加入 0.5~1.0 µL模板进行 32~35个 PCR循环就可
获得足够浓度的产物, 并不需要增加 Taq酶使用量。
我们甚至使用每 45~50 µL PCR反应液 1 U Taq酶也
能扩增分子标记(结果未显示)。我们用本方法对水稻
样品进行的分子标记(SSR、InDel 等)检测, 成功率
一般可达 95%以上。事实上, 用微量提取法(经乙醇
沉淀)粗提的gDNA往往由于样品间浓度差别大, 定量
不准确, 容易加入过多的模板DNA而抑制 PCR, 因而
用微量提取法制备gDNA进行PCR标记扩增的成功率
和整齐度反而不如本方法好。图 3显示若干 PCR标记
的实验例, 扩增效果和整齐性好。另外, 还可以在同一
个反应里做 2个标记的 PCR扩增(图 3-C)。


图 3 用本方法制备的水稻幼苗 gDNA为模板的 PCR标记分型检测
Fig. 3 PCR marker-based genotyping using the prepared rice seedling gDNAs as templates
A: 用 SSR标记对水稻种质材料进行基因型检测。B, C: 用 InDel标记对水稻分离群体进行基因型检测。
2个 InDel标记(M1, M2)在同一 PCR反应进行基因型检测(C)。所有 PCR反应是用 96针复制器加入 gDNA约 0.5 µL,
PCR条件为 95℃ 2 min, 35循环的 94℃ 30 s, 56℃ 30 s,72℃ 30 s.
A: Genotyping of rice germplasms with a SSR marker. B, C: Genotyping of rice segregation populations with InDel markers.
Two markers (M1, M2) were analyzed in the same PCRs (C).

3 讨论
已报道的各种植物 gDNA 简易制备方法大都是
用微量离心管对每个样品进行编号、组织破碎、抽
提、沉淀、干燥、溶解、定量多步骤操作, 效率低。
本文的方法全过程采用 96 格式化操作 , 基因组
DNA 制备过程中不需要分别对每个样品进行标签
和操作, 非常简便快捷, 通量高, 且成本很低。叶片
采集放入 96方孔板后, 从加入制备溶液、震动破碎、
到转移 gDNA模板至 PCR液只需 5~7 min (不算 PCR
液配制时间)。用 96 针复制器不会转移过量的模板
DNA 溶液 , 还节省移液头和移液头装盒的人工成
本。而用多通道移液器取约 1 µL溶液时误差较大。
本方法制备的 gDNA 模板也可以用于高分辨率溶解
曲线(high-revolution melting, HRM) PCR分析[6]。我
们用此方法已制备了 10多万份水稻样品的 gDNA用
于 PCR 基因型分析。本文还介绍了自制 96 针复制
器的方法供参考(附录 I)。
4 结论
本文介绍的 PCR模板植物 gDNA的快速高通量
制备方法操作简单 , 效果好 , 省时省力 , 能大大提
高工作效率, 在基础研究和生物技术育种等领域可
发挥重要作用。
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Chinese with English abstract)





附录 I: 96针复制器制作方法
(1) 将长约 6 m、直径 1.2 mm或 1.5 mm的#304不锈
钢丝(低于#304 的会生锈)拉直(一端固定在柱子上, 把另
一端绑在木棒上, 用力拉几下)。用钢钳剪成每段 45 mm。
用钳夹着钢丝一端, 用钢锉(较细纹的)锉平一端的端口。
(2) 将 3~4 mm厚有机玻璃板裁成 80 mm × 120 mm。
用旧 96孔 PCR板沾上稀释墨水在机玻璃板印上 96个点。
用铁钉在每个点中心敲打出 1 个浅孔(目的是防止钻孔时
移位)。
(3) 对应 1.2 mm或 1.5 mm不锈钢丝, 用稍大直径(如
1.5 mm或 1.8 mm)的电钻头在 96个点垂直打孔。
(4) 用强力胶, 如 A、B 两种胶等量混合后几分钟内
硬化的强力胶, 先将 3 根针粘结在 3 个角的孔中(即 A1,
A12, H1 位置)(没有锉平的一端粘在板上, 锉平端做脚底),
等强力胶固化后, 将第 4 根粘在第 4 个角(即 H12 位置),
在胶固化之前将这个“4 脚桌子”脚向下放在平板上, 上下
微移第 4根针, 使 4根针都接触到平板(即不翘脚)。
(5) 将其余的针(每次同时操作 2~3 根)粘在剩余的小
孔中(锉平端作为脚), 在胶固化之前将针调整到与 2 端的
针同一个平面(针朝下放在平板上, 使每条针都接触到板
面)。
(6) 将 1 块旧 96 孔 PCR 板的管底在沙布(纸)上磨至
快要穿的状态, 然后套在粘好的 96针上, 用力压下 96孔
PCR板使针把管底刺穿。使 96孔 PCR板管底留在针端位
置(以便在下一步骤打磨时固定针端)。
(7) 将复制器半成品的针端平铺在平整桌面上的沙
布(或沙纸)上来回移动打磨, 直至将所有针端磨到同一个
平面。
(8) 在固定 96 针的有机玻璃板上面再粘一块 80 mm
× 120 mm机玻璃板(厚度不限), 上面再粘一个把手, 就完
成了制作。
(9) 检测 96针复制器每针取样量: 往 96孔 PCR板每
孔加入 30~40 µL 制备缓冲液(或水), 用微量分析天平称
重回零; 用 96针复制器沾取 96孔 PCR板的水 1次(或将
针粘取的水分擦干后再重复沾取 2~3次), 再称 96孔 PCR
板已减少的液量, 计算出平均每针每次的取液量。



附图 用不锈钢丝(#304)自制的 96针复制器
Supplementary Figure A home-made 96-pin replicator made from stainless steel wire